Déterminant des séquences de molécules monocaténaires naissant de l’ADN Viral au cours du VIH-1 et 3'-Termini Reverse Transcription dans les cellules infectées

Cette nouvelle méthode d’analyse de la transcription inverse peut nous dire de nouvelles choses sur le domaine de la virologie rétro. Par exemple, nous pouvons en apprendre davantage sur le fonctionnement des facteurs de restrictions cellulaires ou sur la façon dont les médicaments antirétroviraux inhibent la synthèse de l’ADN DU VIH1. Le principal avantage de cette technique est que non seulement fournit des informations sur la séquence de Nascent Reverse Tran scrips, mais il permet la cartographie de leur précis termini ADN 3-prime à une résolution nucléaire unique serré.

L’enrichissement des ADN gratuits du VIH1 à partir de l’ADN de gros des cellules infectées par le VIH1 se fait par capture hybride et devrait être effectué dans un poste de travail pcr. Préparer un mélange principal de perles magnétiques de streptavidine par tuyau dirigeant une centaine de microlitres de perles par échantillon dans un seul tube de micro centrifugeuse placer le tube sur un aimant adapté aux tubes de micro centrifugeuse. Une fois que les perles se sont installées vers le côté aimant du tube, retirez le tampon de stockage, retirez le tube de l’aimant et suspendez les perles en cinq cents microlitres de lavage bindent ou tampon BW.

Remettre le tube sur l’aimant, attendre que les perles migrent vers l’aimant et retirer le surnatant. Retirer le tube de l’aimant, ajouter cinq cents microlitres de solution de caséine, suspendre à nouveau les perles et incuber à température ambiante pendant dix minutes. Après dix minutes, laver les perles avec un tampon BW.

Remettre le tube sur l’aimant, retirer le supernatant et suspendre à nouveau les perles dans cinq cents microlitres de tampon BW. Ajouter cinquante picomoles de chaque oligonucléotide biotinylé capturé par échantillon. Incuber à température ambiante tout en berçant à l’extrémité du mélangeur d’extrémité pendant trente minutes.

Ensuite, retournez le tube à l’aimant, retirez le supernatant, retirez le tube de l’aimant, ajoutez cinq cents microlitres de 1x dix tampons et suspendez les perles. Après le deuxième lavage re suspendre les perles avec les oligonucléotides immobilisés dans dix microlitres de 1x dix tampon par échantillon. Pour chaque échantillon, étiquetez un tube de microcetrofuge et ajoutez dix microlitres de suspension de perle, cent soixante-dix microlitres d’ADN et quatre-vingt-dix microlitres de tampon 3x dix.

Incuber dans un bloc thermique sec à quatre-vingt-quinze-deux degrés Celsius pendant deux minutes pour démentr l’ADN. Déplacez les tubes vers un autre bloc thermique sec, qui est réglé à cinquante-deux degrés Celsius, et incuber pendant une heure. Toutes les dix minutes pendant cette incubation, inverser les tubes pour mélanger.

Lorsque l’incubation d’une heure est terminée, laver les perles une fois avec cinq cents microlitres de 1x dix tampon, et suspendre à nouveau dans trente-cinq microlitres d’eau sans nucléase. Assurez-vous que les perles se déposent bien en laissant les tubes sur l’aimant pendant environ trois minutes avant d’enlever tout liquide. Pour évaporer, incuber les tubes à quatre-vingt-quinze-deux degrés Celsius dans un bloc de chaleur sèche pendant deux minutes.

Ensuite, déplacez rapidement les tubes sur l’aimant, un tube à la fois. Une fois que les perles sont liées sur le côté du tube, transférer le surnatant contenant l’ADN HIV1 dans un tube frais. Pour commencer cette procédure, suspendez l’adaptateur lyophilisé à cent micromolaires dans l’eau libre de nucléase et vortex le tube.

Par échantillon, plus un échantillon de contrôle, combinez zéro point quatre cinq microlitres de tampon de ligase d’ADN 10x T4, quatre microlitres d’adaptateur, et point zéro cinq microlitres d’eau libre de nucléase. Chauffer à quatre-vingt-dix-deux degrés Celsius pendant deux minutes, puis laisser refroidir lentement à seize degrés Celsius dans une machine PCR. Cela permettra à l’adaptateur de former une structure d’épingle à cheveux.

L’étape clé de cette procédure est la ligature efficace et impartiale des molécules adaptées pour ouvrir les termini d’ADN à 3 premiers. Les molécules naissantes purifiées d’ADN de longueur variable sont ligatées à un adaptateur d’ADN échoué simple en épingle à cheveux utilisant la ligase d’ADN T4. L’adaptateur porte une séquence aléatoire de six codes à barres nucléotides, ce qui permet d’parer pour faciliter la ligature, et sert simultanément d’identificateur pour les lectures uniques.

L’adaptateur termini 3-prime porte un espaceur pour empêcher l’auto ligature. Pour mettre en place soixante réactions finales de ligature de volume de microlitres, ajoutez ce qui suit à chaque tube PCR : six microlitres de tampon ligase d’ADN 10x T4, vingt-quatre microlitres de quarante pour cent PEG, six microlitres de cinq betaine molaire, quatre microlitres de point cinq d’adaptateur, un point deux microlitres de ligase d’ADN T4, et dix-huit microlitres de point de l’ADN. Après avoir bien mélangé les réactions, incuber dans une machine PCR à seize degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain de la ligature de l’adaptateur, à trente microlitres de formamide contenant du tampon de chargement de gel d’ADN à chaque réaction de ligature et bien mélanger par rubrique pipe. Chauffer dans une machine PCR à quatre-vingt-dix-quatre degrés Celsius pendant deux minutes, puis immédiatement mis sur la glace. L’étape suivante consiste à se préparer à l’électrophoresis gel dénaturant.

Placez un gel de polyacrylamide d’urée dénaturant le TBE à six pour cent dans un réservoir de gel approprié et ajoutez 1x tampon de fonctionnement TBE. Pré-exécuter le gel pendant vingt minutes. Ensuite, utilisez une seringue et une aiguille de vingt et une jauge pour laver les poches de gel avec tampon en cours d’exécution.

Chargez ensuite trente microlitres par puits d’un même échantillon en trois puits. Il est conseillé de n’exécuter qu’un seul échantillon par gel pour éviter la contamination croisée. Courir pendant vingt minutes.

Pendant que le gel est en marche, préparez trois tubes de microcentrifugeuse de cinq millilitres à zéro point par échantillon en utilisant une aiguille de seringue de calibre vingt et un pour percer des trous dans le fond. Insérez chacun des tubes préparés dans un tube de micro centrifugeuse de deux millilitres et étiquetez-les avec le nom de l’échantillon plus faible, moyen ou élevé. Lorsque le front de teinture bleu foncé est à mi-chemin à travers le gel, arrêter l’électrophorèse et enlever la cassette gel.

Ouvrez la cassette et coupez le gel verticalement à l’aide d’une lame de rasoir. Pour exciser généreusement la bande avec trois puits d’échantillons chargés. Ajouter la bande de gel dans un récipient avec 1x TBE et cinq microlitres de tache d’acide nucléique de cyanine et incuber pendant trois à cinq minutes.

Assurez-vous que la coloration est suffisante afin d’identifier facilement le haut de l’adaptateur libre qui doit être enlevé plus tard. Ensuite, nettoyez soigneusement la surface d’un transilluminateur de lumière bleue avec de l’eau ionisée distillée. Ensuite, sortez le morceau de gel du contenant de coloration et placez-le sur la boîte lumineuse.

Allumez la boîte lumineuse et inspectez les acides nucléiques tachés à travers le filtre orange. Un échantillon représentatif d’ADN ligated sur un gel taché, est montré ici. L’adaptateur semble généralement surchargé et fonctionne comme un gros blob avec de l’ADN DU VIH1 ligaté qui s’étend au-dessus comme une strie.

Les lignes rouges indiquent les emplacements que le gel doit couper pour enlever l’adaptateur libre, et diviser l’échantillon en trois morceaux différents. À l’aide d’une nouvelle lame de rasoir, couper les côtés du gel s’il y a des zones sans échantillon chargé encore présents. Ensuite, coupez juste au-dessus de l’adaptateur pour enlever l’adaptateur et les pièces de gel inférieures.

Enfin, couper le haut du gel, y compris environ un millimètre des poches de gel qui ont souvent un signal intense forte de l’ADN de poids moléculaire plus élevé. Diviser le reste du gel contenant l’échantillon horizontalement en trois morceaux. Zones de faible, moyenne et haute pondération moléculaire.

Ensuite, coupez chacun des trois fragments de gel en deux par deux millimètres et transférez-les dans les tubes de microcentrifugeuse préparés à zéro point de cinq millilitres. Tournez à grande vitesse avec des couvercles ouverts pendant une minute. Pour presser les morceaux de gel à travers le trou dans le tube de deux millilitres pour créer une neige fondante gel.

Si des particules de gel restent au fond du tube de cinq millilitres à zéro point, transférez-les manuellement dans le tube de deux millilitres à l’aide d’une aiguille. Commencez la procédure d’extraction de l’ADN en ajoutant un millilitre de tampon d’extraction de gel d’urée à la neige fondante gel dans chaque tube de microcentrifugeuse. Faire pivoter les tubes avec une extrémité au-dessus du mélangeur d’extrémité à température ambiante pendant au moins trois heures.

Préparer les colonnes de filtre. Utilisez un ensemble propre de pinces à épiler pour ajouter un petit filtre rond en fibre de verre à chaque colonne de centrifugeuse avec des filtres à membrane d’acétate de cellulose, ce qui empêche l’engorgement de la membrane. Mettez le filtre en place avec une pointe de tête de tuyau inversée.

Faites tourner brièvement les deux tubes millilitres avec de la neige fondante gel et un tampon d’extraction dans une microcentrifugeuse, et transférez sept cents microlitres du supernatant dans les colonnes de filtre préparées. Centrifuger les colonnes de filtre dans une microcentrifugeuse à grande vitesse pendant une minute. Ensuite, transférez le flux à travers à un nouveau tube de microcentrifugeuse de deux millilitres.

Recharger les colonnes avec le surnatant restant. Essayez d’obtenir autant de liquide que possible de la neige fondante d’extraction et ne vous inquiètez pas si des morceaux de gel sont inclus. Tourne encore.

Combinez le flux à travers les mêmes échantillons d’extraction et procéder comme décrit dans le protocole de texte. Ce protocole a été utilisé dans des échantillons de cellules CEMS-ST infectées par vif-déficient VIH-1 en l’absence ou la présence de la protéine humaine antirétrovirale A3G. Une parcelle du nombre total de lectures uniques obtenues à partir de chaque échantillon indique que l’augmentation des niveaux d’A3G réduit le nombre total de lecture.

Reflétant l’effet inhibiteur de l’A3G sur la synthèse de cdna mentée de transcriptase inverse. Dans ces trois parcelles suivant, la fraction des molécules à chaque longueur possible dans les cent quatre-vingt-deux premiers nucléotides, est montrée dans les histogrammes bleus. L’ajout d’A3G a coûté une forte augmentation des molécules de cdna tronquées plus courtes à quelques positions reproductibles très spécifiques.

Les lignes rouges pointillées, montrent les pourcentages de lecture portant des mutations C à T à la position respective. Un contrôle positif peut être produit en traitant un pool d’oligonucléotides synthétiques de séquence, de longueur et de concentration de savoir. Toutes les molécules doivent apparaître en abondance presque égale avec seulement de petites variations.

Si une course de bibliothèque produit un biais de longueur mineur, en séquençage, il est conseillé d’appliquer un facteur de normalisation qui est dérivé de la pente qui représente le biais de taille. Cette procédure peut être facilement adaptée à d’autres systèmes où la détermination des trois extrémités principales des molécules d’ADN ajouterait des aperçus clés dans les ares du métabolisme d’acide nucléique. N’oubliez pas que travailler avec le VIH peut être extrêmement dangereux et que certaines infections ne doivent être effectuées que dans des laboratoires de sécurité désignés.