Seule étape Purification des Complexes macromoléculaires utilisant l’ARN attaché à la biotine et un éditeur de liens Photo-clivables

Cette méthode devrait intéresser les chercheurs qui tentent d’isoler les complexes protéiques de l’ARN et d’identifier leur composition par spectrométrie de masse. Nous croyons que notre protocole sera particulièrement utile pour purifier les complexes qui existent dans les cellules en quantités limitées et ont tendance à se dissocier au cours de longues procédures de purification en plusieurs étapes. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle n’implique qu’une seule étape de purification et pourrait être utilisée avec des sites de liaison arn de n’importe quelle longueur et séquence.

Xiao-cui Yang, technicien de recherche principal dans notre groupe, démontrera certaines étapes. Pour les sites de liaison significativement plus longs que 65 nucléotides, obtenir l’ARN généré par T7 et un oligonucléotide PCB adaptateur tel que décrit dans le protocole de texte. Mélanger 20 picomoles de l’ARN avec 100 picomoles de l’oligonucléotide adaptateur dans un tube de 1,5 millilitre contenant 100 microlitres de tampon liant.

Placer le tube dans l’eau bouillante et laisser incuber pendant 5 minutes. Laissez ensuite l’eau refroidir à température ambiante. Premier supplément 1 millilitre d’extrait nucléaire de souris avec 80 millimolaire EDTA au pH 8 à une concentration finale de 10 millimolar.

Ajoutez ensuite entre 5 et 10 picomoles du substrat d’ARN qui a été marqué avec la moiety PCB. Incuber sur la glace pendant 5 minutes, en s’assurant de mélanger occasionnellement l’échantillon. Ensuite, utilisez une microcentrifugeuse pré-refroidie à 4 degrés Celsius pour centrifuger le mélange à 10 000 fois g pendant 10 minutes pour éliminer les précipités potentiels.

Recueillir soigneusement le supernatant dans un nouveau tube sur la glace, tout en prenant soin d’éviter de transférer la pastille. Transférer environ 100 microlitres de suspension de perle d’agarose streptavidine dans un tube de 1,5 millilitre. Ajouter environ 1 millilitre de tampon de liaison pour commencer à laver les perles.

Centrifuger le tube à 25 fois g pendant 2 à 3 minutes et aspirer le surnatant. Répétez ce processus de lavage et de centrifugation 2 à 3 fois pour équilibrer les perles avec le tampon de liaison. Chargez le supernatant précédemment recueilli, qui contient le complexe assemblé sur les perles équilibrées.

À l’aide d’un rotateur à tube, faire pivoter le tube pendant 1 heure à 4 degrés Celsius pour immobiliser l’ARN et ligoté les complexes sur les perles. Tournez ensuite le tube à 25 fois g pendant 2 à 3 minutes pour recueillir les perles au fond du tube. Aspirez le surnatant.

Et rincer les perles deux fois avec tampon de liaison, en utilisant le processus de lavage précédemment décrit. Après avoir enlevé le supernatant du deuxième lavage, ajouter 1 millilitre de tampon de liaison et faire pivoter l’échantillon pendant 1 heure à 4 degrés Celsius. Faites tourner l’échantillon à 25 fois g pendant 2 à 3 minutes.

Ajouter ensuite 1 millilitre de tampon de liaison et transférer la suspension dans un nouveau tube. Faites pivoter l’échantillon à 4 degrés Celsius jusqu’à 1 heure. Centrifugeuse les complexes immobilisés à 25 fois g pendant 2 à 3 minutes.

Puis aspirer supernatant, et ajouter 200 microlitres de tampon de liaison. Transférer les perles dans un tube de 500 microlitres. Allumez une lampe UV de haute intensité qui émet de la lumière UV à 365 nanomètres et lui permettent d’atteindre son plein éclat.

Remplissez le fond d’une boîte de Pétri avec de la glace bien emballée qui l’empile sur le couvercle du plat. Vortex brièvement le tube contenant les complexes immobilisés. Placez-le ensuite horizontalement sur la glace et couvrez-le de la lampe préchauffée, en vous assurant que l’échantillon est à 2 à 3 centimètres de la surface de l’ampoule.

Irradier l’échantillon pendant un total de 30 minutes tout en inversant et vortexant fréquemment le tube pour assurer une exposition uniforme et prévenir la surchauffe. Après cela, faire tourner les perles à 25 fois g pendant 2 à 3 minutes et recueillir le surnatant. Centrifugeuse ce supernatant une fois de plus en utilisant les mêmes conditions.

Recueillir le supernatant résultant en s’assurant de laisser une petite quantité au fond du tube pour éviter de transférer des perles résiduelles. À l’aide de l’électrophorésie SDS-PAGE, séparez une fraction du supernatant uv et de la fraction correspondante du matériau laissé sur les perles après l’élitution UV. Ensuite, utilisez un kit de coloration d’argent disponible dans le commerce pour tacher le gel.

Évaluer l’efficacité de l’élitution UV en comparant les intensités des protéines présentes dans le supernatant uv éludé et celles laissées sur les perles après irradiation UV. Exciser les bandes protéiques d’intérêt et déterminer leur identité par spectrométrie de masse. Après cela, analysez directement une fraction du supernatant élit uv par spectrométrie de masse pour déterminer le protéome entier du matériel purifié d’une manière impartiale.

Dans cette étude, l’ARN de boucle souche marqué avec la biotine photo-clivable est incubé avec 1 millilitre d’un extrait cytoplasmique de S100 obtenu des cellules de myélome de souris. Et l’effet et l’efficacité de l’élitution UV est analysé par coloration d’argent. Un certain nombre de protéines sont détectées sur les perles de streptavidine avant l’élitution UV.

L’irradiation avec uv à ondes longues libère seulement quelques-unes de ces protéines dans le supernatant laissant un fond non spécifique sur les perles. Cela souligne l’importance de l’étape d’élitution UV. La spectrométrie de masse identifie les principales protéines uv éluquées comme étant 3'hExo et SLBP, le SLBP étant représenté à la fois par la protéine pleine longueur et un certain nombre de produits de dégradation plus courts.

De plus petites quantités d’autres protéines identifiées comme diverses protéines liant l’ARN ont également sélectivement libéré dans la solution par l’irradiation UV. L’élitution UV de l’histone immobilisé Drosophila pré-ARNm marqué avec de la biotine photo-clivable incubée avec un extrait nucléaire a entraîné une libération sélective de seulement un petit nombre de protéines dans le supernatant avec un fond intense de protéines non spécifiques restant sur les perles. La spectrométrie de masse identifie ces protéines comme composants du SnRNP U7.

Ils ne sont pas détectés en présence de concurrents de traitement qui bloquent la liaison de U7 snRNP à l’histone pré-ARNm. Il est important d’utiliser une lampe UV de haute intensité et de la placer à une distance proche de l’échantillon irradié tout en s’assurant qu’elle ne surchauffe pas. La méthode d’élitution UV donne des complexes de protéines ARN indigènes qui n’ont pas de contaminants majeurs et qui conviennent directement à des étapes de purification supplémentaires et à des analyses fonctionnelles.

Évitez l’exposition des yeux et de la peau pendant l’irradiation uv.