Name: Un dosage de Transport rhodopsine par analyse de l’imagerie de haute teneur (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Découvrez une méthode d'imagerie à haut contenu pour quantifier le transport de la rhodopsine mutante liée à la rétinite pigmentaire. Cette technique permet d'évaluer rapidement la pharmacodynamique des médicaments et d'accélérer le développement de traitements.

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Nous remercions le Dr Mark E. Schurdak et l’Université de Pittsburgh Drug Discovery Institute for fournissant l’imageur haute teneur et des formations initiales. Dr. Krzysztof Palczewski (Case Western Reserve University) a généreusement partagé le 4 1 et des anticorps anti-rhodopsine B630. Le plasmide contenant le cDNA de souris rhodopsin-Venus construire était partagé par m. Nevin Lambert (Université de Augusta). Ce travail a été soutenu par l’Institut National d’octroi de santé EY024992 YC et P30EY008098 de grant de l’Université de Pittsburgh Vision Research Core.

Remarque : La rhodopsine transport dosage.
1. préparation et la Culture de cellules
<ol><li>Faire revivre cryoconservés U2OS stables cellules exprimant le type sauvage (WT) ou les protéines de fusion de rhodopsine-Vénus souris mutante. Décongeler les cellules à 37 ° C jusqu'à ce que seulement petits cristaux de glace sont laissés dans le flacon. Remarque : Les cellules U2OS sont utilisés dans le présent protocole parce qu’il n’y a aucune lignée de cellules photoréceptrices disponibles pour des études in vitro et la biosynthèse des cils de la rhodopsine est régulée par des mécanismes moléculaires similaires dans les cellules de mammifères. En outre, les cellules U2OS attachent fermement vers le bas de la plaque et ont grands corps cellulaires, donc elles sont idéales pour l’analyse de transport de la rhodopsine. Sept U2OS cellules stables exprimant la WT, T4R, P23H, P53R, C110Y, D190N et P267L des mutants de rhodopsine sont utilisés ici à titre d’exemple pour montrer la qualité et la fiabilité du test. Des cellules stables exprimant les autres mutants de la rhodopsine ou d’autres protéines de la membrane peuvent être utilisés, selon l’objectif de l’essai. Cellules stables exprimant la rhodopsine humaine peuvent être utilisés dans ce test si elles sont disponibles. La rhodopsine souris a été utilisé ici, car les souris et les protéines humaines rhodopsine partagent 95 % d’homologie, et les composés identifiés par cet essai sera testée in vivo utilisant un modèle de souris PACA transportant la rhodopsine P23H mutation8. Les cellules stables ont été produites comme décrit plus haut19. Le WT et les transcriptions de la rhodopsine mutant ont été quantifiées par q-PCR et les clones de cellules stables exprimant des niveaux similaires de WT et transcriptions de rhodopsine mutant ont été sélectionnés pour ce test. L’expression des protéines de la rhodopsine a été confirmée par immunoblot et immunostaining. Le passage de cellules utilisées dans ce test doit être inférieur à 20.</li>
	<li>Transférer chaque lignée de cellules dans un tube conique 15 mL contenant 10 mL de milieu de croissance (taux de glycémie élevé Dulbecco modifié de Eagle medium (DMEM) avec 10 % sérum fœtal (SVF) et 5 µg/mL Plasmocin).</li>
	<li>Centrifuger le tube à 200 g pendant 5 min. jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire avec 5 mL de milieu de culture cellulaire pour chaque lignée cellulaire. Transférer chaque ligne de suspension cellulaire dans une boite de culture de tissus de 60 mm et incuber à 37 ° C, avec 5 % de CO2.</li>
	<li>Repiquer les cellules lorsque le plat de vitroplants atteint 90 % confluence comme décrit dans référence12.</li>
</ol>2. ensemencement de cellules à 5 000 cellules / puits
Remarque : Exécutez les procédures suivantes dans une hotte de culture de tissus.
<ol><li>Traiter la plaque avec poly-lysine.<ol>
<li>Un jour avant d’ensemencer les cellules, traiter un mur noir et clair plaque 384 puits avec 20 µL/puits de la solution de poly-lysine pendant 30 min.</li>
		<li>Aspirer le liquide et permettre à tous les puits à sec pour 1 h. Replacez le couvercle de la plaque et stocker la plaque à 4 ° C durant la nuit pour l’ensemencement de la cellule.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer la suspension cellulaire.<ol>
<li>La culture de chaque lignée cellulaire dans un milieu de croissance dans un plat de vitroplants de 100 mm jusqu’au confluent de 90 %.</li>
		<li>Lavez chaque plat avec du sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS) et détacher les cellules avec 1 mL de 0.05 % trypsine à 37 ° C.</li>
		<li>Remettre en suspension dans chaque ligne de cellules dans 10 mL de milieu (haute-glucose DMEM avec 10 % FBS, 100 unités/mL de pénicilline et la streptomycine 100 μg/mL).</li>
		<li>Compter les cellules et diluer chaque lignée de cellules à 1,25 x 105 cellules/mL avec le milieu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Les cellules des graines.<ol>
<li>Utiliser une pipette multicanaux électronique ou un distributeur automatique de réactif pour distribuer 40 µL/puits de la suspension cellulaire à trois colonnes par lignée cellulaire et remplissage colonnes 1-21 de la plaque 384 puits (Figure 2).</li>
		<li>Ajouter 40 µL/puits de U2OS (P23H-rhodopsine-Venus) à colonnes 22-23 et 40 µL/puits de U2OS (rhodopsine-Venus) à colonne 24, comme témoins.</li>
		<li>Centrifuger la plaque à 300 x g pendant 30 s pour faire tomber toutes les cellules vers le bas de la plaque 384 puits. Remarque : Évitez les chocs physiques à la plaque après l’ensemencement de la cellule. Dans le cas contraire, les cellules seront écrasées à un coin de chaque puits et la plaque ne sera pas adaptée pour l’imagerie de haute teneur.</li>
		<li>Incuber les plaques 384 puits à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 3 h pour les cellules d’attacher au fond de la plaque.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. traiter les cellules avec des composés
<ol><li>Générer une carte de la plaque avec les conditions de traitement tel qu’illustré à la Figure 2.</li>
	<li>Préparer 300 µL de 5 x solutions de travail de jusqu'à 15 composés dans une plaque à 96 puits.<ol>
<li>Diluer le cps 1 à 15 avec le milieu à cinq reprises de leurs concentrations finales dans les puits A1 à G2 de le 96 puits sur plaque (Figure 2 a). Ajouter 300 µL de milieu en H2 bien. Remarque : La concentration finale de chaque composé est utilisée à la concentration la plus efficace pour sauver le transport de la rhodopsine P23H par le HTS12,13.</li>
		<li>Ajouter 100 µL / puits de 2 % de diméthyl sulfoxide (DMSO) et 25 µM 9 -cis-rétinal qui sont dilués dans le milieu à colonnes 11 et 12, respectivement. Ajouter 9 -cis-rétinien dans la pénombre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajout de 10 µL / puits de 5 x travaillant des solutions à la plaque 384 puits, cultivées avec les cellules (Figure 2 b).<ol>
<li>Une pipette multi-canaux électronique permet d’ajouter des composés 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 et 15 pour les lignes A, C, E, G, I, K, M et O de colonnes 1 à 21 (Figure 2). Ajouter des composés 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 et M pour les lignes B, D, F, H, J, L, N et P dans les colonnes 1 à 21.</li>
		<li>Ajouter 10 µL / puits de 2 % DMSO à colonnes 22 et 24. Ajouter 10 µL / puits de 25 µM 9 -cis-rétinien à colonne 23. NOTE : DMSO est utilisé comme un contrôle de véhicule, parce que tous les composés sont initialement dissous dans le DMSO comme des stocks. Colonne 22 contenant des cellules de DMSO traité exprimant le P23H rhodopsine est utilisée comme contrôle de 0 %. 9 -Cis-rétiniens cellules traitées exprimant la rhodopsine P23H est utilisée comme contrôle 100 %.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Couvrir la plaque 384 puits avec du papier aluminium et incuber les plaques à 37 ° C pendant 24 h.</li>
</ol>4. Immunostaining sans perméabilisation de la Membrane sur la tache de rhodopsine protéine à la Surface cellulaire.
Remarque : Évitez tout détergent dans le processus d’immunostaining ensemble pour préserver la membrane cellulaire.
<ol><li>Préparer 4 % paraformaldéhyde (PFA) en diluant les 16 % PFA avec PBS dans un rapport 1:4 de volume sous une hotte chimique. Transférer les 4 % PFA dans un réservoir de réactif.</li>
	<li>Sortez la plaque 384 puits dans une pièce sombre avec une lumière rouge. Utilisez un aspirateur 8 canaux raccordée à une bouteille de collecte sous vide pour aspirer doucement le milieu. Utiliser une pipette multicanaux électronique pour ajouter 20 µL / puits de fraîchement préparés 4 % PFA à l’ensemble plaque 384 puits et incuber pendant 20 min à température ambiante. Pour éviter le détachement cellulaire, pointent toujours les conseils de l’aspirateur vers du même côté de chaque puits au cours des aspirations. Ne pas toucher la partie inférieure médiane de chaque puits. Lorsque vous prenez des images, sélectionnez les champs à éviter la région touchée par l’aspirateur. Pour plus de 10 minutes d’incubation, couvrir la plaque 384 puits avec son couvercle pour éviter l’évaporation. Remarque : Les cellules sont fixées dans une pièce sombre pour éviter le Photoblanchiment de l’isorhodopsin régénérée qui aura une incidence sur le résultat du contrôle 100 %. Après la fixation, la plaque 384 puits peut être souscrite sous une lumière normale.</li>
	<li>Utilisez un aspirateur 8 voies pour aspirer la PFA dans chaque puits et utilisez une pipette multi-canaux électronique pour ajouter 50 μL par puits de PBS. Répétez deux fois plus d’effectuer trois lavages avec du PBS. Attention : Les déchets liquide contenant PFA sont collecté dans une bouteille à capsule et doit être éliminé comme un déchet chimique dangereux après l’expérience.</li>
	<li>Bloquer les cellules en ajoutant 20 µL / puits de 5 % de sérum de chèvre à l’ensemble plaque 384 puits et incuber à température ambiante pendant 30 min.</li>
	<li>Aspirer le sérum de chèvre 5 % et ajouter 15 µL / puits de 20 µg mL-1 B6-30 anti-rhodopsine anticorps dans le sérum de chèvre de 1 % à lignes A à O. ajouter 15 µL / puits de 1 % de sérum de chèvre au rang P pour le groupe de contrôle seulement anticorps secondaires.</li>
	<li>Incuber les plaques 384 puits à température ambiante pendant 90 min ou à 4 ° C jusqu’au lendemain. Couvrir la plaque 384 puits avec du papier aluminium pour éviter le Photoblanchiment des fluorophores.</li>
	<li>Laver la plaque 3 fois avec 50 µL / puits de PBS.</li>
	<li>Aspirer les PBS et ajouter 15 µL / puits de 5 µg mL-1 chèvre Cy3 conjugué d’IgG anticorps anti-souris. Couvrir la plaque 384 puits avec du papier aluminium et incuber à température ambiante pendant 1 h ou à 4 ° C durant la nuit.</li>
	<li>Laver la plaque 3 fois avec 50 µL / puits de PBS. Ajouter 50 µL / puits de PBS contenant 1 µg mL-1 Hoechst 33342 pour colorer les noyaux à température ambiante pendant 15 min.</li>
	<li>Sceller la plaque 384 puits avec un film transparent avant de l’imagerie. Couvrir la plaque 384 puits avec du papier aluminium et conserver à 4 ° C pendant une semaine, si les images sont prises immédiatement.</li>
</ol>5. l’imagerie.
Remarque : Cette procédure d’imagerie de haute teneur est adaptée au système d’imagerie répertorié dans la Table des matières. Procédures peuvent être différentes si vous utilisez d’autres systèmes d’imagerie de haute teneur.
<ol><li>Retirez le couvercle et mettre la plaque 384 puits en l’imageur haute teneur avec A1 positionné dans le coin supérieur gauche de la plaque.</li>
	<li>Ouvrez le logiciel d’acquisition image pour définir les paramètres d’acquisition d’images.<ol>
<li>Ouvrez la fenêtre paramètres d’Acquisition plaque et créer nouveau réglage ou charger un fichier de configuration existant.</li>
		<li>Sélectionner l’objectif 20 x et mis en place pixel binning 2 donc la taille en pixels calibré est 0,80 x 0,80 µm. définir les lignes de balayage comme 2 000 et la taille de l’image (W x H) comme 1 000 x 1 000 pixels (800.00 x 800.00 µm) par site.</li>
		<li>Sélectionnez le type de plaque pour être photographié. Utilisez les informations fournies par le fabricant de la plaque 384 puits pour remplir les dimensions de la plaque.</li>
		<li>Sélectionnez les puits à être photographiée pour la plaque 384 puits.</li>
		<li>Sélectionnez les quatre sites à être photographié par puits. Éviter le côté de la bien touché par les embouts d’aspiration.</li>
		<li>Sélectionnez des lasers à excitation comme 405, 488 et 561 nm. Sélectionnez filtres d’émission pour les canaux DAPI, FITC et Texas Red. Optimiser la puissance du laser et des gains de chaque voie pour assurer la luminosité des images prises par les puits de contrôle positif sont inférieures au seuil de saturation.</li>
		<li>Sélectionnez les puits à puits focus pour l’autofocus. Sélectionnez le premier puits acquis comme l’initiale bien pour trouver des échantillons. Sur tous les sites de site autofocus.</li>
		<li>Sélectionnez les quatre moyennes par ligne pour chaque canal. Optimiser la valeur de Z-offset pour chaque canal.</li>
		<li>Test 2-3 puits dans les coins en diagonales de la plaque 384 puits pour s’assurer que les images sont sur la mise au point pour tous les puits testés, images de tous les sites / puits ont des cellules avec plus de 40 % confluence et intensités de fluorescence de tous les canaux sont environ la moitié saturée à 100 % puits de contrôle.</li>
		<li>Enregistrer la méthode d’acquisition de l’image.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Exécutez la plaque entière. Regarder l’imageur jusqu'à ce qu’il termine à capturer des images de la première colonne de la plaque pour vérifier la qualité de l’image avant de quitter l’imageur. Retirez la plaque 384 puits et conserver à 4 ° C pour une utilisation future. Remarque : Selon le nombre de sites sélectionnés par les puits et les canaux de prise, il faut 40 min à 3 h pour finir une plaque 384 puits d’imagerie.</li>
</ol>6. image Analysis.
<ol><li>Extraire les données d’image à l’aide d’un logiciel d’analyse de haute teneur image. Sélectionnez l’un des puits de contrôle à 100 % (colonne 23) pour définir les paramètres.</li>
	<li>Sélectionner les Longueurs d’onde multiples cellule marquant comme la méthode d’analyse et de commencer à configurer les paramètres.<ol>
<li>Définir les noyaux à l’aide d’images de la chaîne DAPI. Obtenir un aperçu pour vous assurer que les formes de noyaux définis dans les sélectionnés bien cadre bien avec les images de noyaux.</li>
		<li>Définir la forme de cellule dans le chenal FITC où la rhodopsine-Vénus est imagé.</li>
		<li>Définir les zones de taches superficielles de cellules rhodopsine dans le chenal de Texas Red.</li>
		<li>Tester l’algorithme en cours dans 5 puits afin de déterminer si les paramètres sont optimisés. Enregistrer les paramètres et fermer la fenêtre de Configuration .</li>
	</ol>
</li>
	<li>Exécutez tous les puits avec la méthode d’analyse optimisée.</li>
	<li>L’exportation de Numéro d’objet comme le nombre de cellules intactes. Exporter l' Intensité moyenne du canal FITC comme intensité Rhodopsin-Venus (rhodopsine-Venus INT). Exporter l' Intensité moyenne du canal Texas Red comme l’intensité de la rhodopsine sur la surface de la cellule (rhodopsine INT sur la surface de la cellule).</li>
	<li>Ouvrez les données exportées dans un tableur. Diviser l’intensité de la rhodopsine sur la surface de la cellule par la rhodopsine-Vénus INT comme ratio de MEM-à-total. Calculer le Z'-facteurs pour chaque paramètre évaluer la qualité de l’analyse. Z′ = 1−3X (STDcontrôler 100 %+STDcontrol 0 %) / | Contrôle à 100 %−Mean0 % contrôle|. Remarque : Une Z'-facteur supérieur à 0 indique un dosage modéré suffisant pour un écran de haute teneur et un Z' facteur entre 0,5 et 1 suggère un dosage exceptionnel requis pour un écran de haut-débit20,21.</li>
	<li>Le logiciel permet de générer une carte de chaleur de deux couleurs pour chaque paramètre. Organiser le nom de lignées cellulaires sur l’axe des abscisses et les composés sur l’axe y.</li>
</ol>

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<li>Sung, C. H., Davenport, C. M., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+mutations+responsible+for+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa.+Clustering+of+functional+classes+along+the+polypeptide+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin mutations responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Clustering of functional classes along the polypeptide chain.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (35), 26645-26649 (1993).</li>
<li>Krebs, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+rhodopsin+retinitis+pigmentosa+and+the+efficacy+of+pharmacological+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of rhodopsin retinitis pigmentosa and the efficacy of pharmacological rescue.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (5), 1063-1078 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, nous avons montré un test d’imagerie haute teneur utilisé pour caractériser les hits identifiés d’une HTS L’automatisation seule impliquée dans ces protocoles est l’imageur de haute teneur. L’immunomarquage et imagerie de fluorescence de la rhodopsine ont été utilisés couramment pour caractériser la localisation de la rhodopsine5,14,15,16. Cependant, la quantification des images prises par...

Repliement est impliqué dans la dystrophie musculaire, dégénérescence neuronale, ainsi que des maladies aveuglantes, y compris une rétinite pigmentaire (RP)1. RP est une dégénérescence rétinienne héréditaire et progressive associée à des mutations dans plus de 60 gènes affectant la fonction et l’homéostasie des photorécepteurs de la tige ou les épithéliums pigmenté rétinien (RPE)2,3. Aucun traitement efficace n’est actuellement disponible pour RP. Les mutations de rhodopsine représentent environ 25-30 % d’autosomique dominante (ad) cas RP. Parmi les plus de 150 rhodopsine mutations4 (Human Gene Mutation Database, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), les mutations de la classe II causent l’instabilité structurelle de la protéine de la rhodopsine qui contribue à la mort de photorécepteur de tige et vision perte5,6,7,8. Le P23H est la mutation de la rhodopsine plus fréquente en Amérique du Nord, qui est aussi un exemple typique de la classe II rhodopsine mutations9,10. En raison de son instabilité structurelle inhérente, la rhodopsine mal repliée s’accumule dans le réticulum endoplasmique (re) dans les cellules de mammifères, alors que la rhodopsine de type sauvage est situé sur la membrane plasmique5. La rhodopsine mal repliée P23H expositions mutant dominant négative cytotoxicité qui ne résulte pas de SIM1, mais est liée à l’activation d’ER associés voie de dégradation des protéines et l’organisation du segment externe tige interrompu. Pour atténuer le stress de cellules photoréceptrices tige, une stratégie consiste à stabiliser le pliage native de la rhodopsine mutant à l’aide d’un chaperon pharmacologique.
Pour atteindre cet objectif, nous avons réalisé un écran de haut débit basés sur les cellules (EMD)11,12,13 à l’aide d’une analyse de complémentation de fragment de β-galactosidase à quantifier le mutant de rhodopsine P23H transporté sur le plasma membrane. Le protocole simple et robuste de ce test HTS nous a permis d’explorer les activités d’environ 79 000 petites molécules pour chaque écran. Toutefois, parce que ce dosage HTS lit les signaux de luminescence, faux positifs, y compris les inhibiteurs de la β-gal, composés colorés ou cytotoxiques sont inclus dans la liste de résultats en attente d’être identifiés par une analyse secondaire.
L’immunomarquage traditionnel et méthodes d’imagerie de fluorescence ont été utilisés pour les années d’étudier le transport de la rhodopsine dans les cellules de mammifères5,14,15,16. Cependant, ces méthodes conventionnelles ne peuvent servir à quantifier les effets pharmacologiques des composés de plus de 10 vers le transport de la rhodopsine, parce qu’une analyse d’imagerie fiable requiert un grand nombre d’images prises dans des conditions très cohérente, qui est pas amendables par les méthodes d’imagerie conventionnelles. Ici, nous avons développé un protocole d’imagerie de haute teneur immunostaining basé comme test secondaire pour quantifier le transport de surface cellulaire de rhodopsine mal repliées mutants11,13,17. Pour étiqueter rhodopsine sur la membrane plasmique, nous avons sauté l’étape de la perméabilisation de la membrane cellulaire et immunomarquage des mutants de la rhodopsine par un anticorps monoclonal anti-rhodopsine de (B6-30) reconnaissant l’épitope N-terminale de la rhodopsine du côté extracellulaire de la cellule membrane18. Pour visualiser la rhodopsine mutant dans la cellule entière, nous fondue rhodopsine avec la protéine de fluorescence de Vénus. De quantifier les intensités de fluorescence dans les canaux de fluorescence différents, nous sommes en mesure d’obtenir plusieurs paramètres d’une expérience unique dont l’intensité totale rhodopsine dans la cellule entière, sur la surface de la cellule et le ratio de fluorescence de rhodopsine sur la surface de la cellule à celle de la cellule entière. En appliquant cette méthode pour stabiliser les cellules exprimant un total de six mutants rhodopsine mal repliées, nous pouvons générer un profil pharmacologique de plusieurs petites molécules chaperons vers ces mutants. Dans ce protocole, toutes les cellules sont immunocolorées dans une plaque 384 puits et photographié à l’aide d’un système automatisé d’imagerie sous condition d’imagerie très cohérent. Une analyse de l’image est effectuée pour chaque puits, contenant des images de plus de 600 cellules pour réduire la variation due à l’hétérogénéité des cellules avec des variables de niveau d’expression de forme et de la protéine cellulaire. Le flux de travail de ce protocole est résumée dans la Figure 1. L’avantage de cette méthode est que nous obtenons images haute résolution ainsi que multiparamétriques quantifications de l’analyse axée sur l’image. En général, le présent protocole peut être modifié et appliqué pour quantifier le transport d’une protéine de membrane mal repliées d’intérêt.

<table><tbody><tr><td>Cellules U2OS (rhodopsine-Vénus)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Cellules stables générées à partir de cellules U2OS</td></tr><tr><td>Cellules U2OS (T4R-rhodopsin-Venus)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Cellules stables générées à partir de cellules U2OS</td></tr><tr><td>Cellules U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) Cellules</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Cellules stables générées à partir de cellules U2OS</td></tr><tr><td>Cellules U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) NA</td><td></td><td></td><td>Cellules stables générées à partir de cellules U2OS</td></tr><tr><td>Cellules U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus)</td><td>NA</td><td>NA Cellules</td><td>stables générées à partir de cellules U2OS</td></tr><tr><td>Cellules U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) NA</td><td></td><td>NA</td><td>Cellules stables générées à partir de cellules U2OS</td></tr><tr><td>U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) Cellules</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Cellules stables générées à partir de cellules U2OS</td></tr><tr><td>DMEM à haute teneur en glucose</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-500</td><td>Avec L-Glutamine, sodium pyruvate</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td>Plasmocin Inactivé par la chaleur</td></tr><tr><td></td><td>InvivoGen</td><td>ant-mpt</td><td>Réactif d’élimination des mycoplasmes</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (100X)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>100X solutions antibiotiques concentrées pour prévenir la contamination bactérienne des cultures cellulaires</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-510</td><td>0,25 %, 1mM EDTA dans HBSS sans calcium et magnésium</td></tr><tr><td>Solution de poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707-50ML</td><td>Mol poids 70,000-150,000, 0,01 %, stérile-filtré, BioReagent, adapté à la culture cellulaire</td></tr><tr><td>CellCarrier-384 Ultra Microplaques</td><td>PerkinElmer</td><td>6057300</td><td>Microplaques traitées à 384 puits de tissu avec des parois à puits noirs et un fond d’oléfine cyclique optiquement clair pour l’imagerie des cellules dans l’analyse</td></tr> <tr><td>à haut contenuPlaque stérile à 96 puits</td><td>Eppendorf</td><td>30730119</td><td>Culture tissulaire traitée avec couvercle à fond plat, stérile, exempte de pyrogènes détectables, de Rnase, de DNase et d’ADN. </td></tr><tr><td>Sailine tamponnée au phosphate non cytotoxique (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9625</td><td>10 x tampon PBS, pH 7,4</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td>>99,5 %, culture cellulaire testée</td></tr><tr><td>9-cis-retinal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5754</td><td></td></tr><tr><td>Composés testés</td><td>Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized</td><td>NA</td> Les <td>composés ont été achetés auprès de différents fournisseurs ou synthétisé sur mesure</td></tr><tr><td>B6-30 anticorps anti-rhodopsine</td><td>Novus</td><td>NBP2-25160</td><td>Don du Dr Krzysztof Palczewski</td></tr><tr><td>Cy3 conjugué chèvre anti-souris anticorps secondaire</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc</td><td>115-165-146</td><td></td></tr><tr><td>16 % paraformaldéhyde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>Sans méthanol</td></tr><tr><td>10 % Sérum de chèvre normal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50062Z</td><td>Tampon de blocage</td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Trihydroch</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>Solution de coloration nucléaire</td></tr><tr><td>Imageur à haut contenu</td><td>Dispositifs moléculaires</td><td>ImageXpress</td><td>ImageXpress&reg ; Système d’imagerie micro-confocal à haut contenu</td></tr><tr><td>Logiciel d’acquisition et d’analyse d’images à haut contenu MetaXpress</td><td>Dispositifs moléculaires Logiciel</td><td>d’acquisition et d’analyse d’images à haut contenu</td><td>MetaXpress</td></tr><tr><td>Pipette multicanaux (0,5-10 & micro ; L)</td><td>Rainin</td><td>17013802</td><td>Pipette manuelle à 8 canaux, 0,5-10 & micro ; L</td></tr><tr><td>Pipette multicanaux (0,5-10c</td><td>Rainin</td><td>17013805</td><td>Pipette manuelle à 8 canaux, 20-200 & micro ; L</td></tr><tr><td>Pipette électronique multicanaux (10-200 &mu ; L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>14-3879-56BT</td><td>Pipette électronique multicanal pour le pipetage de microplaques à 96 et 384 puits</td></tr><tr><td>Réservoir de réactifs</td><td>Genesee Scientific</td><td>28-125</td><td>Réservoir de réactifs pour distribution de pippte multicanaux</td></tr><tr><td>Aspirateur à 8 canaux</td><td>ABC Scientific</td><td>EV503</td><td>Adaptateur en acier inoxydable à 8 canaux pour l’aspiration de liquides à partir de plaques à 96 ou 384 puits</td></tr><tr><td>Excel tableur</td><td>Microsoft</td><td>Excel2016</td><td>Le tableur pour l’analyse de données et la génération de cartes thermiques</td></tr><tr><td>Origin2018 Logiciel d’analyse de données scientifiques et de graphiques</td><td>OriginLab</td><td>Origin2018</td><td>Le logiciel d’analyse de données pour générer les courbes dose-réponse</td></tr></tbody></table>

un dosage de transport rhodopsine par analyse de l’imagerie de haute teneur

A Rhodopsin Transport Assay by High-Content Imaging Analysis

Des mutations de rhodopsine pourrait conduisent à la mort de photorécepteur de tige qui se manifeste comme autosomique dominante rétinite pigmentaire (RP), un progressif aveuglante de maladie qui n’a pas de traitement efficace. Nous émettons l’hypothèse que la cytotoxicité du mutant rhodopsine mal repliées peut être atténuée en stabilisant pharmacologiquement la protéine mutante rhodopsine. La mutation de P23H, parmi les autres mutations de rhodopsine de classe II, code pour une protéine mutante rhodopsine structurellement instable qui s’accumule dans le réticulum endoplasmique (re), alors que la rhodopsine de type sauvage est transporté vers la membrane plasmique dans mammifères cellules. Précédemment, nous avons effectué un écran axée sur la luminescence de haut débit (HTS) et identifié un groupe de chaperons pharmacologiques qui a sauvé le transport de la rhodopsine P23H d’ER à la membrane plasmique. Ici, en utilisant une méthode d’immunomarquage suivie d’une analyse d’imagerie de haute teneur, nous avons mesuré la quantité de protéines mutantes rhodopsine dans la cellule entière et sur la membrane plasmique. Cette méthode est instructive et efficace pour identifier le vrais succès des faux positifs suite HTS En outre, l’analyse d’image haute teneur nous a permis de quantifier plusieurs paramètres d’une expérience unique pour évaluer les propriétés pharmacologiques de chaque composé. À l’aide de ce test, nous avons analysé l’effet de 11 différents composés vers six mutants de rhodopsine RP associé, obtention d’un profil pharmacologique 2D pour une compréhension quantitative et qualitative sur la stabilité structurelle de ces mutants rhodopsine et l’efficacité de différents composés vers ces mutants.

Nous avons caractérisé le transport de la rhodopsine avec trois paramètres : l’intensité de la rhodopsine-Venus dans la cellule entière (rhodopsine-Venus INT), l’intensité de l’immunomarquage de la rhodopsine sur la membrane plasmique (rhodopsine INT sur la surface des cellules) et le ratio de rhodopsin tache sur la surface de la cellule à l’intensité de la rhodopsine-Venus dans la cellule entière (Ratio de MEM-Total). Un résultat représentatif de l’essai de transport rhodopsine est montr...

Ici, nous avons décrit une méthode d’imagerie de haute teneur pour quantifier le transport des mutants de rhodopsine associée à une rétinite pigmentaire. Une analyse de notation d’onde multiples a été utilisée pour quantifier la protéine rhodopsin sur la surface de la cellule ou dans la cellule entière.

Un dosage de Transport rhodopsine par analyse de l’imagerie de haute teneur

Rhodopsin misfolding mutations lead to rod photoreceptor death that is manifested as autosomal dominant retinitis pigmentosa (RP), a progressive blinding ...

Le mauvais déroulement de rhodopsine cause la dégénérescence rétinienne progressive appelée pigmentosa de rétinite. Bien qu’une méthode d’imagerie traditionnelle aient une capacité limitée de quantifier le transport de rhodopsine, cet essai basé sur l’image nouvellement développé permet un criblage à haut débit, éliminant ainsi les faux positifs. Cette technique permet une évaluation rapide de la pharmacodynamique des médicaments.Dans l’œil de sauver le pliage de la rhodopsine pathogène, accélérant ainsi le potentiel d’un traitement pour la maladie tranquillement incurable et aveuglante, la rétinite pigmentaire. La localisation cellulaire d’une protéine membranaire est très importante pour sa fonction. Cette méthode peut être facilement modifiée et appliquée pour quantifier le transport de toute autre protéine membranaire d’intérêt.Assurez-vous de préparer une carte des plaques et d’ajouter et d’aspirer doucement le liquide de chaque puits de la plaque, afin de garder le numéro de cellule et les conditions d’état immuno compatibles entre les cellules. Cela donnera un facteur Z élevé, et des résultats fiables. Pour commencer, graine 5000 cellules par puits dans un fond noir muré, clair, poly lysine traitée 384-bien-plaque.Incuber la plaque à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de CO2 pendant trois heures pour que les cellules se fixent au fond de la plaque. Ensuite, utilisez une pipette multicanal pour ajouter 10 microlitres par puits de 5X solutions de travail, selon une carte de plaque prédéterminée comme celle montrée ici. Maintenant, ajoutez 10 microlitres par puits de 2%DMSO aux colonnes 22 et 24.En outre, ajouter 10 microlitres par puits de 25 micromolaires 9-cis-rétiniens à la colonne 23 dans une pièce sombre sous une faible lumière rouge. Une fois terminé le chargement de tous les différents composés d’essai, couvrir la plaque avec du papier d’aluminium, et incuber à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Sortez la plaque de 384 puits dans une pièce sombre avec une faible lumière rouge.Ici, à l’aide de 8 canaux-aspirateur, connecté à une bouteille de collecte sous vide, pour aspirer doucement le milieu des puits de la plaque. Ensuite, utilisez une pipette multicanal pour ajouter 20 microlitres par puits de paraformaldéhyde fraîchement préparé à l’ensemble de la plaque de 384 puits, et fixer les cellules pendant 20 minutes à température ambiante. Après fixation, placez la plaque dans la lumière normale.Là, utilisez un aspirateur à 8 canaux, pour aspirer le paraformaldéhyde dans chaque puits, et utilisez une pipette multicanal pour ajouter 50 microlitres par puits de PBS. Aspirer et remplacer le PBS pour un total de trois cycles de lavage. Ensuite, ajouter 20 microlitres par puits de 5% sérum de chèvre à chaque puits, et incuber la plaque à température ambiante pendant 30 minutes.Après incubation, aspirer les puits, et ajouter 15 microlitres de 20 microgrammes par millilitre B630 anticorps anti-rhodopsine, en sérum de chèvre 1% aux puits dans les rangées A à O.Next, ajouter 15 microlitres par puits de 1% sérum de chèvre à la rangée P pour le groupe témoin secondaire anticorps seulement. Incuber la plaque à température ambiante pendant 90 minutes, ou à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Ensuite, recouvrez la plaque de papier d’aluminium pour éviter le photobleaching des fluorophores.Ensuite, lavez la plaque trois fois avec 50 microlitres par puits de PBS. Après le dernier lavage, aspirer le PBS, et ajouter 15 microlitres par puits de cinq microgrammes par millilitre d’anticorps IgG de chèvre conjugué Cy3. Couvrir la plaque de papier d’aluminium et incuber les échantillons à température ambiante pendant une heure.Après l’incubation, laver la plaque trois fois. Ajouter ensuite 50 microlitres par puits de PBS, contenant un microgramme par millilitre de tache Hoechst à température ambiante pendant 15 minutes. Enfin, sceller la plaque de puits avec un film transparent, la couvrir de papier d’aluminium et la conserver à quatre degrés Celsius jusqu’à une semaine.Retirez le papier d’aluminium et placez la plaque d’échantillon dans un imageur à haute teneur, avec A1 placé sur le coin supérieur gauche de la plaque. Ensuite, ouvrez le logiciel d’acquisition d’images pour configurer les paramètres d’acquisition d’images. Ouvrez la fenêtre d’installation d’acquisition de plaque et créez un nouveau paramètre ou chargez un fichier d’installation existant.Sélectionnez l’objectif 20X et configurez le binning pixel comme deux, de sorte que la taille calibrée des pixels est de 0,80 par 0,80 microns. Ensuite, définissez les lignes d’analyse comme 2000, et la taille de l’image comme 1000 par 1000 pixels par site. Ensuite, sélectionnez le type de plaque à imager.Utilisez les informations fournies par le fabricant pour remplir les dimensions de la plaque. Maintenant, sélectionnez les puits à imager avec quatre sites à image par puits. Évitez le côté du puits, qui sont touchés par les pointes d’aspiration.Pour l’imagerie, sélectionnez des lasers à excitation comme 405, 488 et 461 nanomètres. Ensuite, sélectionnez les filtres d’émission pour les canaux DAPI, FITC et Texas Red. Optimisez la puissance laser et les gains de chaque canal, pour vous assurer que les puits de contrôle positifs ne sont pas saturés.Sélectionnez bien pour bien se concentrer pour l’auto-focus. Ensuite, sélectionnez le puits initial à acquérir, et définissez le site auto-focus pour tous les sites. En outre, sélectionnez quatre moyennes par ligne pour chaque canal, et optimisez la valeur z-offset pour chaque canal.Valider, que tout est correctement mis en place, en testant d’abord deux à trois puits aux coins de la plaque, pour s’assurer que les images sont au point pour tous les puits testés. Ensuite, vérifiez que les images de tous les sites par puits ont des cellules avec plus de 40% de confluence. Enfin, vérifiez que les intensités de fluorescence dans tous les canaux sont toutes à peu près à moitié saturées dans les puits de contrôle à 100 %.Ensuite, enregistrez la méthode d’acquisition d’image et exécutez l’ensemble de la plaque. Regardez l’imageur jusqu’à ce qu’il fine la capture d’images à partir de la première colonne de la plaque pour vérifier la qualité de l’image avant de quitter l’imageur. Une fois terminée, retirez la plaque et rangez-la à quatre degrés Celsius pour une utilisation future.Retirez les données d’image à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image à contenu élevé. Sélectionnez l’un des puits de contrôle à 100 % de la colonne 23 pour configurer les paramètres. Tout d’abord, sélectionnez la notation des cellules multi-longueurs d’onde comme méthode d’analyse, et commencez à configurer les paramètres supplémentaires.Définissez les noyaux à l’aide d’images du canal DAPI. Aperçu, pour s’assurer que les formes de noyaux définis dans le puits sélectionné s’intègre bien avec les images noyaux. Ensuite, définissez la forme de la cellule dans le canal FITC, où Rhodopsin Vénus est photographiée.Pour ce faire, configurer les diamètres minimum et maximum de chaque cellule, l’intensité minimale de fluorescence au-dessus de l’arrière-plan, ainsi que la zone minimale de chaque cellule. Maintenant, définissez les zones de tache de surface de cellules de rhodopsine dans le canal rouge du Texas, en installant les diamètres mini et maximum de forme de cellules, l’intensité de fluorescence de minium au-dessus du fond, aussi bien que la zone minimale de chaque cellule souillée. Testez l’algorithme actuel dans cinq puits pour déterminer si les paramètres sont optimisés.Ensuite, enregistrez les paramètres et fermez la fenêtre de configuration. Exécutez tous les puits avec la méthode d’analyse optimisée. Une fois terminé, exportez le numéro d’objet comme numéro de cellule intact.Exportez l’intensité moyenne du canal FITC comme intensité rhodopsine vénus, et exportez l’intensité moyenne du canal rouge du Texas sous forme d’intensité rhodopsine à la surface cellulaire. Utilisez le logiciel de feuille de calcul pour générer une carte thermique en deux couleurs pour chaque paramètre. Disposer le nom des lignes cellulaires sur l’axe x, et les composés sur l’axe Y.Ici, nos images de P23H rhodopsine Vénus traité cellules U2OS, exprimant la fluorescence vénus en vert, et la surface cellulaire immuno-coloration en rouge. Les cellules ont été traitées avec DMSO ou cinq micromolaires 9-cis-rétiniens. L’analyse de transport de rhodopsine, comparant la quantité de rhodopsine dans la cellule entière dans diverses conditions, montre une récupération significative dans la ligne de cellule mutante de P23H, une fois traitée avec 9-cis-rétinien.En outre, l’intensité de rhodopsine sur la surface de cellules, et le rapport de la tache de rhodopsine sur la surface de cellules à l’intensité de Vénus de rhodopsine dans la cellule entière, ne sont pas sensiblement inférieurs pour le mutant de P23H, comparé au rhodopsin sauvage traité avec DMSO. Une carte thermique est un moyen efficace de comparer la quantité moyenne de rhodopsine et la localisation par cellule à travers plusieurs mutants. Ici, les contrôles de wildtype et six mutants de rhodopsine sont énumérés horizontalement, et les effets des traitements composés sont comparés verticalement.En accord avec les études précédentes, l’intensité de rhodopsine sur la surface de cellules et le rapport de la tache de rhodopsine sur la surface de cellules à l’intensité de Vénus de rhodopsine sont plus bas pour les six mutants comparés au type sauvage traité avec DMSO. Composés un, deux, six et neuf significativement augmenté le rapport de la tache de rhodopsine sur la surface cellulaire à l’intensité de Vénus rhodopsine dans T4R, P23H, D190N, et P267L mutants rhodopsine, suggérant que ces composés sauver le transport de ces mutants rhodopsine à la membrane plasmatique. Gardez à l’esprit que les cellules doivent être entre 50 et 70% confluent avant la fixation, car cela est essentiel pour l’analyse d’image.En outre, nous avons montré des images d’un puits à travers toute la plaque. Assurez-vous, que les images au point, et que la fluorescence, qui ne sortent pas, ont toute la valeur seuil pour n’importe quel canal. Jusqu’à un composé de sélection, qui sauvent le transport malfolded de rhodopsine, nous pouvons valider le processus, puis passer l’efficacité de ces composés in vivo, utilisant un modèle de souris exprimant le mutant de P23H de rhodopsine.Cette méthode nous permet de quantifier la quantité de protéines membranaires et sa localisation. Par conséquent, c’est un excellent outil pour la micro erreur commencée sur la protéine membranaire par aide enregistrer et la dégradation. Le paraformaldéhyde, comme c’est le cas dans cette expérience, a des procédures impliquant la manipulation de ce reagent.Ce sera fait sous le capot. Les déchets, y compris ce reagent, doivent être éliminés correctement comme un produit chimique dangereux.

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