Name: Identification de codage et de Classes d’ARN Non codants exprimée chez le porc sang total (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Découvrez une méthode optimisée d'extraction d'ARN codant et non codant à partir d'un échantillon de sang total porcin. Cette technique permet d'étudier les interactions hôte-pathogène en génomique.

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Ce travail a été soutenu principalement par le par le USDA NIFA AFRI 2013-67015-21236 et en partie par l’USDA NIFA AFRI 2015-67015-23216. Cette étude a été financée en partie par une nomination Agricultural Research Service Participation programme de recherche administré par l’Institut d’Oak Ridge pour la Science et l’éducation (Siero) grâce à un accord interinstitutions entre le US Department of Energy ( DOE) et le département américain de l’Agriculture. ORISE est géré par Oak Ridge Associated universités sous contrat DOE pas. DE-AC05-06OR2310.
Nous tenons à remercier le Dr Kay Faaberg pour les clones infectieux HP-PRRSV, Dr. Susan Brockmeier pour son aide avec les animaux impliqués dans l’expérience et Sue Ohlendorf pour l’assistance administrative dans la préparation du manuscrit.

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<li>Coble, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+analysis+of+broiler+liver+transcriptome+reveals+novel+responses+to+high+ambient+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature.</a> BMC Genomics. 15, 1084(2014).</li>
<li>Koltes, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+putative+quantitative+trait+nucleotide+in+guanylate+binding+protein+5+for+host+response+to+PRRS+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection.</a> BMC Genomics. 16, 412(2015).</li>
<li>Miller, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+signature+genes+in+PRRSV-infected+porcine+monocyte-derived+cells+to+different+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli.</a> PLoS One. 12 (7), 0181256(2017).</li>
<li>Head, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+construction+for+next-generation+sequencing%3A+overviews+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges.</a> Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
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<li>Fleming, D. S., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+small+non-coding+RNA+classes+expressed+in+swine+whole+blood+during+HP-PRRSV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection.</a> Virology. 517, 56-61 (2018).</li>
<li>Fleming, D. S., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+non-coding+RNA+expression+status+in+animals+faced+with+highly+pathogenic+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+%28HP-PRRSV%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+World+Congress+on+Genetics+Applied+to+Livestock+Production%22%5BJournal%5D)">Small non-coding RNA expression status in animals faced with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV).</a> Proceedings of the World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. (11), Species - Porcine 2 (2018).</li>
<li>Bivens Nathan, J., Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+Library+Construction+Methods+for+Transcriptome+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis.</a> Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).</li>
<li>Cui, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+between+ribo-minus+RNA-sequencing+and+polyA-selected+RNA-sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing.</a> Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAseq+by+Total+RNA+Library+Identifies+Additional+RNAs+Compared+to+Poly%28A%29+RNA+Library%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library.</a> BioMed Research International. 2015, 9(2015).</li>
<li>Choi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+gene+discovery+and+coverage+using+RNA-seq+of+globin+RNA+reduced+porcine+blood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples.</a> BMC Genomics. 15, 954(2014).</li>
<li>Wu, K., Miyada, G., Martin, J., Finkelstein, D. Globin reduction protocol: A method for processing whole blood RNA samples for improved array results. , Available from: 
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<li>TruSeq® Stranded Total RNA Sample Preparation Guide. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Illumina%22">Illumina</a>. , (2018).</li>
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 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg">https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg</a> (2018).</li>
<li>Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+RNA-Seq+transcriptome+profiles+of+peripheral+whole+blood+from+healthy+individuals+with+and+without+globin+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion.</a> PLoS One. 9 (3), 91041(2014).</li>
<li>Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+the+complexity+of+transcriptomes+with+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916(2010).</li>
<li>Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+microRNA--novel+RNAs+derived+from+small+non-coding+RNA+and+their+implication+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer.</a> Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.
La mention de noms commerciaux ou des produits commerciaux dans cet article est uniquement dans le but de fournir des informations spécifiques et n’implique pas de recommandation ou une approbation par le U.S. Department of Agriculture. USDA est un fournisseur de l’égalité des chances et l’employeur.

La première étape critique dans le protocole qui fait optimisé inclus les étapes de l’appauvrissement globine ajouté, qui ont permis d’obtenir des lectures de qualité provenant d’échantillons de sang entier. L’une des plus grandes limites sur l’utilisation de sang dans les études de séquençage sont le grand nombre de lectures dans l’échantillon qui seront correspondent à des molécules de globine et réduire les lectures qui pourraient mappent à d’autres molécules d’intérêt18. Par conséquent, en opt...

Séquençage de la génération suivant (NGS) a émergé comme un outil puissant pour l’étude des changements qui se produisent au niveau génomique d’organismes biologiques. Préparation des échantillons pour les méthodes end peut varier selon l’organisme, le type de tissu, et surtout les questions les chercheurs tiennent à adresse. De nombreuses études se sont tournés vers la NGS comme un moyen d’étudier les différences dans l’expression des gènes entre Etats comme des individus sains et malades1,2,3,4. Le séquençage de prendre place sur une base de l’ensemble du génome et permet à un chercheur capturer la plupart, sinon tous, de l’information génomique pour un marqueur génétique particulière à la fois le point.
Les marqueurs plus courants d’expression observés sont les ARN messagers (ARNm). Les procédures plus utilisés pour préparer des bibliothèques pour RNA-seq sont optimisées pour la récupération des molécules d’ARNm au moyen d’une série de purifications, fragmentations et des trompes5,6. Toutefois, la décision sur comment un protocole doit être effectuée dépend fortement du type de l’échantillon et les questions étant posées sur ledit échantillon. Dans la plupart des cas, l’ARN total est extrait ; Pourtant, pas toutes les molécules d’ARN sont intéressants et dans des cas tels que les études d’expression ARNm trop abondantes espèces d’ARN, comme l’ARN ribosomique (ARNr) doivent être éliminés afin d’augmenter le nombre de transcriptions décelables associée à l’ARNm. La méthode la plus populaire et largement utilisée pour éliminer les molécules d’ARNr abondante est la réduction des transcriptions polyadénylé RNA dénommé polyA appauvrissement de la couche7. Cette approche fonctionne bien pour l’analyse de l’expression de l’ARNm qu’elle n’affecte pas la transcription de l’ARNm. Toutefois, dans les études qui sont intéressent à des ARN non codants ou virales, l’appauvrissement de polyA supprime également ces molécules.
De nombreuses études choisissent de se concentrer sur la préparation de bibliothèque de séquence ARN afin d’examiner l’expression de l’ARNm (codage) ou une classe particulière d’ARN non codants de petite ou grande. Bien qu’il existe d’autres procédures8 comme le nôtre qui permettent la préparation de l’échantillon double, nombreuses études préparent de bibliothèques à partir des échantillons distincts pour des études distinctes lorsqu’ils sont disponibles. Pour une étude comme la nôtre, il faudrait normalement plusieurs échantillons de sang, augmentant le stress animal, consommables et temps. L’objectif de notre étude était d’être capable d’utiliser le sang d’animaux pour identifier et quantifier les différentes classes de deux ARNm et non-codantes RNA exprimée entre sain et hautement pathogène dysgénésique et le virus du syndrome respiratoire (HP-PRRSV) contesté de porcs9,10 en dépit d’avoir seulement un échantillon simple de sang total (2,5 mL) de chaque cochon. Pour ce faire, il nous fallait optimiser l’extraction typique et les protocoles de création de bibliothèque pour générer les données appropriées permettant l’analyse des ARNm et non-codantes RNA (ARNnc) expression11 auprès d’un échantillon unique.
Cela a incité un besoin pour un protocole qui permettait d’ARNm et d’analyse de RNA non-codantes parce que les kits standards disponibles et méthodes d’extraction de l’ARN et bibliothèque de création étaient destinés principalement à des ARNm et utilisent une déplétion de poly-A étape12. Cette étape aurait rendu impossible de récupérer des ARN non codants ou transcriptions virales de l’échantillon. Par conséquent, il fallait une méthode optimisée qui a permis d’extraction de l’ARN totale sans appauvrissement de polyA échantillon. La méthode présentée dans ce manuscrit a été optimisée pour permettre l’utilisation de sang comme un type d’échantillon et pour construire des librairies de séquençage de l’ADN messagère et ncRNA de petites et grandes tailles. La méthode a été optimisée pour permettre l’analyse de tous les ARN de non-codage détectable mais aussi de conserver l’ARN viral pour l’enquête ultérieure13. Dans l’ensemble, notre protocole de préparation de Bibliothèque optimisée permet d’enquête sur les multiples molécules d’ARN auprès d’un échantillon de sang total unique.
L’objectif derrière l’utilisation de cette méthode était d’élaborer un processus qui a permis pour la collecte de non-codage ARN et ADN messagère dans un échantillon de sang entier. Cela nous permet d’avoir ARNm, ARNnc et l’ARN viral pour chaque animal dans notre étude proviennent d’un seul échantillon9. Ceci, en fin de compte, permet la découverte plus scientifique sans animaux surcoûts et donne une image plus complète de l’expression de chaque échantillon individuel. La méthode décrite permet l’examen des régulateurs de l’expression des gènes comme permettant à l’achèvement des études de corrélation en comparant les deux ARNm et expression de RNA non codantes en utilisant un échantillon simple de sang total. Notre étude a utilisé ce protocole pour examiner les changements dans l’expression des gènes et des régulateurs épigénétiques possibles dans virally infectés 9 - vieux semaine commerciales verrats.

<table><tbody><tr><td>PAXgene Tubes</td><td>PreAnalytix</td><td>762165</td><td></td></tr><tr><td>Biologie moléculaire Eau de qualité</td><td>ThermoFisher</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>mirVana Kit d’isolation des miARN</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1560</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy MinElute Kit de nettoyage</td><td>QIAGEN</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>100 % éthanol</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>0,2 mL tubes à paroi mince</td><td>ThermoFisher</td><td>98010540</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL RNase/DNase - tubes libres</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96-well Thermocycler</td><td>ThermoFisher</td><td>4375786R</td><td></td></tr><tr><td>Globine Reduction Oligo (&alpha ; 1)</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td>Séquence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT</td></tr><tr><td>Globin Reduction Oligo (&alpha ; 2)</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td>Séquence TCA ACG ATC AGG AGG GGG GGG TGC AA</td></tr><tr><td>Oligo de réduction de globine (&beta ; 1)</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td>Séquence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT</td></tr><tr><td>Oligo de réduction de la globine (&beta ; 2)</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td>Séquence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT CT</td></tr><tr><td>10X Tampon</td><td></td><td></td><td></td> d’hybridation</tr> <tr><td>oligo-Tris-HCl, pH 7,6</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1757-100-KCl</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Millipore Sigma</td><td>60142-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>10X RNase H Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;-Tris-HCl, pH 7,6</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1757-100</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;-DTT</td><td>ThermoFisher</td><td>Y00147</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;-MgCl2</td><td>Promega</td><td>A351B</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;-Biologie moléculaire Eau de qualité</td><td>ThermoFisher</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2292</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-IN</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2694</td><td>Inhibiteur de rnase</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Millipore Sigma</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; 2100 Instrument d’électrophorèse BioAnalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Agilent ADN haute sensibilité&nbsp ; Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Kit de préparation de banque d’ARN total toronné avec Ribo-Zero&nbsp ;</td><td>Kit</td> d’ARNm <td>Illumina RS-122-2201</td><td> ; Ensemble Humain/Souris/Rat A&nbsp ; (48 échantillons, 12 index)</td></tr><tr><td>Guide de préparation des échantillons d’ARN total toronné TruSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td>Disponible en ligne</td></tr><tr><td>Perles RNAClean XP</td><td>BeckmanCoulter</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>Perles AMPure XP</td><td>BeckmanCoulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Bande optique 8 tubes</td><td>ThermoFisher</td><td>N8010580</td><td>0,2 ml Tubes à paroi mince</td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap</td><td>ThermoFisher</td><td>N801-0535</td><td></td></tr><tr><td>RNase/DNase - réservoirs de réactifs libres</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Transcriptase</td><td>inverse ThermoFisher</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 96 well plates</td><td>ThermoFisher</td><td>N8010560</td><td>Ceux-ci ont été utilisés à la place des plaques de .3mL au besoin</td></tr><tr><td>Film adhésif MicroAmp Optical</td><td>ThermoFisher</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Kit de préparation de petite bibliothèque d’ARN multiplex pour Illumina&reg ; (Série 1)&nbsp ;</td><td>New England Biolabs</td><td>E73005</td><td>kit de petite bibliothèque d’ARN</td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Small RNA Library Set pour Illumina&reg ; (Ensemble 2)&nbsp ;</td><td>New England Biolabs</td><td>E75805</td><td>petit kit d’ARN</td></tr><tr><td>QIAQuick Kit de purification PCR</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>96S Super Magnet Plate</td><td>ALPAQUA</td><td>A001322</td><td></td></tr></tbody></table>

identification de codage et de classes d’arn non codants exprimée chez le porc sang total

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

L’avènement de l’innovants et de plus en plus puissantes techniques de séquençage prochaines génération a ouvert de nouvelles avenues dans la possibilité d’étudier l’expression des gènes associée à des processus biologiques d’intérêt sous-jacent. Ces innovations permettent non seulement aux chercheurs d’observer l’expression à partir des séquences d’ADN messagère gènes codant cette fonction cellulaire de l’effet, mais les molécules d’ARN (ARNnc) non codantes qui restent non traduits, mais encore ont également des fonctions de réglementation. Bien que les chercheurs ont la capacité d’observer les ARNm et les ARNnc expression, il est d’usage pour une étude visant à mettre l’accent sur l’un ou l’autre. Cependant, lorsque les études sont intéressés par l’expression des ARNm et ARNnc, autant de fois qu’ils utilisent des échantillons distincts pour examiner codage ou non codantes RNAs en raison de la différence dans les préparations de la bibliothèque. Cela peut conduire à la nécessité pour d’autres exemples qui peuvent augmenter le stress animal, consommables et temps. En outre, il peut causer aux chercheurs de décider de préparer les échantillons pour seul analyse, habituellement l’ARNm, en limitant le nombre de questions biologiques qui peuvent être l’objet d’une enquête. Cependant, ncRNA couvrent plusieurs classes avec rôles régulateurs cette expression de l’ARNm effet. ARNnc étant important à des processus biologiques fondamentaux et trouble de ces processus au cours de l’infection, ils peuvent, par conséquent, faire des cibles intéressantes pour les thérapies. Ce manuscrit montre un protocole modifié pour la génération non codantes RNA expression bibliothèques, y compris l’ARN viral, d’un seul échantillon de sang total et l’ARNm. Optimisation du présent protocole, amélioré la pureté du RNA, a augmenté de ligature pour la récupération d’ARN méthylés et omis de sélection de taille, pour permettre la capture de plusieurs espèces d’ARN.

Les échantillons représentatifs dans notre étude sont la globine et les échantillons de sang appauvri en ribo. Les résultats représentatifs du protocole est constitué d’un échantillon de bibliothèque appauvri globine avec un nombre de l’intégrité du RNA (RIN) au-dessus de 7 (Figure 1a) et des ratios de concentration 260/280 nm égale ou supérieure à 2 (Figure 1b et 1c). Valider le résultat de l’éc...

Ici, nous présentons un protocole optimisé pour le traitement du codage (ARNm) et non-codantes (ARNnc) globine réduite RNA-seq bibliothèques auprès d’un échantillon de sang total unique.

Identification de codage et de Classes d’ARN Non codants exprimée chez le porc sang total

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans l’étude des interactions hôte-pathogène en permettant l’examen de l’expression du codage, du non-codage et de l’ARN viral impliquée dans la réponse des acides aminés hôtes ainsi que de la façon dont un agent pathogène peut affecter les fonctions biologiques de l’hôte. Le principal avantage de cette technique est qu’elle présente un protocole optimisé pour le traitement de l’ARNm et de l’ARN non codant provenant de bibliothèques RNAseq réduites en globine à partir d’un seul échantillon de sang entier. La technique sera démontrée par Sarah Anderson, technicienne de mon laboratoire.Commencez par centrifuger les tubes sanguins à 50 20 fois G pendant 10 minutes à température ambiante. En travaillant dans un cabinet de sécurité biologique, après avoir enlevé le supernatant, ajouter huit millilitres d’eau sans RNase à la pastille. Fermer les tubes et vortex la pastille jusqu’à ce qu’elle soit visiblement dissoute, puis centrifuger les tubes à 50 20 fois G pendant 10 minutes à température ambiante pour récupérer la pastille.En travaillant dans un cabinet de sécurité biologique, jetez le supernatant et économisez la pastille. Pour isoler l’ARN total, commencez par achemier 300 microlitres de tampon liant la lyse à la pastille. Après vortex, transférer le mélange de chaque tube dans un nouveau tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre étiqueté.Ajouter 30 microlitres d’additif homogénétique du kit d’isolation miRNA. Vortex les tubes et placer sur la glace pendant 10 minutes. En travaillant dans un capot de fumée, retirer les tubes de la glace et ajouter 300 microlitres du réaccente chloroforme de phénol acide du kit et vortex à nouveau pour mélanger.Après avoir centrifugé à 10 000 fois G pendant cinq minutes à température ambiante, retirer soigneusement la phase aqueuse dans un nouveau tube. Selon la quantité de récupération aqueuse par rapport à l’étape précédente, ajouter 1,25 fois le volume de 100% d’éthanol au phage aqueux dans chaque tube et pipette à mélanger. Préparer des tubes de collecte frais contenant une cartouche de filtre pour chaque échantillon.Pipette environ 675 microlitres du mélange lysate-éthanol sur la cartouche de filtre. Centrifugeuse brièvement à 10 000 fois G pour passer le liquide à travers le filtre. Jetez le flux à travers.Répétez le mélange lysate-éthanol en ajoutant au filtre et à la centrifugation jusqu’à ce qu’il ait été complètement utilisé. Ajouter 700 microlitres de solution de lavage un du kit à la cartouche de filtre. Centrifugeuse brièvement pour tirer la solution à travers les filtres.Jetez le flow-through et gardez les mêmes cartouches de filtre et tubes de collecte. Ajouter 500 microlitres de solution de lavage deux-trois à chaque cartouche de filtre. Après avoir centrifugé à nouveau, jeter le flow-through et répéter l’étape de lavage.Pour éliminer tout liquide résiduel des cartouches de filtre, faites-les tourner 60 secondes de plus. Transférer les cartouches dans des tubes de collecte frais. Ajouter 100 microlitres d’eau préchauffée sans nucléase de 95 degrés Celsius au centre de chaque cartouche de filtre.Centrifuger les cartouches pendant environ 20 à 30 secondes à la centrifugeuse de table à vitesse maximale. Pour préformer l’hybridation avec les oligos de réduction de la globine, d’abord dénoler l’ARN en ajoutant chaque échantillon extrait dans un tube de réaction sans nucléase à paroi mince de 0,2 milliliter. Placez les tubes dans un cycleur thermique à 70 degrés Celsius pendant deux minutes.Après cela, placez immédiatement les tubes sur la glace pour obtenir une qualité optimale d’ARN. Pendant que les tubes refroidissent, préparez 400 microlitres de mélange oligo de réduction de globine de 10X et tampon d’hybridation d’oligo de 10X dans un tube de deux millilitres. Pour faire le mélange d’hybridation, ajoutez six microgrammes d’échantillon d’ARN, deux microlitres du mélange oligo de réduction de globine de 10X, un microlitre de tampon d’hybridation d’oligo de 10X, et l’eau libre de nucléase à un volume final de 10 microlitres à chaque tube de réaction mince-muré de 0,2 milliliter.Placez les tubes dans le cycleur thermique à 70 degrés Celsius pendant deux minutes. Après cela, placez immédiatement les tubes sur la glace. Pour effectuer la digestion RNase H, diluer d’abord 10X RNase H à un X RNase H avec un tampon X RNase H.Préparez le mélange de réaction RNase H en combinant deux microlitres de tampon 10X RNase, un microlitre d’inhibiteur de la RNase et deux microlitres d’un X RNase H, et cinq microlitres d’eau sans nucléase pour un volume total de 10 microlitres. Ajouter 10 microlitres du mélange de réaction RNase H aux échantillons d’hybridation de réduction de la globine et bien mélanger. Digérer cette réaction à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis refroidir à quatre degrés Celsius.Arrêtez la digestion en ajoutant un microlitre de 0,5 molaire EDTA au tube, et transférez toute la teneur du tube dans un tube frais de 1,5 millilitre. Immédiatement après cela, ajouter 80 microlitres d’eau sans RNase, 350 microlitres de tampon de lyse, puis 250 microlitres de 100% d’éthanol à chaque tube et bien mélanger par pipetting. Transférez chaque échantillon de 700 microlitres dans une cartouche de filtre d’éution distincte placée dans un tube de collecte de deux millilitres pour recueillir le débit.Centrifugeuse pendant 15 secondes à 8000 fois G ou plus, puis jeter le flux à travers. Placez les mêmes cartouches de filtre d’éution dans de nouveaux tubes de collecte de deux millilitres. Pour laver les membranes des cartouches de filtre, ajouter 500 microlitres du tampon de lavage doux aux cartouches de filtre et à la centrifugeuse pendant 15 secondes à 8 000 fois G ou plus.Jetez le flux à travers. Ensuite, à l’aide des mêmes tubes de collecte, ajouter 500 microlitres de 80% d’éthanol aux cartouches de filtre. Centrifugeuse pendant deux minutes à 8000 fois G et plus.Jetez à la fois les tubes d’écoulement et de collecte, et enregistrez les colonnes de spin d’éution. Placez chaque colonne de spin d’éution dans un nouveau tube de collecte de deux millilitres. Centrifugeuse à pleine vitesse pendant cinq minutes avec le couvercle ouvert sur les cartouches de filtre pour sécher les membranes de la colonne de spin et empêcher le report de l’éthanol.Après avoir jeté les tubes de collecte, placez chaque cartouche de filtre séchée dans un tube de collecte frais de 1,5 millilitre. Ajouter 14 microlitres d’eau sans RNase directement au centre de la membrane de la cartouche de filtre. Pour élucider l’ARN, centrifugez les tubes pendant 60 secondes à pleine vitesse, puis continuez avec une évaluation et une préparation plus poussées de l’ARN.L’échantillon appauvri en globine peut maintenant être fractionné et utilisé pour préparer les petites bibliothèques d’ARN non codantes ainsi que l’ARNm appauvri en ribos et les bibliothèques d’ARN longues et non codantes. Après avoir préparé des bibliothèques d’expression des échantillons de sang entier appauvris en globine et ribo-épuisés utilisant ce protocole, le résumé d’exécution de fichier d’électrophoresis a montré un échantillon de bibliothèque globine-épuisé avec des nombres d’intégrité d’ARN qui allaient de 6.3 à 9.2. Cela s’est avéré être une amélioration par rapport à d’autres études qui ont utilisé des méthodes d’épuisement de la globine et n’ont été en mesure d’atteindre les chiffres rin à ou près de six.La réduction de la préglobine et la réduction post-globine d’un seul échantillon de sang entier porcin ont montré que les concentrations de 260 à 280 nanomètres sont à ou au-dessus de deux. À l’aide de ce protocole, on a obtenu des électrophéogrammes à base de copeaux d’échantillons de bibliothèque d’ARNm de sang entier appauvris à base de globine et de ribo avant la mise en commun et le séquençage. Pour les bibliothèques d’ARNm, l’électrophétogramme représentatif a un pic à environ 280 paires de base.Pour les petits anrnas, les électrophétogrammes représentatifs à base de puces contiennent une gamme de pics d’environ 100 à 400 paires de base. Les pics à environ 143 paires de base correspondent aux miARN, et les pics à environ 153 paires de base correspondent aux PIARN. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de tubes de glace immédiatement où noté.À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que le séquençage de prochaine génération devraient être effectuées afin de répondre à d’autres questions telles que l’expression différentielle, les changements épigénétiques et leur effet sur les voies et les processus biologiques. N’oubliez pas que travailler avec un réaccente phénol-chloroforme est extrêmement dangereux et que des précautions telles que le travail dans un capot de fumée doivent être prises. En outre, lors de la manipulation du sang entier ou des organismes infectieux, le travail doit être effectué dans un cabinet de sécurité biologique avant une activation de l’organisme infectieux.

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