Évaluation de l'interaction entre le complément protéique C1q et l'acide hyaluronique dans la promotion de l'adhérence cellulaire
15 juin 2019
Le composant de complément C1q est une molécule pro-inflammatoire fortement exprimée dans le microenvironnement de tissu qui peut interagir avec la matrice extracellulaire. Ici, nous décrivons une méthode pour tester comment C1q lié à l'acide hyaluronique affecte l'adhérence cellulaire.
Une procédure complète pour évaluer l’interaction entre la protéine complémentaire C1q et l’acide hyaluronique dans la promotion de l’adhérence cellulaire. Nous avons récemment défini que le composant de complément C1q une molécule du système immunitaire inné est fortement exprimée dans le microenvironnement de tumeur et de placenta et est capable d’interagir avec la composante de la matrice extracellulaire. Dans ce cas, l’acide hyaluronique.
Nous proposons une méthode pour étudier les fonctions biologiques des protéines dans tout l’environnement écronomic. Afin d’étudier la capacité de ces molécules à façonner les propriétés de division cellulaire des facteurs de matrice extracellulaire. Afin d’étudier comment cette interaction peut être détectée par les cellules présentes dans le tissu de l’environnement, nous avons mis en place cette méthode facile dans laquelle les cellules binaires dérivées des tissus humains ont été autorisés à adhérer à C1q lié à la matrice extracellulaire, dans ce cas l’acide hyaluronique.
Pour la procédure de revêtement, la première étape est la liaison de l’acide hyaluronique de poids moléculaire élevé à 96 microplaques enduites de tissu bien. Pour le revêtement, l’acide hyaluronique est dilué dans 0,1 tampon de carbone taupe PH 9,6 à une concentration de 15 microgrammes par millilitre. Et le pipeting doucement est requited pour réaliser une solution homogène.
Une 100 microlitres de la solution sont utilisés pour enrober les puits. La plaque est ensuite transférée à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, aspirez les puits traités.
Laver une fois avec dPBS. Ajouter c1q ou BSA dans les puits correspondants. C1q est aujourd’hui disponible dans le commerce à une concentration d’un milligramme par millilitre et il est dilué à une concentration de 25 microgrammes par millilitre.
Et dPBS contenant 0,5%BSA et 0,7 millimoles calcium et magnésium et cations divalent. BSA LPS libre est utilisé à la concentration de 0,5% et la date PBF. La plaque est ensuite transférée à quatre degrés Celsius pendant la nuit.
Les interactions dépendantes de la dose C1q avec l’acide hyaluronique immobilisé sont déterminées par immuno SA lié à l’enzyme. Étiquetage des cellules avec dii rapide. Le traceur lipophile rapide DiI est utilisé pour étiqueter les cellules d’intérêt. Les cellules résusées dans le DPBS sont utilisées à la concentration d’un million de cellules par millilitre.
Fast DiI est dilué de un à 100 directement dans la suspension cellulaire. La suspension cellulaire est mélangée manuellement et transférée à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après cinq minutes d’incubation, mélanger la suspension cellulaire et répéter cette opération deux fois de plus.
Pour éliminer l’excès de DiI rapide, ajouter 10 millilitres de dPBS. Pivotez doucement de haut en bas et centrifugez à 250 g pendant sept minutes. Resuspendez la pastille cellulaire dans un millilitre de milieu sans sérum endophilique humain en présence de 0,1%BSA.
Adhérence des cellules sur l’acide hyaluronique C1q matrices. Aspirer sous vide le dPBS des puits enduits. Distribuez 100 microlitres de suspension cellulaire étiquetée aux puits enduits.
200 microlitres de cellules étiquetées sont démontés dans un tube d’épendure pour être utilisés pour la génération standard de courbes. Incuber la plaque pendant 35 minutes à 37 degrés Celsius. Sortez la plaque de l’incubateur.
Aspirez doucement les cellules déséquilibrées. Lavez-le une fois avec du dPBS contenant 0,5 % de BSA et 0,7 millimoles de calcium et de magnésium. Lys les cellules adhérentes en ajoutant 200 microlitres de tampon de lyse.
Dans le même temps préparer la courbe standard sur une à deux dilution en série des cellules étiquetées dans le tampon de lyse. Effectuez la lecture du signal de florescence à l’instrument infini F 200 T-can à l’aide de 544 nanomètres comme longueur d’onde d’excitation et de 590 nanomètres comme longueur d’onde d’émission. Résultats représentatifs.
Comme le montrent les résultats représentatifs, il est évident que l’adhérence cellulaire à l’acide hyaluronique a trouvé C1q aussi fortement amélioré par rapport à ha seul ou HA lié BSA. Le pourcentage de cellules adhérentes sur chaque matrice est calculé sur la base de la courbe standard. Conclusions. Dans nos expériences tout d’abord, nous avons évalué la capacité du composant de complément C12 à lier la matrice extracellulaire dans ce cas l’acide hyaluronique à l’aide d’un métal arisal.
Deuxièmement, nous avons analysé la capacité des cellules primaires humaines tachées de colorant fluorescent à poursuivre l’acide hyaluronique lié. Le modèle que nous avons proposé dans cette étude est une méthode plus rapide et moins chère en alternative au modèle 3D des échafaudages extracellulaires de matrice pour l’évaluation sur cette réponse cellulaire à une combinaison de stimulus.
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Aperçu
Cette étude explore l'interaction entre le composant du complément C1q et l'acide hyaluronique, en se concentrant sur la façon dont cette interaction influence l'adhésion cellulaire. Le C1q, une molécule pro-inflammatoire, est significativement exprimé dans les microenvironnements tumoraux et placentaires.
Composants clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Immunologie
Contexte
- Le C1q fait partie du système immunitaire inné.
- Il est fortement exprimé dans des microenvironnements tissulaires spécifiques.
- Le C1q interagit avec des composants de la matrice extracellulaire.
- L'acide hyaluronique est un composant clé de la matrice extracellulaire.
Objectif de l'étude
- Évaluer le rôle du C1q dans l'adhésion cellulaire.
- Investiguer comment le C1q lié à l'acide hyaluronique affecte le comportement cellulaire.
- Développer une méthode pour étudier les interactions protéiques dans l'environnement extracellulaire.
Méthodes utilisées
- Des cellules binaires dérivées de tissus humains ont été utilisées.
- Les cellules ont été autorisées à adhérer au C1q lié à l'acide hyaluronique.
- Une procédure complète a été établie pour l'évaluation.
- Les fonctions biologiques des protéines ont été évaluées dans le contexte de la matrice extracellulaire.
Principaux résultats
- L'interaction entre le C1q et l'acide hyaluronique favorise l'adhésion cellulaire.
- Les cellules répondent à la présence de C1q dans la matrice extracellulaire.
- Cette méthode fournit des informations sur les propriétés de division cellulaire influencées par des facteurs extracellulaires.
- Les résultats pourraient avoir des implications pour comprendre les réponses immunitaires dans les environnements tissulaires.
Conclusions
- Le C1q joue un rôle important dans l'adhésion cellulaire par son interaction avec l'acide hyaluronique.
- La méthode développée peut être appliquée pour étudier davantage les interactions protéiques.
- Comprendre ces interactions peut améliorer la connaissance des fonctions du système immunitaire dans divers tissus.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Understanding how complement protein C1q modulates extracellular matrix components like hyaluronic acid provides mechanistic insight into tumor-stroma interactions that drive adhesion-mediated progression. This assay enables early de-risking of targets involved in microenvironmental remodeling by quantifying how immune-derived signals alter matrix-dependent cell behavior. The method supports target validation in immuno-oncology by linking innate immune effectors to functional extracellular matrix changes relevant to metastatic competence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates how C1q binding to hyaluronic acid alters matrix properties to influence tumor cell adhesion, supporting functional target validation of microenvironmental mediators.
- Operational Value: Enables hypothesis testing of complement-driven matrix remodeling in a controlled, reproducible format using primary human tumor-derived cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence-based readouts of cell adhesion to C1q-HA matrices, enabling dose-response analysis of protein-matrix interactions.
- Operational Value: Uses a standardized 96-well coating protocol with defined concentrations of HA (15 µg/mL) and C1q (25 µg/mL) to ensure assay reproducibility across screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models how tumor-expressed C1q reshapes HA-mediated adhesion, offering a disease-relevant system to study stromal activation in neoplasia.
- Operational Value: Bridges discovery and preclinical work by providing a scalable method to evaluate matrix-targeted interventions using clinically relevant human cell inputs.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement to phenotypic screening, where matrix-dependent adhesion serves as a functional readout of pathway modulation in the tumor microenvironment.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by testing whether C1q-HA interaction drives pro-adhesive phenotypes in primary human tumor cells.
- Screening: Delivers standardized, quantitative adhesion outputs compatible with medium-throughput evaluation of modulators of protein-matrix binding.
- Analytics: Fluorescence signal quantification via standard curve enables precise comparison of adhesion conditions across HA, C1q-HA, and BSA-HA matrices.
- Translational Research: Uses human tumor-derived cells and physiologically relevant matrix components to enhance translational confidence in microenvironmental targeting strategies.
- Enterprise Reuse: Platform can be adapted to study other extracellular matrix proteins and immune mediators beyond C1q and HA, supporting cross-project standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in tumor-stroma communication by isolating the effect of C1q on HA-dependent adhesion.
- Operational Value: Defined coating and blocking steps (e.g., overnight 4°C incubation, dPBS washes) promote assay standardization and inter-lab reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by quantifying how immune matrix interactions influence early tumorigenic behaviors like anchorage-dependent growth.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets involved in complement-matrix crosstalk based on functional adhesion outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein coating, cell culture, and fluorescence-based quantification techniques.
- Dependent on access to fluorescence microplate readers capable of excitation at 544 nm and emission at 590 nm for fast DiI detection.
- Necessitates standardization of cell labeling protocols (e.g., fast DiI dilution, incubation times) to ensure consistent signal across experiments.
- Adaptation to other matrix proteins may require optimization of coating buffers and incubation conditions to maintain protein functionality.
- Limitations include reliance on 2D adhesion models, which may not fully capture 3D stromal complexity observed in vivo.
