Séquençage de l’ARN des cellules individuelles des neurones de souris fluorescent étiquetés à l’aide de tri manuel et Double Transcription In Vitro de chefs absolus séquençage (DIVA-Seq)

Cette méthode peut aider à résoudre un obstacle clé dans le domaine de l’isolement mono-neurone et le séquençage. Comme la collecte d’une population spécifique ou d’une sous-population de neurones étiquetés fluorescents à partir d’une zone cérébrale définie par l’utilisateur. Le principal avantage de cette technique est qu’elle assure que le neurone unique d’intérêt est capturé sans contaminer les débris.

Il est également relativement doux, ce qui est important pour les types de neurones fragiles qui meurent rapidement lorsqu’ils sont soumis aux pressions fluides du tri facs conventionnel. Commencez par préparer des microcapillaires en verre tiré avec un diamètre de sortie de 10 à 15 microns à l’aide d’un pull capillaire. Utilisez des ciseaux fins pour couper la pointe du capillaire pour obtenir le diamètre désiré de la planche.

Utilisez ensuite des connecteurs à tubes pour fixer une longueur de 120 à 150 centimètres de tubes flexibles en silicone d’un diamètre intérieur de 0,8 millimètre à un filtre à seringues à membrane PVDF de 0,2 micron et à une valve à tubes à deux sens. Préparer 500 millilitres de liquide céphalo-rachidien artificiel réfrigéré ou ACSF et oxygéner en bouillonnant 5% de dioxyde de carbone équilibré l’oxygène à travers une pierre d’air pendant 15 minutes ou jusqu’à ce que la solution se dégage complètement. Préparez trois beakers de 150 millilitres contenant chacun 100 millilitres d’ACSF.

Pour un, ajouter un cocktail de bloqueurs d’activité. À un autre, ajouter la fraction streptocoque pour la protéase à une concentration finale d’un milligramme par millilitre. Au bécher final, ajouter fbs à une concentration finale de 1% et oxygéner avec 5% d’oxygène équilibré par le dioxyde de carbone à travers une pierre d’air.

Enfin, faire trois pipettes Pasteur à longue tige avec des diamètres de sortie décroissants en les roulant sur une flamme nue. Disséquer le cerveau d’une souris euthanasiée en ouvrant le crâne avec un petit ciseaux et en extrayant le cerveau frais à l’aide de forceps fins sans endommager le cortex. Placez le cerveau dans un ACSF réfrigéré et oxygéné, en laissant une pierre d’air attachée à 5 % d’oxygène équilibré en dioxyde de carbone pendant toute la durée de la section.

Placez le cerveau sur le mandrin vibratome et coupez les sections coronale ou sagittale à 300 microns d’épaisseur. Recueillir autant de sections que nécessaire pour obtenir un minimum de 10 à 50 cellules étiquetées. Mettre les tranches sur un porte-tranches en jersey de coton placé à l’intérieur d’un bécher afin qu’elles soient baignées d’ACSF oxygénée.

Déplacez les tranches dans le bécher contenant de l’ACSF avec des bloqueurs d’activité et bloquez pendant 15 à 20 minutes à température ambiante tout en bouillonnant l’oxygène à l’aide d’une pierre d’air. Déplacez les tranches vers le bécher contenant de l’ACSF avec la solution de protéase pour effectuer une digestion douce à température ambiante. Après la digestion, laver la protéase en déplaçant les tranches vers le bécher contenant de l’ACSF avec solution de bloqueur d’activité pendant cinq à 10 minutes à température ambiante.

Continuez à bouillonner de l’oxygène. Ensuite, préparez une boîte de Pétri de 100 millimètres contenant de l’ACSF avec 1% de FBS à température ambiante et déplacez les différentes sections dans le disque pour la microdissection. Sous une portée de dissections fluorescentes, utilisez une paire de forceps fins pour micro disséquer les zones et les couches d’intérêt ayant un minimum de 10 à 50 cellules.

À l’aide d’une pipette Pasteur, déplacez les morceaux micro-disséqués dans un tube de microcentrifugeuse de 2 millilitres contenant environ 0,8 millilitres de 1 % de FBS dans la solution ACSF. Titrer le tissu disséqué dans le tube de micro-fuge à température ambiante. Effectuez environ 10 coups avec chacune des pipettes Pasteur enflammées commençant par la plus grande et se terminant avec le plus petit diamètre de sortie.

Distribuez les cellules dissociées dans une boîte de Pétri de 100 millimètres contenant de l’ACSF oxygéné et attendez cinq à sept minutes pour que les cellules se déposent graduellement. Observez le signal GFP et DP au microscope à dissection. Identifiez les débris en examinant la morphologie sous l’éclairage des champs lumineux.

Une fois qu’une zone de cellules avec peu de débris a été identifiée, utilisez le capillaire et attachez-le à des tuyaux pour ramasser les cellules en bloquant l’extrémité de la valve de tube avec la languette. Ensuite, placez le capillaire près des cellules. Relâchez le bloc sur le capillaire et bloquez rapidement à nouveau pour capturer la cellule à l’aide d’une action capillaire.

Déplacez le capillaire dans une boîte de Pétri de 100 millimètres avec de l’ACSF fraîchement oxygéné et soufflez doucement dans le tube tout en observant la pointe capillaire sous l’optique de fluorescence pour distribuer les cellules dans le plat. Répétez la procédure de collecte jusqu’à ce que 100 à 150 cellules soient collectées pour s’assurer que les contaminants, comme les débris, sont minimes dans l’optique de contraste différentiel de champ lumineux. Enfin, à l’aide d’une pipette micro-capillaire fraîche à chaque fois, choisissez une seule cellule et expulsez-la dans un tube micro-fuge de 0,2 microlitre contenant un microlitre de tampon de collecte d’échantillons avec amorces.

Casser la pointe de la pipette dans le tube de micro-fuge pour s’assurer que la cellule reste dans le tampon de collecte. Congeler les cellules en mettant les tubes sur de la glace sèche. Conserver dans un congélateur de moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit traité pour l’amplification de l’ARN.

Les neurones GABAergic ont été isolés du cortex cingulet du cerveau de souris. L’ARN amplifié à partir des neurones triés manuellement pendait entre 200 et 4000 paires de base de taille avec une distribution maximale légèrement supérieure à 500 paires de base. Après la purification des perles, la bibliothèque cDNA est encore plus grande, limitée par une deuxième série de purification à l’aide de perles pour éliminer les fragments de moins de 200 paires de base et pour le pic à environ 350 paires de base.

Le séquençage a montré 4,8 fois 10 à la 5e médiane ou 6,9 fois 10 à la 5e moyenne cartographié lit par cellule. Après l’ablation du double de l’ARN à l’aide d’UMIs, chaque cellule a eu une 1,0 fois 10 à la 5ème médiane ou 1,4 fois 10 à la 5ème moyenne des lectures uniques par cellule. Dans chaque consortium externe de contrôle de l’ARN à cellule unique, la pointe de l’ARN a été utilisée comme contrôle interne pour calculer le nombre absolu de molécules ajoutées à l’échantillon.

Il y avait une relation linéaire entre l’entrée et les dénombrements observés avec une pente de 0,92 et un carré R ajusté de 0,94. En moyenne, environ 10 000 gènes par neurone ont été détectés à l’aide de cette procédure avec plus de 95% des cellules individuelles détectant plus de 6000 gènes. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux biologistes moléculaires pour explorer le transcriptome des interneurones corticals distincts de souris bien caractérisés, et a identifié certaines catégories de gène qui sont responsables de l’encodage de l’identité cellulaire.