Isolement des kératinocytes épidermiques de souris et de leur culture clonogène in vitro

Notre méthode de récolte des cellules épidermiques chez les souris adultes est utile pour les applications en aval telles que les cellules souches kératinocytes. Notre technique est hautement reproductible et peut être utilisée en conjonction avec des procédures in vivo chez la souris dans le contexte du modèle de carcinogenèse de la peau. Après avoir récolté des échantillons de peau dorsale de souris adultes euthanasiées, utilisez des forceps autoclavés et un scalpel pour placer une peau dorsale à la fois côté poilu vers le bas dans une mince boîte de Petri et la ferraille du tissu sous-cutané, y compris la graisse du tissu ventral de la peau jusqu’à ce que le tissu est semi translucide.

Placez la peau grattée dans PBS jusqu’à ce que toutes les autres peaux restantes soient traitées. Ensuite, utilisez un scalpel pour couper les échantillons de peau en 0,5 par une à 1,5 centimètre bandes. Placez le côté poilu lanières vers le haut dans une boîte stérile de Petri avant de faire flotter le côté poilu d’échantillons vers le haut sur la surface d’un PBS de 20 millilitres plus deux solution x gentamicin, complétée avec 0.25% trypsin dans une boîte en plastique de Petri de 100 par 20 millimètres pendant deux heures à 32 degrés Celsius.

À la fin de l’incubation, placer une boîte de Pétri stérile, en plastique et carrée contenant 15 millilitres de milieu de récolte à une pente de 30 degrés et utiliser des forceps incurvés pour transférer soigneusement une bande de peau flottante dans le plat. Tenant une nouvelle lame de scalpel à un angle perpendiculaire à la peau et utilisant une force suffisante mais pas excessive, grattez l’épiderme et les poils de l’échantillon dans le milieu. Lorsque toutes les bandes ont été grattées, décanter soigneusement la cellule épidermique contenant du surnatant dans un bocal stérile de 60 millilitres contenant une barre magnétique de 1,5 pouce et rincer la boîte de Pétri avec un milieu de récolte supplémentaire pour recueillir les cellules épidermiques restantes.

Porter le volume final dans le bocal à 30 millilitres avec un milieu frais et remuer la solution épidermique à 100 rotations par minute pendant 20 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation en remuant dans un coffret de biosécurité enlever la barre de remue-remuer et filtrer la solution cellulaire à travers une passoire de 70 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres. Utilisez des forceps, puis une pipette pour presser les poils et les matériaux de cornée strate à travers la passoire pour manipuler le tissu pour libérer les cellules ciliées piégées et utiliser un supplément de cinq millilitres de milieu de récolte pour libérer les cellules ciliées restées piégées dans le tube.

Il est essentiel que les cellules épidermiques et les poils soient manipulés de manière à libérer les cellules des follicules pileux. Porter le volume total dans le tube jusqu’à 50 millilitres avec un milieu frais et recueillir le filtrate cellulaire par centrifugation. Resuspendez la pastille en 5 millilitres de milieu de récolte frais dans environ 20 triturations avec une pipette de 5 millilitres.

Prendre 0,5 millilitres de la dilution de 1 à 20 et le transférer dans un tube de microfuge de 2 millilitres. Après avoir soigneusement mélangé l’échantillon, prendre 200 microlitres du tube de microfuge et mélanger délicatement avec un volume égal de 0,4% trypan solution bleue. Mélangez doucement cette solution trois fois et transférez les cellules à un hémocytomètre pour compter les kératinocytes nucléés.

Marquer toutes les cellules bleu foncé comme cellules non viables et marquer de petites cellules dorées et rosées comme cellules viables. La viabilité est en moyenne d’environ 80% et le rendement final des kératinocytes par souris devrait être d’environ 30 millions de cellules viables. Après comptage, recueillir les cellules avec une autre centrifugation, et pour la culture de masse resuspendre deux à quatre fois 10 à la sixième kératinocytes viables par boîte de Petri de 35 millimètres dans 2 millilitres de milieu de culture cellulaire.

Pour un essai clonogenic de formation de colonie, résuspendez les cellules à une fois 10 aux troisièmes kératinocytes par quatre millilitres du milieu modifié d’E de William avec des suppléments dans la concentration de sérum par boîte enduite de collagène de 60 millimètres de Petri sur la souris suisse irradiée de rayon X 3T3 couches d’alimentation. Pour la culture de masse, faire croître les cultures à 32 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5 % pour la période de culture cellulaire appropriée. Modification du milieu 24 heures après l’ensemencement initial pour la culture de masse et trois fois par semaine par la suite.

À la fin de la culture clonale aspirer le milieu et fixer les colonies dans 10% de formaline tamponnée pendant la nuit à température ambiante. Le lendemain matin, entacher les colonies avec 0,5% de rhodamine B dans de l’eau autoclavée pendant une heure, avant de rincer la vaisselle dans de l’eau froide autoclavée jusqu’à ce que l’eau soit claire. Inclinez ensuite la vaisselle sur leurs couvercles pour sécher avant de compter les colonies.

Ici, les résultats typiques des analyses de formation de colonie de kératinocyte après divers traitements topiques sont montrés. Les cellules souches du follicule pileux représentent généralement environ 9 % des cellules isolées de la peau dorsale adulte de la souris C57BL/6, telle qu’évaluée par la coloration cytométrique du flux pour les marqueurs de cellules souches du follicule pileux de souris. Dans ce chiffre, les caractéristiques de croissance des colonies de cellules souches kératinocytes après culture dans quatre conditions moyennes différentes peuvent être observées.

Après cette procédure, les cellules peuvent être utilisées pour la cytométrie du flux, le tri cellulaire activé par fluorescence, la culture cellulaire et les analyses biologiques moléculaires. Cette technique nous a permis de déterminer que le nombre de cellules souches épidermiques est un trait quantitatif et complexe menant à l’identification d’un nouveau gène de régulation des cellules souches.