Name: Séquençage de l’ARN des cellules individuelles des neurones de souris fluorescent étiquetés à l’aide de tri manuel et Double Transcription In Vitro de chefs absolus séquençage (DIVA-Seq) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Découvrez le séquençage d'ARN de cellules uniques pour les neurones fluorescents de souris à l'aide du tri manuel et de DIVA-Seq. Cette méthode permet une isolation précise et une analyse approfondie de l'expression génique neuronale.

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Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH (5R01MH094705-04 et 01-R01MH109665 Z.J.H.) et par le Fonds des neurosciences CSHL Robertson (à Z.J.H.), une bourse de recherche postdoctorale NARSAD (à A.P.).

<ol><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li>
<li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+Fluidigm+C1+platform+for+RNA+sequencing+of+single+mouse+pancreatic+islet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).</li>
<li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanogrid+single-nucleus+RNA+sequencing+reveals+phenotypic+diversity+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer.</a> Nature Communications. 8 (1), 228(2017).</li>
<li>Yuan, J., Sims, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Automated+Microwell+Platform+for+Large-Scale+Single+Cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq.</a> Scientific Reports. 6, 33883(2016).</li>
<li>Eberwine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).</li>
<li>Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq%3A+Single-Cell+RNA-Seq+by+Multiplexed+Linear+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification.</a> Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).</li>
<li>Paul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Architecture+of+Synaptic+Communication+Delineates+GABAergic+Neuron+Identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity.</a> Cell. 171 (3), 522-539 (2017).</li>
<li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 1934, (2015).</li>
<li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).</li>
<li>Okaty, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Scale+Molecular+Deconstruction+of+the+Serotonin+Neuron+System%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System.</a> Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).</li>
<li>Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disentangling+neural+cell+diversity+using+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).</li>
<li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+single-cell+expression+to+characterize+co-expression+replicability%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability.</a> Genome Biology. 17, 101(2016).</li>
<li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+replicability+of+cell+types+defined+by+single+cell+RNA-sequencing+data+using+MetaNeighbor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li>
<li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li>
</ol>

Auteurs déclarent qu’il n’y a aucun intérêts financiers concurrents.

Le manuel de protocole de tri est adapté pour un séquençage de RNA encadré de neurone des populations qui sont soit peu marquées dans le cerveau de souris ou représentent une population de cellules rares qui est par ailleurs pas possible d’étudier à l’aide de la cellule active de haut débit méthodes de tri et d’amplification. Soumis à des FACS habituellement les cellules subissent des pressions de ligne gaine et échantillon de l’ordre de ~ 9 – 14 lb/po2, selon la taille de la buse et désiré taux d’événements. En outre, à...

Séquençage de RNA unicellulaires (RNA-seq) a transformé la transcriptomique études. Tandis que RNAseq de cellule unique à grande échelle peut être effectuée en utilisant une variété de techniques, telles que les gouttelettes1,2, microfluidique3, nanogrids4et5de micropuits, la plupart des méthodes ne peut pas trier les types cellulaires définis qui expriment des fluorophores codés génétiquement. Pour isoler une population cellulaire select, cellule activée par fluorescence triant (FACS) est souvent utilisé pour trier des cellules marquées en mode single-cell. Cependant, les FACS a certaines restrictions et nécessite des étapes de traitement d’échantillon méticuleux. Tout d’abord, un grand nombre de cellules d’entrée est généralement nécessaires (souvent plusieurs millions de cellules par mL), avec une fraction significative (> 15 à 20 %) contenant la population marquée. Deuxièmement, des préparations de cellules peuvent exiger plusieurs séries d’étapes de centrifugation en gradient de densité pour éliminer la fraction gliale, débris et amas de cellule qui pourraient obstruer sinon la cellule buse ou le débit. Troisièmement, les FACS emploie généralement de coloration et de décoloration des étapes pour vivre/morts de coloration (p. ex., 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), l’iodure de propidium (PI) et des colorants Cytotracker), qui prennent plus de temps. Quatrièmement, comme une règle de tri (par exemple le DAPI et protéine fluorescente verte/rouge (GFP/DP)), habituellement deux échantillons de deux couleurs et un contrôle sont nécessaires, nécessitant un échantillon sans étiquette à traiter en plus de la souche de souris désiré. Cinquièmement, le filtrage est souvent exécuté plusieurs fois avant et Pendant l’échantillon tri pour empêcher proactivement les lignes échantillon bouché dans une machine de FACS. Sixièmement, le temps doit avoir accumulé dans des configurations de FACS plus couramment utilisées pour initialiser et stabiliser le flux de fluide et procéder au calage du droplet. Septième, contrôle des échantillons sont généralement exécuter dans l’ordre avant la collecte de l’échantillon réel à mettre en place des matrices de rémunération, rejet de doublet, définition gates, etc. utilisateurs soit procédez comme six et sept s’avance ou exiger le intervention d’un technicien en parallèle. Enfin, post-FACS, il y a souvent des mesures pour s’assurer que seulement marqué unique, les cellules sont présentes dans chaque puits ; par exemple, en cochant les échantillons dans une installation de projection haute teneur comme un imageur de plaque rapide.
Pour contourner les étapes décrites ci-dessus et de faciliter un relativement rapide, ciblé le séquençage d’une petite population de neurones fluorescent étiquetés, les auteurs décrivent un manuel de procédure suivie de deux manches d’une très sensibles in vitro de tri protocole d’amplification, appelée double in vitro transcription de chefs absolus séquençage (DIVA-Seq). La génération de RNA d’amplification et de cDNA de bibliothèque est adaptée de Eberwine et al. 6 et Hashimshony et al. 7, avec certaines modifications en fonction des interneurones de souris qui ont de plus petits volumes cellulaires ; en outre, nous avons constaté également qu’il est tout aussi utile pour les neurones pyramidaux excitateurs.

<table><tbody><tr><td>ERCC RNA Spike-In Control Mix Thermo</td><td>Fisher</td><td>Cat# 4456740</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 18080093</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT Inhibiteur de la ribonucléase recombinante</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 10777019 Tampon</td><td></td></tr><tr><td>de fragmentation de l’ARN</td><td>New England Biolabs</td><td>Cat# E6105S</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’ARN MinElute</td><td>Qiagen</td><td>Cat# 74204</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase antarctique</td><td>New England Biolabs</td><td>Cat# M0289</td><td></td></tr><tr><td>Poly nucléotide kinase</td><td>New England Biolabs</td><td>Cat# M0201</td><td></td></tr><tr><td>T4 ARN ligase2, tronquée</td><td>New England Biolabs</td><td>Cat# M0242</td><td></td></tr><tr><td>Ampure Xp perles magnétiques</td><td>Beckman Coulter</td><td>Cat# A63880</td><td></td></tr><tr><td>SPRIsélectionner la taille billes</td> <td>magnétiquesThermo Fisher</td><td>Cat# B23317</td><td></td></tr><tr><td>DL-AP5</td><td>Tocris</td><td>Cat# 0105</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Tocris</td><td>Cat# 1045</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Tocris</td><td>Cat# 1078</td><td></td></tr><tr><td>Protéase de Streptomyces griseus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# P5147</td><td></td></tr><tr><td>Message Amp II kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# AM1751</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Airgas</td><td>Cat# UN3156</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# 761036</td><td></td></tr><tr><td>Illumina TrueSeq smallRNA kit Illumina</td><td></td><td>Cat# RS-200-0012</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyseur RNA Pico chip</td><td>Agilent</td><td>Cat# 5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyseur Puce ADN haute sensibilité</td><td>Agilent</td><td>Cat# 5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyseur 2100</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope de dissection avec fluorescence et éclairage en champ clair avec optique DIC. (modèle Leica MZ-16F).</td><td>Leica</td><td>Modèle MZ-16F</td><td></td></tr><tr><td>Microcapillaire en verre : Tubes capillaires en borosilicate 500/pqt. OD = 1 mm, ID = 0,58 mm, paroi = 0,21 mm, Longueur = 150 mm.</td><td>Warner instruments</td><td>Modèle GC100-15, Commande # 30-0017</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de pipette capillaire</td><td>Sutter Instruments Co</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Thermo Microm</td><td>HM 650V</td><td></td></tr><tr><td>Unité de refroidissement tissulaire Vibratome</td><td>Thermo Microm</td><td>CU 65</td><td></td></tr></tbody></table>

séquençage de l’arn des cellules individuelles des neurones de souris fluorescent étiquetés à l’aide de tri manuel et double transcription in vitro de chefs absolus séquençage (diva-seq)

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Séquençage de RNA unicellulaires (RNA-seq) est maintenant un outil largement utilisé pour analyser l’expression des gènes. Plates-formes de RNA-sequencing unicellulaires commercialement disponibles traitent toutes les entrées des cellules sans discernement. Parfois, la cellule activée par fluorescence triant (FACS) est utilisé en amont d’isoler une population spécifiquement marquée d’intérêt. Une limitation des FACS est la nécessité d’un nombre élevé de cellules d’entrée avec fractions nettement marquées, qui n’est pas pratique pour la collecte et le profilage des populations de neurone rares ou peu marqué par le cerveau de souris. Nous décrivons ici une méthode pour recueillir manuellement clairsemée fluorescent étiqueté de neurones fraîchement dissociées tissu de cerveau de souris. Ce processus permet de capturer des neurones seule avec haute pureté et intégration ultérieure avec un protocole de transcription basé sur l’amplification in vitro qui préserve les ratios de transcription endogène. Les auteurs décrivent une méthode de double amplification linéaire qui utilise des identificateurs de la molécule unique (UMIs) pour générer des comtes d’ARNm individuels. Deux séries de résultats d’amplification dans un degré élevé de détection de gènes par une cellule unique.

En utilisant le protocole décrit ci-dessus, GABAergiques neurones ont été manuellement triés (Figure 1) et ARN a été amplifié, puis transformé en une banque d’ADNc (Figure 2) et séquencé à haute profondeur8. Les produits amplifiés de RNA (aRNA) variaient entre 200 – 4 000 bp dans la taille, avec une distribution de pointe légèrement supérieure à 500 bp (Figure 3 a). L’ADNc de ...

Ce protocole décrit le manuel de procédure pour isoler les neurones fluorescent étiquetés suivies in vitro l’amplification des ARNm axée sur la transcription pour l’ordonnancement de RNA seule cellule haute-profondeur de tri.

Séquençage de l’ARN des cellules individuelles des neurones de souris fluorescent étiquetés à l’aide de tri manuel et Double Transcription In Vitro de chefs absolus séquençage (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Cette méthode peut aider à résoudre un obstacle clé dans le domaine de l’isolement mono-neurone et le séquençage. Comme la collecte d’une population spécifique ou d’une sous-population de neurones étiquetés fluorescents à partir d’une zone cérébrale définie par l’utilisateur. Le principal avantage de cette technique est qu’elle assure que le neurone unique d’intérêt est capturé sans contaminer les débris.Il est également relativement doux, ce qui est important pour les types de neurones fragiles qui meurent rapidement lorsqu’ils sont soumis aux pressions fluides du tri facs conventionnel. Commencez par préparer des microcapillaires en verre tiré avec un diamètre de sortie de 10 à 15 microns à l’aide d’un pull capillaire. Utilisez des ciseaux fins pour couper la pointe du capillaire pour obtenir le diamètre désiré de la planche.Utilisez ensuite des connecteurs à tubes pour fixer une longueur de 120 à 150 centimètres de tubes flexibles en silicone d’un diamètre intérieur de 0,8 millimètre à un filtre à seringues à membrane PVDF de 0,2 micron et à une valve à tubes à deux sens. Préparer 500 millilitres de liquide céphalo-rachidien artificiel réfrigéré ou ACSF et oxygéner en bouillonna

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Cette vidéo montre une méthode permettant d’isoler des neurones marqués par fluorescence dans le cerveau d’une souris.

Isolement de neurones marqués par fluorescence à partir d’un cerveau murin

L’ARN total de haute qualité a été préparé à partir des corps cellulaires des motoneurones de la moelle épinière de souris par microdissection de capture laser après coloration des sections de la moelle épinière avec Azure B dans de l’éthanol à 70%. Un ARN suffisant (~40-60 ng) est récupéré à partir de 3 000 à 4 000 motoneurones pour permettre l’analyse de l’ARN en aval par ARN-seq et qRT-PCR.

Production d’ARN pour l’analyse transcriptomique à partir de corps cellulaires de motoneurones de la moelle épinière de souris par microdissection de capture laser

Nous rapportons une méthode basée sur le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour isoler les cellules souches neurales (NSC) et leur descendance de la zone sous-ventriculaire (SVZ) du cerveau de souris adulte. Appliqué aux souris transgéniques FUCCI (Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator), il permet l’étude de la progression du cycle cellulaire par imagerie en direct.

Tri cellulaire des neurones cellules souches et progénitrices de la souris adulte-ventriculaire Zone et Live-imagerie de la dynamique de leur cycle cellulaire

Dans la maladie de Parkinson (PD), substantia nigra (SNC) neurones dopaminergiques dégénèrent, entraînant un dysfonctionnement du moteur. Nous rapportons ici un protocole pour la culture de neurones mésencéphaliques ventraux provenant d'une souris exprimant eGFP entraînée par une séquence de promoteur de tyrosine-hydroxylase (TH), la récolte des neurones fluorescents individuels à partir des cultures, et en mesurant leur transcriptome en utilisant l'ARN-seq.

Identification fiable de la vie Neurones Dopaminergiques dans les cultures Mésencéphale utilisant l&#39;ARN Séquençage et TH-promoteur-driven eGFP Expression

Ici, nous présentons une approche combinatoire pour classer les types de cellules neuronales avant l'isolement et pour la caractérisation ultérieure des transcriptomes monocellulaires. Ce protocole optimise la préparation d'échantillons pour un séquençage d'ARN réussi (RNA-Seq) et décrit une méthodologie conçue spécifiquement pour une meilleure compréhension de la diversité cellulaire.

L&#39;ARN monocellulaire-séquentiel des sous-ensembles définis des cellules ganglionnaires rétiniennes

Nous fournissons un protocole pour l'isolement des microglies de différentes régions disséquées d'un hémisphère de cerveau de souris adulte, suivi de la préparation semi-automatisée de bibliothèque pour le séquençage profond d'ARN unicellulaire des transcriptomes pleine longueur. Cette méthode aidera à élucider l'hétérogénéité fonctionnelle des microglies dans la santé et la maladie.

Isolement des microglies spécifiques à la région de l'hémisphère cérébral d'une souris adulte pour le séquençage profond de l'ARN à une seule cellule

Ici nous avons présenté une méthode multiplexée de séquençage d'ARNm de cellules simples pour profiler l'expression de gène dans les tissus embryonnaires de souris. La méthode de séquençage de l'ARNm à cellule unique à base de gouttelettes (scRNA-Seq) combinée à des stratégies de multiplexage peut dresser le profil des cellules uniques à partir de plusieurs échantillons simultanément, ce qui réduit considérablement les coûts des réactifs et minimise les effets expérimentaux des lots.

Analyse du séquençage de l'ARNm à cellule unique multiplexée des cellules embryonnaires de souris

Nous décrivons une technique de profilage des microARN chez les premiers embryons de souris. Ce protocole surmonte le défi de l’entrée de cellules faibles et de l’enrichissement de l’ARN. Ce test peut être utilisé pour analyser les changements dans l’expression miRNA au fil du temps dans différentes lignées cellulaires de l’embryon de souris précoce.

Préparation de petites bibliothèques d’ARN pour le séquençage à partir d’embryons de souris précoces

Présenté ici est une méthode pour séquencer des noyaux uniques isolés du gyrus denté de la souris qui exclut la plupart des neurones par tri des noyaux activés par fluorescence (FAN). Cette approche génère des profils d’expression de haute qualité et facilite l’étude de la plupart des autres types de cellules représentées dans la niche, y compris les populations rares telles que les cellules souches neurales.

Tri négatif des neurones par noyaux activés par fluorescence combiné au séquençage de l’ARN à noyau unique pour étudier la niche neurogène de l’hippocampe

Cet article établit un pipeline pour des suspensions de cellules uniques et de noyaux de haute qualité d’embryons de souris gaztrulants pour le séquençage de cellules uniques et de noyaux.

Séquençage de l’ARN unicellulaire d’embryons entiers de souris mutantes : de l’épiblaste à la fin de la gastrulation

Ce protocole combine la cytométrie en flux et le séquençage de l’ARN unicellulaire pour isoler et caractériser les états des cellules microgliales dans le cervelet des cerveaux de souris postnatals précoces. Il utilise la dissociation enzymatique, la centrifugation de Percoll et l’immunomarquage pour révéler l’hétérogénéité des microglies et améliorer la compréhension de leurs rôles dans le développement et la maladie cérébelleux.

Cytométrie en flux et analyse de cellules uniques pour caractériser l’activation de la microglie dans le développement postnatal précoce du cerveau de souris

Découvrez le séquençage d'ARN de cellules uniques pour les neurones fluorescents de souris à l'aide du tri manuel et de DIVA-Seq. Cette méthode permet une isolation précise et une analyse approfondie de l'expression génique neuronale.

Séquençage de l’ARN des cellules individuelles des neurones de souris fluorescent étiquetés à l’aide de tri manuel et Double Transcription In Vitro de chefs absolus séquençage (DIVA-Seq) (Vidéo) | JoVE Journal

Séquençage de l’ARN des cellules individuelles des neurones de souris fluorescent étiquetés à l’aide de tri manuel et Double Transcription In Vitro de chefs absolus séquençage (DIVA-Seq)

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