Marquage immunohistochimique Fluorescent multiplexé, l’imagerie et l’analyse des échantillons histologique du lymphome

Les lymphomes sont des tumeurs histologiquement complexes. Par conséquent, l’immunohistochimie fluorescente multiplexe offre des avantages par rapport à l’immunohistochimie chromogène conventionnelle pour étudier les marqueurs d’intérêt dans les cellules tumorales et le microenvironnement. Cette technique a le potentiel de normaliser la notation de la coloration basée sur l’anticorps dans les échantillons histologiques de lymphome, un processus qui a toujours été difficile en raison de la complexité du microenvironnement de tumeur.

Plus précisément, l’immunohistochimie fluorescente multiplexe et l’imagerie spectrale permettent la mesure quantitative de taches multiples dans une seule diapositive, permettant ainsi l’évaluation de l’expression de co d’antigène et de la relation spaciale dans le matériel clinique. Commencez par immerger les glissières désespérées et réhydratées dans un tampon de récupération d’antigène standard dans un bocal en verre économisez au micro-ondes et effectuez la récupération d’épitope induite par la chaleur dans un four à micro-ondes approprié. Effectuez des séries supplémentaires de décapage micro-ondes en fonction de la position de l’anticorps dans la séquence finale du multiplexe.

Par exemple, le quatrième anticorps nécessite trois tours supplémentaires de décapage au micro-ondes avant de tacher. Après avoir terminé le processus de décapage, utilisez des forceps et des gants anti-chaleur pour transférer les glissières dans de l’eau distillée à température ambiante pendant au moins 10 minutes de refroidissement. Lorsque la solution de récupération de l’antigène s’est refroidie, bloquer l’activité des peroxydées tissulaires avec un bloc commercial de peroxydase pendant 10 minutes, suivi d’un lavage de cinq minutes en solution saline à trois tampons, ou SCT, et d’un détergent non ionique.

Bloquez toute coloration non spécifique avec une incubation de 10 minutes dans le tampon de blocage suivie de l’incubation avec l’anticorps primaire d’intérêt à température ambiante pendant 30 minutes et trois lavages de cinq minutes avec tampon TBS-D. Ensuite, incubez les échantillons avec un peroxyde de raifort approprié conjugué anticorps secondaire pendant 15 minutes à température ambiante, suivie de trois lavages dans tbs-D tampon comme démontré. Après le dernier lavage, appliquez un réaccès fluorescent approprié à base de tyramide sur les glissières pendant une incubation de cinq minutes à température ambiante, suivi de trois lavages TBS-D de cinq minutes.

Effectuez un décapage supplémentaire à base de micro-ondes pour éliminer les anticorps primaires et secondaires dans la solution de récupération d’antigène frais comme démontré. À la fin de la récupération, refroidir les glissières dans de l’eau distillée et sécher les zones sur les toboggans sans tissu avec des lingettes de laboratoire. Incuber la toboggan avec du dappy pendant 10 minutes à température ambiante, suivi de trois lavages TBS-D.

Ensuite, séchez soigneusement les glissières avec des lingettes de laboratoire sans entrer en contact avec les tissus et montez les échantillons avec un support de montage approprié pour l’imagerie. Pour la numérisation des diapositives monoplexes, sélectionnez les filtres appropriés parmi les fluorophores utilisés pour étiqueter les échantillons et examinez chaque marqueur et son canal de fluorescence correspondant afin d’identifier un temps d’exposition approprié pour l’obtention d’un signal propre, en mettant l’accent sur le composant tissulaire qui devrait avoir le signal le plus fort pour le marqueur. Pour permettre une comparaison croisée de l’intensité du pixel, utilisez le réglage de la caméra en direct pour ajuster le temps d’exposition dans chaque canal individuel jusqu’à ce qu’il n’y ait pas de zones surexposées dans l’image de la caméra en direct.

Lorsque toutes les diapositives ont été numérisées, acquérir des images simulées de champ lumineux pour comparer visuellement avec le modèle immunohistochimique normal et pour déterminer si le modèle de coloration est correct. Pour numériser les diapositives de microrése tissulaire, utilisez le mode de balayage du microrése tissulaire dans le système d’imagerie et un algorithme de mise au point automatique approprié. Pour les diapositives entières de section de tissu, faites examiner les glissières par un pathologiste qualifié pour sélectionner des images optimales des secteurs les plus représentatifs de tumeur.

Avant de commencer l’analyse, sélectionnez un marqueur tumoral pour identifier les cellules d’intérêt pour l’analyse. Demander à un pathologiste d’examiner les images et de décider si la segmentation des tissus est nécessaire. Si nécessaire, sélectionnez les régions de contrôle appropriées pour la segmentation et vérifiez si le logiciel d’analyse d’image peut identifier correctement ces régions.

Après la segmentation cellulaire, demander au pathologiste d’examiner la carte de segmentation afin d’assurer la fidélité de l’approche de segmentation prévue et d’examiner les images individuelles afin de déterminer si la segmentation cellulaire est adéquate ou si une segmentation supplémentaire des tissus est nécessaire pour sélectionner les régions enrichies pour les cellules tumorales, le stroma et la nécrose. Déterminez ensuite la valeur de coupure positive de l’intensité optique pour chaque marqueur en collaboration avec le pathologiste et générez des histogrammes dans un logiciel statistique approprié pour analyser la distribution des fréquences de l’intensité du marqueur par cellule. Pour générer des données en pourcentage pour des marqueurs d’intérêt spécifiques dans les cellules définies, insérez une table pivotante dans la fiche de données et sélectionnez Sum pour calculer le pourcentage de positivité d’un seul marqueur d’intérêt.

Le nombre total de cellules positives marqueurs divisées par le nombre total sera calculé. Le résultat est le pourcentage de cellules positives marqueur avec un noyau, ou un numéro d’étude. Pour générer des données numériques, obtenez l’intensité moyenne de chaque marqueur d’intérêt dans toutes les cellules étudiées au sein d’un échantillon afin d’extraire le nombre normalisé médian pour chaque marqueur de chaque noyau ou numéro d’étude.

Ici, des images immunohistochimiques fluorescentes multiples représentatives pour un grand échantillon diffus de lymphome de B-cellule avec le réarrangement de gène de C-MYC et de BCL2 sont montrées. Les images immunohistochimiques simulées de champ lumineux démontrent un modèle semblable de coloration de marqueur de tumeur. L’application d’images immunohistochimiques fluorescentes multiplexes à un panneau de cellule T dans les lymphomes angioimmunoblastic de T-cellule indique l’hétérogénéité cellulaire de l’échantillon de tumeur.

Ici, l’optimisation d’un échantillon de contrôle des amygdales et l’analyse des données qui en résulte sont affichées. Une variété de logiciels d’analyse d’image peuvent être utilisés après l’étape de désintoxication pour quantifier l’expression des marqueurs et la localisation dans les cellules tumorales et le microenvironnement tumoral. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs pour étudier la co-expression de marqueurs multiples dans des types de cellules spécifiques dans des sections de tissus simples du lymphome.

Prenez soin de prévenir les blessures causées par la chaleur pendant les étapes de micro-ondes et soyez conscient des risques de chute pendant les étapes de balayage qui sont effectuées dans le pont.