Visualisation de la Structure du tissu adipeux blanc 3D utilisant entier-Montez la souillure

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la biologie adipeuse, telles que la façon dont les interactions intercellulaires et la physiologie des tissus adipeux changent sur différentes conditions métaboliques telles que le jeûne et l’obésité. Le principal avantage de cette technique est qu’elle préserve de façon optimale la structure 3D adipeux d’origine et évite les longues étapes de traitement qui sont habituellement nécessaires pour l’immunohistochimie conventionnelle. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de la structure du tissu adipeux, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes organiques, tels que le système nerveux, en souinant le cerveau à montage entier.

Généralement, les individus nouveaux à cette méthode lutteront en raison des difficultés en obtenant des emplacements de tissu de propriété, trouvant la période appropriée de fixation, et les concentrations optimales d’anticorps. Une fois la dissection terminée, transférer le plat contenant les échantillons de tissus dans 1% de paraformaldéhyde de la glace à température ambiante pendant une heure. Transférez ensuite les tissus dans une plaque de culture cellulaire de 12 ou 24 puits pour un lavage plus rapide.

Il est important de se rappeler que la procédure de coloration de montage entier doit commencer immédiatement après la dissection et qu’il n’y a pas de points de pause entre chaque étape. Lavez les tissus avec PBS-0.3T sur un shaker incliné à 22 degrés avec une vitesse comprise entre 20 et 25 inclinaisons par minute à température ambiante pendant cinq minutes. Répétez ce lavage deux fois de plus.

Après cela, ajouter environ 0,5 à un millilitre de tampon bloquant contenant 5% de sérum animal. Incuber la plaque sur un shaker en utilisant les conditions précédentes pendant une heure. Aspirer la solution de blocage, et ajouter sur millilitre d’anticorps primaires dilués dans PBS-0.3T avec 1% sérum animal à chaque puits.

Incuber la plaque pendant la nuit sur un shaker à quatre degrés Celsius avec une inclinaison de 22 degrés et une vitesse de 20 à 25 inclinaisons par minute. Le lendemain, utilisez PBS-0.3T pour laver les tissus à température ambiante pendant cinq minutes. Répétez ce lavage deux fois de plus.

Ajoutez ensuite entre 0,5 et un millilitre de solutions d’anticorps secondaires appropriées et diluées à chaque puits. Envelopper la plaque dans du papier d’aluminium et l’incuber sur un shaker à température ambiante pendant une heure. Après cela, laver la plaque deux fois avec PBS-0.3T à température ambiante pendant cinq minutes par lavage.

Si la visualisation des gouttelettes liquides est nécessaire pendant la tache lipidique neutre, lavez-la deux fois avec 1x PBS avec chaque lavage d’une durée de cinq minutes. Ajouter la tache lipidique neutre diluée dans PBS, et incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Pour commencer l’imagerie, utilisez des forceps pour poser le tissu à plat sur un glissement de couverture en verre de 24 x 60 millimètres.

Si les noyaux souillant avec DAPI sont désirés, ajoutez une à deux gouttes d’un milieu de montage qui contient dapi pour submerger complètement le tissu et l’empêcher de sécher. Ensuite, placez la diapositive sur un système de microscope laser confocal inversé. Pour obtenir des images de tissus tachés de montage entier à plusieurs plans focaux, effectuez des piles Z de 100 à 150 micromètres de profondeur avec une taille d’étape de quatre à six micromètres au grossissement désiré.

Dans cette étude, la coloration de montage entier est utilisée pour préserver l’architecture des tissus adipeux. Contrairement aux méthodes qui impliquent plusieurs étapes de traitement et de sectionnement, qui peuvent conduire à la défiguration de la morphologie des tissus adipeux, la méthode de coloration de montage entier peut préserver la morphologie des adipocytes, assurant l’exactitude lors de l’interprétation des résultats. La surfixation du tissu adipeux conduit à la fluorescence induite par le fixatif, qui peut être indiquée par le chevauchement de régions identiques, comme dans les signaux de tyrosine hydroxylase et PECAM-1 observés ici.

Toutefois, des échantillons de taches bien fixés et à montage entier montrent des signaux distincts et distincts, ce qui indique que ces signaux ne sont pas de l’autofluorescence. L’imagerie du tissu adipeux taché de montage entier permet la quantification des changements morphologiques dans différentes conditions expérimentales. En particulier, le tissu adipeux est fortement vascularisé, ce qui est important dans la médiation de l’homéostasie métabolique lors des changements rapides du niveau d’énergie.

Par exemple, les souris 6J noires C57, qui subissent 24 heures de jeûne, affichent une taille d’adipocyte significativement plus petite, ce qui indique la lipolyse, et une tendance à la densité élevée des vaisseaux sanguins par rapport aux souris nourries en continu. L’élimination des tissus adipeux avec iDISCO+permet aux tissus adipeux de devenir optiquement transparents. L’immunolabeling du tissu adipeux qui est passé par le dégagement de tissu montre l’arborisation neuronale beaucoup plus dense comparée à celle observée dans la coloration de montage entier sans compensation de tissu au même grossissement.

Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de ne pas surfixer vos échantillons pendant plus d’une heure à température ambiante dans PFA, sinon, cela augmentera l’autofluorescence de fond. Toutefois, cette période de fixation peut être prolongée si les échantillons sont fixés à quatre degrés Celsius. Après cette procédure, d’autres méthodes comme la quantification à l’aide d’ImageJ, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la façon dont l’architecture cellulaire, comme les sites d’adipocytes et la densité des vaisseaux sanguins, change en réponse à diverses conditions physiologiques.