La Quantification simultanée des anti-vecteur et Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I tétramère coloration après une Vaccination avec un vecteur Viral
November 28th, 2018
Nous présentons ici un protocole pour l’ex vivo détection qualitative de l’antigène-spécifiques CD8+ T des cellules. L’analyse est possible grâce à des suspensions de cellules simples d’organes ou de petites quantités de sang. Un large éventail d’études exigent l’analyse des réponses des cellules T cytotoxiques (vaccination et études d’immunothérapie du cancer).
Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie des cellules T et de la mise au point de vaccins vecteurs viraux. Le principal avantage de cette méthode est que seules de petites quantités de sang sont nécessaires, ce qui permet des mesures répétées de la même souris. En outre, des LTT spécifiques au virus et aux transgènes peuvent être détectés à partir du même échantillon.
Jasmine Rinnofner, technicienne, et Annika Rossler, étudiante diplômée, démontreront la procédure. Zoltan Banki, post-doc, mesurera et analysera les échantillons. Pour commencer, retenez une souris en toute sécurité selon le protocole de texte.
Recueillir 20 microlitres de sang dans un tube recouvert d’EDTA dans la veine arrière d’une souris. Lorsque vous travaillez avec des splenocytes, isolez la rate et utilisez le piston d’une seringue pour presser le tissu à travers une passoire cellulaire. Après avoir effectué une lyse sur les érythrocytes, comptez les cellules et ajustez la concentration de l’échantillon.
Préparer et étiqueter un tube Facs pour chaque échantillon, et transférer 100 microlitres de suspension d’organe, ou 20 microlitres de sang dans le tube. Lorsque vous travaillez avec des splenocytes, centrifuger la suspension de l’organe pendant cinq minutes, et jeter le supernatant. Ensuite, vortex le tube pour résuspendre la pastille cellulaire.
Pour que chaque canal soit utilisé, préparez également un tube Facs pour un échantillon de compensation. Préparez un échantillon supplémentaire comme un contrôle non taché. Préparer un tube avec des tampons Facs avec des tétramers à leurs dilutions optimales, et vortex à mélanger.
Ensuite, ajouter 50 microlitres de dilution du tétramer à chaque échantillon, et vortex à mélanger. Ajouter le tampon Facs sans tétramers aux contrôles de compensation et à l’échantillon non taché. Ensuite, incubez les échantillons dans des conditions sombres à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes.
Pendant que les échantillons couvent, ajouter le tampon Facs à un tube. Ensuite, ajoutez les anticorps au tampon en fonction des dilutions spécifiées dans le tableau 2 du protocole de texte, et vortex de la solution. En attendant sur la question scientifique sont les combinaisons de marqueurs, en dehors de celui décrit ici, pourrait être utilisé.
Assurez-vous d’inclure toujours des anticorps contre le CD3 et le CD8 dans le panneau. Pour chaque canal, préparer un tube avec 200 microlitres de tampon Facs, et ajouter un microlitres d’une dilution d’anticorps contre CD8 dans leur couleur respective, et vortex à mélanger. Ensuite, stockez les dilutions d’anticorps telles que spécifiées dans le protocole texte.
Pour laver les échantillons, ajouter un mililiter de tampon Facs aux échantillons et à la centrifugeuse. Ensuite, jetez le surnatant et égouttez le reste du liquide avec des serviettes en papier. Lorsque vous travaillez avec du sang, soyez prudent lorsque vous drainez le liquide restant.
Avant la lyse des érythrocytes, le sang ne collera pas au fond du tube. Alternativement, vous pouvez aspirer le surnatant. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de la solution d’anticorps à chaque granule cellulaire, et vortex doucement.
Ajouter 50 microlitres de chaque mélange de compensation au contrôle de compensation correspondant, et 50 microlitres de tampon Facs à la pastille cellulaire du contrôle non taché, et vortex doucement. Lorsque vous travaillez avec des splenocytes, lavez les échantillons après la coloration des anticorps directement avec un à deux millilitres de tampon Facs, et centrifugeuse pendant cinq minutes. Ensuite, jetez le surnatant et égouttez le reste du liquide sur du papier absorbant.
Ajouter 500 microlitres de tampon ACK à chaque échantillon de sang, et vortex doucement. Ensuite, incuber les échantillons dans l’obscurité pendant cinq minutes à température ambiante. Ajouter un millilitre de tampon Facs aux échantillons et centrifugeuse.
Ensuite, jetez le supernatant et égouttez le reste du liquide avec des serviettes en papier. La lyse appropriée des érythrocytes est une étape cruciale pour faciliter la mesure de Facs, par conséquent, quand la pastille est plutôt humide, la lyse répétée des érythrocytes. Lavez les échantillons à nouveau comme décrit précédemment.
Ensuite, jetez le surnatant et égouttez le reste du liquide sur une serviette en papier. Avant la fixation, assurez-vous que les cellules sont bien résuspendées afin d’empêcher la formation de touffes. Ajouter 150 à 300 microlitres de tampon de fixation Facs à chaque tube, et vortex à mélanger.
Ensuite, procédez à la mesure cytométrique de flux aussi rapidement que possible. Tout d’abord, mesurez les contrôles de compensation et corrigez tout chevauchement spectral. Ensuite, installez des barrières séquentielles à sélectionner pour les cellules CD3 positives et CD8 positives.
Porte sur les lymphocytes à l’aide de la zone de dispersion vers l’avant et vers le côté. Puis, dans la population de lymphocytes, porte sur les cellules simples en utilisant la largeur de dispersion vers l’avant par rapport à la zone. Utilisez les canaux CD3 et CD8 pour tracer des lymphocytes unicellulaires.
Identifier les lymphocytes T CD8 positifs, en tétant sur les cellules CD3-positives et CD8-positives. Assurez-vous que les cellules CD8-low sont incluses dans le gating. La propagation sur les cellules CD3/CD8 positives est une étape critique de ce protocole.
Comme l’activation des cellules conduit souvent à une régulation vers le bas de CD3 et / ou CD8, CD3 / CD8-cellules basses devraient également être inclus. Après cela, tracer les cellules CD8-positives par rapport aux cellules tétramer, gating sur les cellules CD8-positive/tétramer-positive. Si possible, enregistrez 20 000 cellules dans la porte CD3-positive et CD8-positive pour chaque échantillon.
Enfin, enregistrez les mesures en tant que fichier FCS. Dans ce protocole, des lymphocytes CD8+T spécifiques aux antigènes ont été quantitativement détectés dans des échantillons de sang et de tissus. Après avoir tétras les cellules CD3-positives et CD8-positives, des cellules tétramer-positives ont été identifiées.
Deux tétramers différents ont été combinés dans le même tube pour la coloration, permettant la quantification simultanée de deux spécificités différentes de CTL. En utilisant ce protocole, les réponses des cellules T d’une même souris peuvent être suivies au fil du temps, car seules de petites quantités de sang sont nécessaires pour chaque mesure. En outre, des phénotypes de CTLs antigène-spécifiques peuvent être analysés.
Tout en essayant cette procédure, il est important d’éviter des temps d’incubation prolongés, car cela peut conduire à l’internalisation des récepteurs des cellules T. Depuis la découverte de la technologie du tétramer, la coloration du tétramer est devenue un outil essentiel pour l’analyse des cellules T, et un large éventail d’applications, y compris l’accumulation de tétramers. Un bel avenir pour les tétramers brillants.
Aperçu
Ce protocole décrit une méthode pour la détection qualitative ex vivo des cellules T CD8+ spécifiques à l'antigène en utilisant de petits échantillons de sang ou des suspensions de cellules uniques provenant d'organes. Il est particulièrement utile dans les études liées aux réponses des cellules T cytotoxiques, telles que la vaccination et l'immunothérapie du cancer.
Composantes clés de l'étude
Domaine de la science
- Immunologie des cellules T
- Immunothérapie du cancer
- Vaccins à vecteur viral
Contexte
- Les cellules T CD8+ spécifiques à l'antigène jouent un rôle crucial dans les réponses immunitaires.
- Les petits échantillons de sang permettent des mesures répétées du même sujet.
- La détection des CTL spécifiques au virus et au transgène peut être effectuée simultanément.
- La technologie des tétramères améliore l'analyse des populations de cellules T.
Objectif de l'étude
- Fournir une méthode fiable pour détecter les cellules T CD8+ spécifiques à l'antigène.
- Faciliter l'étude des réponses des cellules T au fil du temps.
- Permettre la quantification simultanée de différentes spécificités des CTL.
Méthodes utilisées
- Collecte d'échantillons de sang chez les souris et isolation des splénocytes.
- Préparation des échantillons avec des tétramères et des anticorps pour la cytométrie en flux.
- Étapes d'incubation et de lavage pour assurer une coloration et une lyse appropriées.
- Mesure cytométrique en flux pour identifier et quantifier les cellules T CD8-positives.
Résultats principaux
- Détection réussie des cellules T CD8+ spécifiques à l'antigène dans des échantillons de sang et de tissus.
- Identification de cellules CD3-positives et CD8-positives en utilisant la coloration des tétramères.
- Capacité à suivre les réponses des cellules T au fil du temps avec un volume sanguin minimal.
- Analyse simultanée de multiples spécificités des CTL a été réalisée.
Conclusions
- Ce protocole est efficace pour étudier les réponses des cellules T dans divers contextes immunologiques.
- Il permet une analyse détaillée des populations de cellules T spécifiques à l'antigène.
- Les applications futures peuvent étendre l'utilisation de la technologie des tétramères dans la recherche immunologique.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
This protocol enables simultaneous quantification of anti-vector and anti-transgene-specific CD8+ T cells from minimal blood samples, supporting iterative monitoring of immune responses in vaccine development. By allowing repeated measurements from the same animal, it reduces animal usage and increases data density in preclinical immunogenicity studies. The method directly informs go/no-go decisions by de-risking target antigen selection and vector construct efficacy early in the discovery pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying T-cell responses against both vector and transgene antigens in parallel.
- Operational Value: Uses only 20 microliters of blood per measurement, facilitating longitudinal tracking in the same mouse model.
- Predictive Value: Supports predictive confidence in antigen selection by distinguishing immune responses to the antigen of interest from anti-vector immunity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative flow cytometry outputs for antigen-specific CD8+ T-cell frequencies.
- Reproducibility: Includes compensation controls and unstained samples to ensure spectral overlap correction and assay consistency.
- Scalability: Compatible with high-throughput screening of multiple tetramer specificities in a single tube.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links discovery-phase T-cell profiling to preclinical validation by enabling phenotype analysis (e.g., activation status via CD43/CD44/CD62L).
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed immunogenicity stems from the transgene or vector components, informing construct optimization.
- Preclinical Model Relevance: Works with blood or spleen-derived single-cell suspensions, supporting flexible use across anatomical compartments.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, specifically supporting early immune profiling after vaccination and prior to lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling direct ex vivo quantification of antigen-specific TCR engagement without functional stimulation.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative readouts that allow comparison of immune responses across different vaccine constructs.
- Analytics: Provides tetramer-positive cell frequencies as a key metric for comparing conditions and tracking responses over time.
- Translational Research: Connects to preclinical work by permitting phenotypic characterization of antigen-specific CD8+ T cells to assess differentiation state.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable immunological profiling platform applicable across viral vector vaccine and immunotherapy programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by decoupling anti-vector from anti-transgene T-cell responses.
- Operational Value: Ensures standardization through defined tetramer dilutions, antibody panels, and erythrocyte lysis steps.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early identification of immunogenic liabilities or suboptimal antigen expression.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by quantifying immune responses that may compromise vaccine efficacy or safety.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry setup, compensation, and gating strategies for lymphocyte and T-cell subsets.
- Dependent on access to MHC I tetramers specific to viral vector and transgene epitopes, and compatible flow cytometer configuration.
- Necessitates standardized SOPs for blood collection, erythrocyte lysis, and antibody staining to maintain inter-experiment consistency.
- Must account for potential TCR internalization by avoiding prolonged tetramer incubation beyond 20 minutes at 37°C.
- Limited to murine models in the current protocol; adaptation to other species would require validation of cross-reactive reagents.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:49
Sample Collection
1:21
Staining Set-up
1:59
Tetramer Staining and Preparation of Antibodies
3:17
Staining of Samples
4:24
Lysis of Erythrocytes
5:09
Flow Cytometric Measurement and Analysis
6:53
Results: Quantification of Antigen-specific CD8+ T Cells in Mouse Blood of Lymphoid Organs
7:36
Conclusion
