Name: Établir des lignées de cellules surexprimant DR3 afin d’évaluer la réponse apoptotique thérapeutique anti mitotique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Découvrez comment établir des lignées cellulaires surexprimant DR3 par infection rétrovirale pour étudier l'apoptose induite par les antimiotiques. Ces outils permettent d'analyser les mécanismes de mort cellulaire in vitro et in vivo.

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Ce travail a été soutenu par les subventions 53110000117 (à G.W.) et 043222019 (à X.W.) de l’Université Tsinghua.

Veuillez noter que toutes les expériences de souris décrits ici ont été approuvés et interprétés conformément aux institutionnels animalier et utilisation Comité (IACUC) à l’Université Tsinghua.
1. génération de lignées de cellules de surexpression DR3
<ol><li>Construire le plasmide pour expression DR3 (pMXs-IRES-DR3-FLAG) en insérant des ADNc DR3 complet avec 3 x drapeau à l’extrémité C-terminale en vecteur rétroviral pMXs-IRES-Blasticidine sur les sites de restriction de BamHI/XhoI.</li>
	<li>La croissance de cellules de Plat-A dans les boîtes de 60 mm avec 4 mL de milieu de l’aigle modifié de Dulbecco (DMEM). Le lendemain, quand les cellules atteignent 80 % - 90 % confluence, transfecter les cellules avec 2 μg de plasmide pMXs-IRES-DR3-pavillon utilisant le réactif de transfection (voir Table des matières) selon manuel20 les directives du fabricant.</li>
	<li>Après 72 h, recueillir le surnageant, le média à l’aide d’un filtre de 0,45 μm stérile le filtrat et garder la suspension virale dans l’obscurité à 4 ° C.</li>
	<li>La croissance de cellules HT29 en DMEM dans un plat de 60 mm et incuber les cellules à 37 ° C, avec 5 % de CO2.</li>
	<li>Le lendemain, quand les cellules atteignent 30 % - 50 % confluence, infectent les cellules avec 2 mL de suspension virale en présence de 8 μg de 1, 5-diméthyl-1, 5-diazaundecamethylene polymethobromide par millilitre de suspension virale. Après 4-6 h d’incubation à 37 ° C, aspirer la suspension virale, ajouter 4 mL de DMEM fraîche et remettez le plat dans l’incubateur.</li>
	<li>Jetez les médias de la vaisselle 24 h après l’infection et se laver soigneusement les cellules avec 2 mL de PBS préchauffée. Ajouter 1 mL de trypsine-EDTA dans les cellules et incuber à 37 ° C pendant 3 min.</li>
	<li>Après avoir observé au microscope au grossissement de X 10 qui ont enlevé la plupart des cellules, arrêter la trypsinisation avec 2 mL de DMEM complet contenant 10 % de sérum bovin fœtal (SVF). Recueillir la suspension de cellules dans un tube de 15 mL et centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min à température ambiante (RT).</li>
	<li>Retirez le surnageant et resuspendre le culot dans 10 mL de DMEM. Bien mélanger en doucement pipetage de haut en bas. Diluer les cellules par un facteur de 30, 100 et 300. Les cellules dans les plats de 150 mm avec 20 mL de DMEM contenant 1 µg/mL blasticidine les semences. Incuber à un incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO2 pendant environ 1 à 2 semaines.</li>
	<li>Durant cette période, observer les colonies tous les jours avec un microscope inversé à un grossissement de 10 X. Marquer les colonies bien isolés au fond du plat lorsque le diamètre des colonies est d’environ 1-2 mm.</li>
	<li>Aspirer le milieu et laver les cellules avec 3 mL de PBS préchauffé. Ajouter 2 millilitres de trypsine-EDTA dans un plat de 60 mm. Utiliser une pince stérile pour ramasser des cylindres de clonage stériles autoclavables et placez-les dans le plat de 60 mm. Ramasser les bouteilles contenant de la trypsine-EDTA et placez-les délicatement sur les colonies marquées. Assurez-vous que chaque cylindre clonage seulement contient une colonie et éviter toute contamination avec des colonies voisines.</li>
	<li>Remettez le plat dans l’incubateur pendant 3 minutes.</li>
	<li>Après 3 min, vérifier les cellules au microscope au grossissement de 10 X pour voir si ils ont détaché. Lorsque les cellules ont levé, ajouter 70 μL de milieu de culture pour chaque cylindre pour inactiver la trypsine. Mélanger délicatement la suspension cellulaire avec une pipette μL 200. Veillez à ne pas déplacer le cylindre au cours de ce processus.</li>
	<li>Transférer la suspension cellulaire de chaque colonie à deux plaques 24 puits contenant 1 mL de DMEM / puits. Ajouter 30 μL de la suspension de cellules par puits dans la plaque A et 70 μL dans le puits en plaque B. étiquette les plaques correctement et les replacer dans l’incubateur.</li>
</ol>2. la vérification de la lignée de cellules de surexpression DR3
<ol><li>Lorsque les cellules de la plaque B sont à 90 % confluence, retirez le support et se laver soigneusement les cellules avec 1 mL de PBS. Complètement supprimer PBS et lyser les cellules avec 50 μL de 1 x tampon de charge SDS-PAGE. Transférer les lysats de cellules de la plaque 24 puits à tubes à centrifuger 1,5 mL et faire bouillir les échantillons pendant 10 min à 100 ° C.</li>
	<li>Exécuter les échantillons sur le gel de sulfate (SDS) 10 % sodium dodécyl à une tension constante de 80 V pendant 15 min, puis à 120 V pendant 1 h.</li>
	<li>La protéine de transfert sur une membrane de polyfluorure de vinylidène (PVDF) par transfert humide à un courant constant de 400 mA pendant 2 h.</li>
	<li>Tester l’expression DR3 dans différents clones avec anticorps anti-drapeau, en utilisant les cellules HT29 de sauvage comme témoin négatif (Figure 1). Diluer l’anticorps primaire par un facteur de 5 000 à 5 % de lait qui est dissous dans un mélange TBST (tampon Tris salin contenant 0,1 % Tween-20). Incubez la membrane avec anticorps drapeau à 4 ° C durant la nuit.</li>
	<li>Nettoyer la membrane avec un mélange TBST en se secouant sur un agitateur décoloration à 200 tr/min à RT. actualiser la TBST toutes les 5 min pour un total de temps de 15 min de lavage.</li>
	<li>Incuber la membrane avec l’anticorps secondaire anti-souris dilué par un facteur de 10 000 à 5 % de lait à 4 ° C pendant 5 à 6 h.</li>
	<li>Laver la membrane marche, comme décrit à l’étape 2.5.</li>
	<li>Détecter l’expression de drapeau en utilisant des substrats de chimiluminescence améliorée occidentale (ECL) et de la membrane avec un système de documentation de gel d’image (voir la Table des matières). Identifier les clones exprimant DR3 comme les clones positifs.</li>
	<li>Transférer les clones en plaque A qui correspondent à des clones positifs dans plaque B pour une plaque 6 puits et continuent à amplifier les cellules jusqu'à leur culture dans les plats de 10 cm. Faire des stocks congelés des cellules en croissance de clones positifs et les stocker à-80 ° C pour une utilisation future.</li>
</ol>3. évaluation de la réponse apoptotique des cellules aux Agents antimitotiques
Remarque : Diazonamide est une nouvelle classe de produit naturel marin qui a une activité remarquable pour inhiber la croissance des cellules cancéreuses, qui reflète les autres agents de tubuline-déstabiliser21. Cependant, son mode d’action reste peu clair. Pour tester la réponse cellulaire des cellules aux agents antimitotiques, paclitaxel et diazonamide ont été utilisés pour traiter les cellules HT29 sauvage et cellules HT29-DR3. Les médicaments ont été dissous dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) à faire des stocks de 10 mM et, ensuite, plus dilués à des concentrations différentes : 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1 000 nM, 3 000 nM et 10 000 nM dans le DMSO.
<ol><li>Prélever des cellules HT29 et HT29-DR3 par trypsinisation. Mesurer la densité des cellules à l’aide d’un compteur de cellule automatique. Ensuite, les semences les cellules en plaques de 12 puits en DMEM à une densité de 3 x 104 cellules par puits. Le lendemain, ajoutez 10 nM diazonamide et utilisez 1 % DMSO comme témoin négatif. Après 48 h de traitement, l’image des cellules au microscope au grossissement de 10 X (Figure 2).</li>
	<li>Semences HT29 et HT29-DR3 cellules dans des plaques de 96 puits en DMEM avec une densité de 3 x 103 cellules / puits et leur permettre de passer une nuit à 37 ° C. Puis, ajoutez les concentrations diazonamide-escalade de dose de 0,3 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM et 100 nM dans chaque puits, en utilisant 1 % DMSO comme témoin négatif.</li>
	<li>Après 48 h de traitement, mesurer la viabilité des cellules à l’aide d’une trousse viabilité cellulaire axée sur la luminescence selon le manuel du constructeur.<ol>
<li>Retirez la plaque à 96 puits de l’incubateur et laissez-le reposer à RT pendant environ 30 min. Puis, ajouter 50 µL de réactifs de dosage dans chaque puits, secouez la plaque au RT pendant 2 min à lyser les cellules et incuber la plaque à RT pour un autre 10 min. Déterminez la luminescence de chaque puits à l’aide d’un lecteur de microplaques (Figure 3). Remarque : La viabilité cellulaire représente l’intensité de luminescence relative de chaque bien à celle du contrôle bien traité avec 1 % DMSO.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilisez âgés de six semaines souris femelles BALB/c nues pour un in vivo étude14. Remarque : Les souris ont été maintenues dans des conditions spécifiques exempts de micro-organismes pathogènes.<ol>
<li>Trypsinize cellules HT29 et HT29-DR3 et, ensuite, arrêter la trypsinisation utilisant DMEM préchauffé à 37 ° C. Recueillir la suspension de cellules dans un tube de 50 mL et centrifuger les cellules à 1 000 tr/min pendant 10 min à RT. jeter le surnageant et resuspendre le culot dans un milieu DMEM sans FBS. Centrifuger les cellules à nouveau et resuspendre le culot dans du PBS.</li>
		<li>Compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellule automatique et diluer les cellules à une concentration de 2,5 x 107 cellules/mL à l’aide de PBS. Générer des tumeurs grâce à une injection sous-cutanée de 200 μl de la suspension de cellules HT29 ou HT29-DR3 dans le flanc droit de chaque souris (5 x 106 cellules/souris)22.</li>
		<li>Mesurer le volume de la tumeur (TV) avec étriers tous les 2 jours après la transplantation. Calculer la TV en utilisant la formule suivante : TV = 1 / 2L x l x P (ici, w : largeur de tumeur, l : longueur de la tumeur). Lorsque le volume tumoral moyen atteint environ 100 mm3, alternez les souris dans le contrôle ou le groupe traité (n = 6 par groupe) et initier le traitement.</li>
		<li>Préparer la solution de paclitaxel comme suit. Tout d’abord, dissoudre paclitaxel complètement dans l’éthanol à 5 % du volume total et, ensuite, ajouter l’huile de ricin hydrogénée de 5 % du volume final de polyoxyl 35. Enfin, composent les 90 % restants du volume avec D5W (dextrose 5 % dans l’eau, pH 7,4).</li>
		<li>Injecter le paclitaxel par voie intraveineuse à la dose de 20 mg/kg 3 fois par semaine pendant deux semaines. Mesurer la tumeur volume et le poids corporel 3 x une semaine14. Fin de l’expérience et l’euthanasier les animaux si le poids du corps diminue de 20 % ou le volume de la tumeur atteint environ 2 000 mm3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à déclarer.

Dans ce manuscrit, nous décrivons une méthode pour produire des lignées cellulaires stables HT29-DR3. Les cellules HT29-DR3 fournissent un modèle pour étudier les mécanismes moléculaires par lesquels DR3 contribue à l’apoptose induite par des agents antimitotiques. Cette approche est souple et répétable. Pour assurer le succès de la procédure, quatre étapes clés du protocole ont besoin à prendre en considération. Tout d’abord, afin de produire un haut assez titre de virus, il est recommandé d’effectuer la transfection d’...

Expression de gène hétérologue est souvent employée pour étudier la fonction des gènes d’intérêt. Deux méthodes, transfection stable et transitoire, sont principalement utilisés dans les cellules et biologie moléculaire pour insérer un segment d’ADN ou d’ARN dans la cellule hôte1,2. Transfectées transitoirement l’ADN ou l’ARN ne peut être passé les cellules filles, donc la modification génétique seulement peut être conservée que pendant une courte période de temps. En revanche, dans les cellules transfectées de façon stable, gène exogène est intégrés dans le génome de cellule hôte, maintenir son expression dans la lignée cellulaire. Transfection stable est donc une méthode qui est habituellement réservée pour la recherche sur la régulation génétique à long terme. La lignée cellulaire stable peut également être transplantée xénogreffes dans des modèles murins pour in vivo étude3. Transfection stable peut être divisée en deux catégories : virales et nonviral. Par rapport à la transfection nonviral, infection virale peut transférer des gènes dans une plus grande variété de cellules humaines avec une efficacité plus élevée4,5,6,7. En outre, une lignée cellulaire stable d’un seul clone offre l’avantage de l’homogénéité et la pureté clonale.
Division et la croissance cellulaire incontrôlée sont les plus caractéristiques du cancer. En milieu clinique, agents antimitotiques sont les principaux traitements pour de nombreux types de tumeurs,8. Toutefois, certaines limitations importantes des agents antimitotiques ne peuvent être ignorées. Tout d’abord, ces chimiothérapies peuvent aussi tuer les cellules normales ainsi que les cellules cancéreuses indésirables et, par conséquent, peuvent entraîner des effets secondaires graves8. Deuxièmement, antitubulines médicaments ne sont pas efficaces contre tous les types de tumeurs, malgré l’expression omniprésente de tubuline dans une grande variété de différents tissus comme une protéine du cytosquelette9,10. On se demande pourquoi des agents antitubulines a montré une efficacité prometteuse contre ovaire, poumon et les cancers hématologiques traitement clinique, mais pas dans le rein, du côlon ou de cancers du pancréas11. Enfin, même les patients avec le même type de tumeur peuvent répondre aux antimitotiques différemment de manière imprévisible. Il peut y avoir d’une molécule effectrice clés qui affecte la sensibilité des différents patients aux agents antimitotiques, aboutissant à des résultats divers vus dans le traitement clinique12. Ainsi, la sensibilité différentielle potentielle des patients aux traitements antimitotiques devrait prendre en considération afin d’optimiser les interventions thérapeutiques13.
Un écran de bibliothèque haut débit du génome entier siARN ont démontré que DR3 knockdown pourrait rendre les cellules sensibles résistants aux médicaments antimitotiques, impliquant un rôle pour DR3 dans l’apoptose induite par la chimiothérapie,14. En tant que membre de la superfamille des récepteurs (TNFR) facteur de nécrose tumorale, DR3 a été signalé à la médiation de l’apoptose des cellules dans divers systèmes15,16,17,18. Ainsi, nous avons entrepris d’établir des lignées stables surexprimant DR3 afin d’étudier les mécanismes moléculaires par lesquels les drogues antimitotiques induisent l’apoptose. Un modèle de cellule approprié pour étudier la surexpression DR3 peut être fourni par la lignée de cellules cancéreuses du côlon humain HT29, qui s’est avéré déficient DR3. En outre, dans la clinique, les cancers du côlon sont insensibles à la drogue antimitotique19.
Dans cet article, nous décrivons une méthode qui permet la génération d’une lignée HT29-DR3 stable par infection rétrovirale. De plus, nous montrons comment valider l’expression DR3 dans ces cellules à l’aide de western blot et évaluer la sensibilité aux agents antimitotiques en utilisant une analyse de viabilité de cellules et l’observation morphologique. Les cellules sont amplifiés de simples clones et, ainsi, ont l’avantage d’un patrimoine génétique homogène. En outre, l’étiquette d’indicateur sur DR3 autorisés pour la visualisation de DR3 cellulaire par microscopie et analyse d’interaction de protéine et de l’expression de gène par des approches biochimiques. En outre, les cellules peuvent être initialement chez les souris pour poursuivre l’analyse en réponse aux antimitotiques in vivo14la progression tumorale.
Le système des cellules HT29-DR3 présenté ici offre un outil efficace pour étudier les mécanismes moléculaires de comment antimitotiques kill cancer cellules14. Étant donné que la surexpression et lignées cellulaires knockdown sont des outils communs pour l’étude de la fonction du gène, ce protocole peut être adapté facilement aux autres gènes d’intérêt ou d’autres lignées cellulaires et, ainsi, transformé en une approche largement utilisée.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>C11965500BT</td><td>Complété par 10 % de FBS et 1 % de péniciline/streptomycine</td></tr><tr><td>Essai de viabilité cellulaire luminescente</td><td>Promega</td><td>G7571</td><td></td></tr><tr><td>Paclitaxel</td><td>Selleck</td><td>S1150</td><td></td></tr><tr><td>pMXs-IRES-Blasicidin</td><td>Cell Biolabs</td><td>RTV-016</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxyde</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>C14190500BT</td> Trypsine-EDTA (0,25 %)Invitrogen 25200056 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5-Diméthyl-1,5-diazaundécaméthylène polyméthobromure Santa</td><td>Cruz</td><td>sc-134220</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Réactif de transfection</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire anti-souris</td><td>Jackson ImmumoResearch</td><td>115-035-166</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-Flag</td><td>Sigma</td><td>F-3165</td><td></td></tr><tr><td>Lignée cellulaire HT29 ATCC</td><td></td><td>HTB-38</td><td></td></tr><tr><td>plat-A Lignée cellulaire</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-102</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Immobilon-P</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Cylindre de clonage</td><td>Sigma</td><td>C1059</td><td></td></tr><tr><td>Imagerie cellulaire Lecteur multimode</td><td>Biotek</td><td>BTCYT3MV</td><td></td></tr><tr><td>CKX53 Microscope inversé</td><td>Olympus</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire 12 puits</td><td>Nest</td><td>712001</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Plaques de culture cellulaire</td><td>Nest</td><td>705001</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubes à centrifuger</td><td>Nest</td><td></td><td></td>601052</tr><tr><td>0,22 &mu ; Filtre à particules</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>5810000327</td><td></td></tr><tr><td>96 puits Microplaque en polystyrène blanc&nbsp ;</td><td>Corning</td><td>3903</td><td></td></tr><tr><td>Western ECL Substrat</td><td>BIO-RAD</td><td>1705060</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000</td><td>GE Healthcare</td><td>ImageQuant LAS 4000&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Shaker décolorant&nbsp ;</td><td>HINOTECH</td><td>TS-2000A</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-bl-1</td><td></td></tr><tr><td>Compteur de cellules automatisé</td><td>BIO-RAD</td><td>TC 20</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Sérum réduit</td><td>Medium Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td></td></tr></tbody></table>

Établir des lignées de cellules surexprimant dr3 afin d’évaluer la réponse apoptotique thérapeutique anti mitotique

Establishing Cell Lines Overexpressing DR3 to Assess the Apoptotic Response to Anti-mitotic Therapeutics

Étudier la fonction d’un gène d’intérêt est possible en manipulant son niveau d’expression, comme diminuant son expression avec des lignées cellulaires démontable ou augmentant son expression avec des lignées de cellules surexpression. Transfection stable et transitoire sont deux méthodes qui sont souvent utilisés pour l’expression des gènes exogènes. Transfection transitoire n’est utile pour l’expression à court terme, alors que transfection stable permet un gène exogène à intégrer dans le génome de la cellule hôte où il devra être exprimée en permanence. En conséquence, transfection stable est habituellement employée pour la recherche sur la régulation génétique à long terme. Nous décrivons ici un protocole simple pour générer une lignée cellulaire stable surexprimant le récepteur mort étiqueté 3 (DR3) à explorer la fonction DR3. Nous avons choisi des clones unique après une infection rétrovirale afin de maintenir l’homogénéité et la pureté des lignées cellulaires stables. Lignées cellulaires stables générées à l’aide de ce protocole rendent les cellules HT29 DR3-deficient sensibles aux drogues antimitotiques, reconstituant ainsi la réponse de l’apoptose dans les cellules HT29. En outre, l’étiquette d’indicateur sur DR3 compense l’absence de bons anticorps DR3 et facilite l’étude biochimique du mécanisme moléculaire par lequel les agents antimitotiques induisent l’apoptose.

Une caractérisation des cellules HT29 exprimant de manière stable DR3 est illustrée à la Figure 1. Les clones expriment des niveaux variables de DR3, tandis que les cellules de type sauvage, qui servent comme témoin négatif, ne montrent pas l’expression du gène exogène. Ici, nous ne montrons que cinq clones, parmi lesquelles cloner 1 et 5 expriment le plus haut niveau de DR3. Nous avons choisi clone 1 et 5 pour les expériences suivantes.
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Établissant une lignée cellulaire stable surexprimant un gène d’intérêt d’étudier la fonction du gène peut être fait par stables clones unique de transfection-cueillette après les transfectants via une infection rétrovirale. Ici, nous montrons que les lignées de cellules HT29-DR3 générées de cette manière élucider les mécanismes par lequel la mort récepteur 3 (DR3) contribue à l’apoptose induite par antimitotiques.

Établir des lignées de cellules surexprimant DR3 afin d’évaluer la réponse apoptotique thérapeutique anti mitotique

Studying the function of a gene of interest can be achieved by manipulating its level of expression, such as decreasing its expression with knockdown cell ...

La surexpression des gènes dans les cellules est un moyen important d’étudier la fonction génétique. La transfection stable avec le rétrovirus permet d’intégrer des gènes endogènes dans le génome hôte et de s’exprimer en permanence. Nous avons ramassé des colonies simples de l’infection rétrovirale et généré des lignées cellulaires stables surexprimant flag-marqué DR3.Les lignées cellulaires ont compensé l’indisponibilité d’un bon anticorps DR3 et fourni d’excellents outils pour l’étude de la fonction DR3 post in vitro et in vivo. Nous avons généré les lignées cellulaires de surexpression DR3 en ramassant une seule colonie de l’infection rétrovirale. Les lignées cellulaires d’une seule colonie pourraient maintenir l’homogénéité et la pureté.En outre, le protocole est facile et simple à manipuler. Pour commencer cette procédure, faire pousser les cellules plat-A pendant la nuit dans des plats de 60 millimètres avec quatre millilitres de DMEM. Lorsque les cellules atteignent 80 à 90% de confluent, utilisez le réaccente de transfection pour les transfectionr avec deux microgrammes du plasmide construit tel que décrit dans le manuel du fabricant.Après 72 heures, recueillir le surnatant. À l’aide d’un filtre stérile de 0,45 micromètre, filtrez les médias et gardez la suspension virale dans l’obscurité à quatre degrés Celsius. Ensuite, cultivez des cellules HT29 pendant la nuit dans un plat de 60 millimètres avec DMEM, incubant les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.Lorsque les cellules atteignent 30 à 50% de confluence, infectez-les avec deux millilitres de suspension virale en présence de huit microgrammes de polybrene par millilitre de suspension virale. Incuber les cellules infectées à 37 degrés Celsius pendant quatre à six heures. Ensuite, aspirez la suspension virale.Ajouter quatre millilitres de DMEM frais et remettre le plat à l’incubateur. À 24 heures après l’infection, retirer les médias de la vaisselle et laver soigneusement les cellules avec deux millilitres de PBS préchauffé. Ajouter un millilitre de trypsine EDTA, et incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant trois minutes.À l’aide d’un microscope à 10 fois grossissement, observez les cellules pour s’assurer que la plupart d’entre elles se sont détachées. Après cela, ajouter deux millilitres de DMEM contenant 10%FBS pour arrêter la trypsinisation, et de recueillir la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres. Centrifugeuse à 200 fois g pendant cinq minutes à température ambiante, et enlever le surnatant.Suspendre à nouveau la pastille cellulaire dans 10 millilitres de DMEM et pipette doucement de haut en bas pour mélanger. Ensuite, diluer les cellules par des facteurs de 30, 100 et 300. Les graines des cellules sont des plats de 150 millimètres qui contiennent chacun 20 millilitres de DMEM contenant de la blasticidine à une concentration d’un microgramme par millilitre.Incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant environ une à deux semaines. Pendant cette période, utilisez un microscope inversé à 10 fois le grossissement pour observer les colonies chaque jour. Marquez les colonies bien isolées au fond du plat lorsque le diamètre des colonies est d’environ un à deux millimètres.Lorsque la période d’incubation est terminée, aspirer le milieu et laver les cellules avec trois millilitres de PBS préchauffé. Ajouter deux millilitres de trypsine EDTA dans un plat de 60 millimètres. Utilisez des forceps stériles pour ramasser les cylindres stériles de clonage autoclavés et les placer dans le plat.Ensuite, prenez les cylindres qui contiennent maintenant chacun environ 30 microlitres de trypsine EDTA, et placez-les doucement sur les colonies marquées. Remettre le plat à l’incubateur pendant trois minutes. Après cela, vérifiez les cellules au microscope pour s’assurer qu’elles se sont détachées.Lorsque les cellules se sont levées, à 70 microlitres de culture moyenne à chaque cylindre pour inactiver la trypsine. Utilisez une pipette de 200 microlitres pour mélanger délicatement la suspension cellulaire, en vous assurant de ne pas déplacer le cylindre pendant le mélange. Mettez en place deux plaques de 24 puits, et étiquetez-les plaque A et plaque B.Ajouter un millilitre de DMEM à chaque puits.Ajouter 30 microlitres de suspension cellulaire à chaque puits de la plaque A et ajouter 70 microlitres aux puits correspondants de la plaque B.Placez les plaques dans l’incubateur. Lorsque les cellules de la plaque B sont à 90% confluent, retirez le média et lavez soigneusement les cellules avec un millilitre de PBS. Retirer complètement le PBS et ajouter 50 microlitres de tampon de chargement 1X SDS-PAGE pour lyser les cellules.Après cinq minutes, transférer le lysate cellulaire de la plaque de 24 puits à des tubes de centrifugeuse de 1,5 millilitre. Faire bouillir les échantillons à 100 degrés Celsius pendant 10 minutes. Faire fonctionner les échantillons sur du gel 10% SDS à une tension constante de 80 volts pendant 15 minutes, puis à 120 volts pendant une heure.Ensuite, transférez la protéine à une membrane de fluorure polyvinylidene par transfert humide à un courant constant de 400 milliamps pendant deux heures. Diluer l’anticorps primaire par un facteur de 5000 dans 5% de lait non gras dissous dans le TBST. Ajouter l’anticorps FLAG à la membrane et incuber à quatre degrés Celsius pendant la nuit.À l’aide d’un shaker décoloré réglé à 200 RPM, laver la membrane avec le TBST pendant 15 minutes, en rafraichissant le TBST toutes les cinq minutes. Ensuite, diluer un anticorps secondaire anti-souris par un facteur de 10 000 dans 5% de lait non gras. Incuber la membrane avec un anticorps secondaire dilué à quatre degrés Celsius pendant cinq à six heures.Lavez la membrane sur le shaker décolorant à nouveau comme décrit précédemment. Après cela, utilisez la chemiluminescence améliorée occidentale et un système de documentation de gel pour imager la membrane et détecter l’expression flag. Tout d’abord, recueillir à la fois HT29 et HT29-DR3 cellules par trypsinisation, et utiliser un compteur de cellules automatiques pour mesurer la densité cellulaire.Ensemencer les cellules dans les puits de plaques de 12 puits avec du DMEM à une densité de 30 000 cellules par puits, et incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, ajouter 10 nanomolaires de diazonamide à chaque puits qui contient des cellules utilisant 1% DMSO comme un contrôle négatif, et transférer les plaques à un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Après 48 heures de traitement, imagez les cellules au microscope à 10 fois grossissement.Ensuite, les graines à la fois HT29 et HT29-DR3 cellules dans les puits de plaque de 96 puits avec DMEM à une densité de 3000 cellules par puits, et leur permettre de croître à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, ajoutez des concentrations de diazonamide qui augmentent la dose, comme le décrit le protocole textuel. Après 48 heures de traitement, utilisez un kit d’analyse de viabilité cellulaire à base de luminescence pour mesurer la viabilité cellulaire.Retirer la plaque de 96 puits de l’incubateur et la laisser reposer à température ambiante pendant environ 30 minutes. Ensuite, ajouter 50 microlitres de réacciens d’essai à chaque puits, et secouer la plaque pendant deux minutes à température ambiante pour lyse les cellules. Incuber la plaque à température ambiante pendant 10 minutes, puis utiliser un lecteur de microplaque pour déterminer la luminescence de chaque puits.La caractérisation des cellules HT29 exprimant stably DR3 révèle que les clones expriment différents niveaux de DR3 tandis que les cellules de type sauvage ne montrent pas l’expression exogène de gène. Les gènes un et cinq sont considérés comme exprimer les niveaux les plus élevés de DR3, et sont donc choisis pour d’autres expériences. La morphologie des cellules HT29 et HT29-DR3 est observée après avoir été traitée pendant 48 heures avec du diazonamide.Les cellules HT29-DR3 présentent une apoptose évidente avec une membrane cellulaire cassée et des débris cellulaires. Cependant, les cellules HT29 ne montrent que l’arrêt mitotique avec des cellules intactes qui présentent une forme cellulaire arrondie. La viabilité cellulaire de ces types de cellules est ensuite déterminée après avoir été traitée pendant 48 heures avec trois nanomolaires de diazonamide.Les cellules HT29-DR3 sont considérées comme une mort cellulaire de plus de 80%, tandis que les cellules parentales HT29 ne démontrent qu’une légère réponse sous forme d’arrestation mitotique. Ceci indique que la surexpression de DR3 a reconstitué la voie apoptotique diazonamide-induite dans ces cellules. Les dilutions en série appropriées sont importantes pour obtenir une densité optimale de clones simples.Il est également important de s’assurer que chaque cylindre clone ne contient qu’une seule colonie et d’éviter de contaminer les colonies voisines. Les lignées cellulaires surexprimantes DR3 ont facilité l’étude biochimique des mécanismes moléculaires in vitro. Nous avons généré des xénogreffes HT29-DR3 par injection sous-cutanée de cellules HT29-DR3, et il a aidé à élaborer les mécanismes de l’apoptose induite par les agents antimitotic in vivo.Ce protocole peut être utilisé pour étudier les gènes d’intérêt dans d’autres lignées cellulaires. En outre, le ko génétique est une autre façon d’étudier fonctionnellement, et notre protocole peut être adapté aux systèmes de knockdown génétique. Ainsi, il est généralement applicable aux fonctions génétiques élucidées.N’oubliez pas de déposer le relais du virus à la poubelle dans des contenants spécifiques pour l’élimination de la sécurité.

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