Name: Analyse protéomique de polarisation des macrophages humains dans un environnement pauvre en oxygène (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Découvrez l'analyse protéomique de la polarisation des macrophages humains en conditions hypoxiques. Cette méthode par quantification sans marquage permet de caractériser les états d'activation cellulaire et d'étudier l'impact de l'oxygène sur la biologie immunitaire.

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AM est financé par le programme Leader du groupe Young (ATIP/Avenir Inserm-CNRS), de la Ligue Nationale contre le Cancer et la Fondation ARC versez la recherche sur le Cancer. Nous remercions Mariette Matondo de la spectrométrie de masse pour plateforme de biologie (UTECHS MSBIO, Institut Pasteur, Paris). Nous remercions Lauren Anderson pour sa lecture du manuscrit.

Des échantillons de sang humain (LRSC) provenant de donneurs sains, dépersonnalisées proviennent de l’EFS (Français National Blood Service) dans le cadre d’un protocole autorisé (CODECOH DC-2018-3114). Donateurs ont donné le consentement signé pour l’utilisation du sang.
1. médias et préparation du tampon
<ol><li>Préparer le milieu de macrophage [RPMI glutamax + 10 mM HEPES + 1 x non essentiels des acides aminés (NEAA)] et elle chauffé à 37 ° C.</li>
	<li>Préparer le milieu macrophage + 10 % de sérum humain du plasma AB (SAB), filtrer (filtre de 0,22 µm), puis le réchauffer à 37 ° C (dénommé moyen de macrophage + 10 % SAB ci-après).</li>
	<li>Préparer le tampon tri [1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) + 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) + acide éthylènediaminetétraacétique de 2 mM (EDTA)], la filtrer (filtre de 0,22 µm) et maintenir à 4 ° C.</li>
</ol>2. isolement des cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) de déleucocytation système chambre (LRSC)
<ol><li>Mettre 15 mL de solution de séparation densité cellulaire dégradé (voir la Table des matières) dans 50 mL de centrifugation tube donc il peut réchauffer à température ambiante (RT) avant de recevoir le LRSC. Remarque : La densité dépend de la température. Que ce produit est stocké à 4 ° C, cette étape doit être faite à l’avance donc il peut équilibrer RT.</li>
	<li>Vider la LRSC dans un tube de centrifugation de 50 mL, ajoutez à 50 mL de PBS 1 x et mélangez. Très lentement, ajouter 25 mL du mélange préparé au cours de l’étape 2.2 sur le dessus de 15 mL de solution de gradient de densité réchauffée au cours de l’étape 2.1. Remarque : Veillez à ne pas mélanger les phases au cours de cette étape. Le sang doit être ajouté à la solution de gradient de densité sans toute perturbation de cette phase.</li>
	<li>Centrifuger les deux tubes à centrifugation pendant 25 min à 700 x g sans pauses. Remarque : À la fin de la centrifugation en gradient de densité, les couches de bas en haut sont : les érythrocytes et granulocytes formant le pellet, la phase de solution de gradient de densité, la couche de PBMC et le plasma.</li>
	<li>Avec une pipette, passer par la phase plasma sans aspirer il et recueillir la couche PBMC dans un nouveau tube de centrifugation de 50 mL. Ajoutez à 50 mL de solution 1 PBS x pour les PBMC comme une étape de lavage et centrifuger pendant 10 min à 300 x g.</li>
	<li>Aspirer le surnageant et resuspendre le culot dans 40 mL de milieu de macrophages.</li>
</ol>3. magnétique d’étiquetage et de l’isolement de CD14+ cellules (Monocytes)
<ol><li>Compter les PBMC dans une chambre de Malassez. Retirer le montant de PBMC nécessaires à la conduite de l’expérience (généralement de 100 à 300 x 106 cellules), les placer dans un tube de centrifugation et centrifuger pendant 10 min à 300 x g.</li>
	<li>Aspirer le surnageant et resuspendre le culot dans 80 µL du tampon tri préparé au cours de l’étape 1.3 par 107 PBMC. ajouter 20 µL de CD14 microbeads par 107 Mix PBMC. puits et incuber pendant 15 min à 4 ° C sous agitation constante.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de tampon par 107 PBMC de tri comme une étape de lavage et centrifuger pendant 10 min à 300 x g. aspirer le surnageant et resuspendre le culot dans 500 µL de tampon par 108 PBMC de tri.</li>
	<li>Placez une colonne dans le champ magnétique du séparateur. Préparer la colonne en les rinçant avec 3 mL de tampon de tri.</li>
	<li>Appliquer la suspension de cellules dans la colonne. La colonne dépend du nombre de cellules d’isolement (ici, les colonnes de LS pour jusqu'à 109 PBMC sont utilisées). Prélever des cellules intermédiaires contenant sans étiquette. NOTE : À partir de cette étape, tous les tubes (sélections négatives et positives) sont conservées pour vérifier plus tard des différentes étapes par cytométrie en flux.</li>
	<li>Laver la colonne avec 3 x 3 mL de tampon de tri. Prélever des cellules non marquées en passant par le même tube de l’étape 3.12. Effectuer les étapes de lavage en ajoutant tampon tri, veillez à ne pas faire sécher votre colonne. Placer un tube de prélèvement au titre de la colonne et retirez-la du séparateur.</li>
	<li>Pipette 5 mL de tampon de tri dans la colonne. Rincer immédiatement les cellules magnétiquement étiquetées en appuyant fermement sur le piston dans la colonne. Pour augmenter la pureté de la CD14+ cellules, la fraction d’élution est enrichie sur une seconde colonne.</li>
	<li>Répétez les étapes 3,4 à 3,7 avec une nouvelle colonne.</li>
</ol>4. électrodéposition de Monocytes
<ol><li>Compter les monocytes dans une chambre de Malassez. Vérifier la pureté de la CD14+ cellules par cytométrie en flux. Retirer le montant des monocytes nécessaires pour l’expérience et les placer dans un tube de centrifugation.</li>
	<li>Centrifuger pendant 10 min à 300 x g. aspirer le surnageant et resuspendre le culot de monocytes dans le milieu du macrophage. Les cellules de la plaque et les laisser s’installer pour 50 min à 1 h. aspirer le milieu et remplacez-le par le moyen de macrophage + 10 % SAB + 25 ng/mL macrophage colony stimulant facteur (M-CSF) pour induire la différenciation.</li>
</ol>5. polarisation des Macrophages au jour 6
<ol><li>Aspirez le milieu. Remplacez-la par moyen de macrophage + 10 % SAB avec divers stimuli. Par exemple, ajoutez 10 gamma d’interféron ng/mL (INFγ) ou 20 ng/mL interleukine 4 (IL4) + 1 lipopolysaccharide (LPS) pour obtenir M1 polarisation, de ng/mL et 20 ng/mL interleukine 13 (IL13) pour polarisation M2. Remarque : La stimulation peut être effectuée entre 24 et 48 heures avant de procéder à d’autres tests.</li>
	<li>Récolte des cellules à l’aide d’une solution de décollement ou un grattoir de cellules.</li>
</ol>6. cellule Culture dans des Conditions de faible teneur en oxygène
<ol><li>À partir de l’étape 4, maintenir les monocytes et les macrophages dans un environnement contrôlé en oxygène pour réaliser une analyse des conditions hypoxiques ensuite. Utiliser une station de travail hypoxie afin de maintenir les cellules sous la pression partielle d’oxygène désiré pendant l’expérience. Remarque : Lorsque vous travaillez sous la pression de l’oxygène, il est important de préparer tous les supports et les tampons de lavage sous la gare et attendre suffisamment pour obtenir la bonne pression partielle dans le liquide. Par exemple, 10 mL de PBS dans une boîte de pétri de 60 mm nécessite environ 2 h pour atteindre 25 mm Hg pour la pression partielle de2 O à partir de pressions atmosphériques (comme nous l’avons mesuré à l’aide d’un capteur à fibre optique d’oxygène). Dans de nombreux postes hypoxiques ou incubateurs, la pression d’oxygène est définie comme un pourcentage de la pression atmosphérique. Si des mesures précises sont nécessaires, il est préférable d’utiliser une station autorisant directement régler la pression de l’oxygène en mmHg.</li>
</ol>7. lyse et Digestion de dans-Gel (protocole 1)
Remarque : En cela et les sections qui suivent, deux protocoles utilisés pour obtenir des peptides et effectuer des analyses LC-MS/MS sont décrites. Protocole 1 décrit la lyse cellulaire et le fractionnement en gel et la digestion, et protocole 2 la lyse des cellules en solution suivie de la digestion en solution et de fractionnement à l’aide d’une méthode mise au point isoélectrique.
<ol><li>Effectuer la lyse des cellules dans le tampon de Laemmli [234 mM Tris-HCL (pH 6,8), 7,5 % SDS, 37 % de glycérol, 33,3 % (v/v) de β-mercaptoéthanol, bleu de bromophénol 0,2 % p/v]. Charger l’équivalent protéique de 300 000 cellules de chaque échantillon de 4 à 12 % bis-Tris gels d’acrylamide.</li>
	<li>Contrôler la durée de la migration électrophorétique pour permettre à chaque échantillon de protéine à se diviser en gel 6 bandes, comme illustré à la Figure 3.</li>
	<li>Fixer le gel avec une solution de fixation (30 % éthanol + 7,5 % d’acide acétique pendant 20 min), puis ajouter la solution colorante (R-250 Coomassie bleu pendant 45 min). Ajoutez la solution de décoloration (30 % éthanol + 7,5 % acétique jusqu'à apparaissent des bandes) avant d’exciser les bandes de protéines avec un scalpel propre.</li>
	<li>Couper en dés chaque bande excisée avant introduction dans des tubes de 500 µL. Une surface de verre propre est justifiée pour éviter toute contamination avec Kératines (solution SDS 5 % dans l’eau désionisée utilisable pour nettoyer les surfaces).</li>
	<li>Laver les tranches de gel 3 fois dans 200 µL de bicarbonate d’ammonium 25 mM pendant 20 min à 37 ° C, suivie d’un lavage au bicarbonate d’ammonium 25 mM et l’acétonitrile (50 % v/v). Déshydrater les morceaux de gel avec 200 µL de 100 % d’acétonitrile pendant 10 min.</li>
	<li>Incuber à chaque morceau de gel avec 10 mM TNT (dithiothréitol) en 25 mM d’ammonium bicarbonate pendant 45 min à 56 ° C (200 µL), suivi par l’iodoacétamide 55 mM à 25 mM de bicarbonate d’ammonium (200 µL) pendant 35 min à l’obscurité à température ambiante.</li>
	<li>Pour arrêter l’alkylation, incuber chaque morceau de gel avec 200 µL de 10 mM TNT de bicarbonate d’ammonium 25 mM pendant 10 min à RT. Wash les morceaux de gel dans 200 µL de bicarbonate d’ammonium 25 mM, puis déshydrater avec 200 µL d’acétonitrile 100 % pendant 10 min.</li>
	<li>Digérer les protéines pendant une nuit à 37 ° C avec la trypsine/Lys-C mélange selon les instructions du fabricant.</li>
	<li>Extraire les peptides résultants du gel de morceaux en ajoutant 50 μL de 50 % d’acétonitrile pendant 15 min, puis 50 μL d’acide formique 5 % pendant 15 min et enfin, 50 μL d’acétonitrile 100 % pendant 15 min. piscine et chaque fraction dans des tubes de faible absorption de limiter l’adsorption des peptides sèche et perte de l’échantillon. Conserver les échantillons à-80 ° C jusqu'à l’analyse ultérieure.</li>
</ol>8. protein Extraction et Digestion en Solution (protocole 2)
<ol><li>Effectuer la lyse cellulaire (2 x 106 cellules) avec 150 µL de la mémoire tampon de lyse suivants :<ol>
<li>Urée de 7 M, 2 M thiourée, 40 mM Tris et 4 % CHAPS, complétées par des inhibiteurs de protéase (mini complet, sans EDTA inhibiteur de protéase cocktail).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Homogénéiser les solutions pendant 30 min à RT avec un thermoshaker. Centrifuger à 13 800 x g pendant 20 min RT et garder le liquide surnageant.</li>
	<li>Retirer les contaminants avec un kit de nettoyage 2D :<ol>
<li>Le kit contient la solution precipitant, solution co précipitant, tampon de lavage et additif de lavage.</li>
		<li>Ajouter 300 µL de solution precipitant et bien mélanger. Incuber sur glace pour 15 min. ajouter 300 µL de solution co précipitant. Centrifuger les tubes (au moins) à 12 000 x g pendant 5 min. Une petite pastille devrait être visible. Procéder rapidement à l’étape suivante pour éviter la remise en suspension ou la dispersion de la pastille. Retirez le surnageant sans déranger le culot.</li>
		<li>Centrifuger les tubes avec le cap-charnière et pellet vers l’extérieur pour mettre n’importe quel liquide restant au fond du tube. Une brève impulsion suffit. Il ne devrait y avoir aucun liquide visible restant dans les tubes.</li>
		<li>Sans déranger le culot, ajouter 40 µL de solution de co précipitant. Laisser le tube s’asseoir sur la glace pendant 5 min. centrifuger pendant 5 min, puis retirer et jeter le lavage. Ajouter 25 µL d’eau déionisée. Vortex de chaque tube pour 5-10 s. Le culot doit se disperser mais ne se dissolvent pas dans l’eau.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de tampon de lavage (préalablement réfrigéré pendant au moins 1 h à-20 ° C) et 5 µL d’additif de lavage. Vortex jusqu'à ce que la pastille est entièrement dispersée. Incuber les tubes à-20 ° C pendant au moins 30 min. Vortex pour 20-30 s toutes les 10 min Remarque : Les tubes peuvent être stockés à-20 ° C pendant 1 semaine avec la dégradation des protéines minimale ou la modification.</li>
		<li>Centrifuger les tubes (au moins) à 12 000 × g pour 5 min. Retirez avec précaution et éliminer le surnageant. Une pastille blanche doit être visible. Laisser le diabolo à airdry pendant pas plus de 5 min (si la pastille est trop sec, qu'il sera difficile de remettre en suspension).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspendre le culot de protéine dans 300 µL de 8 M urée et 0,1 M de bicarbonate d’ammonium. Vortex fortement pendant 1 min. déterminer la concentration de la protéine à l’aide d’un dosage colorimétrique.</li>
</ol>9. en-Solution Digestion (protocole 2)
<ol><li>Réduire les ponts disulfures en ajoutant 5.1 µL d’une solution aqueuse de 700 mM DTT (concentration finale 12,5 mM) aux protéines remises en suspension d’étape 8,4 et incuber à 37 ° C pendant 30 min avec un thermoshaker. Alkylat résidus cystéine en ajoutant 20,3 µL d’une solution aqueuse de 700 mM iodoacétamide (concentration finale 40 mM) et en incubation à 25° C pendant 30 min dans le noir avec une thermoshaker.</li>
	<li>Ajouter 990 µL de bicarbonate d’ammonium 0.1 M dans l’échantillon. Ajouter un volume correspondant de trypsine/Lys-C mix (substrat de l’enzyme : ratio 1/100 w/w). Incuber à 37° C pendant la nuit avec un thermoshaker.</li>
</ol>10. nettoyage cartouche (protocole 2)
<ol><li>Mouiller une cartouche et 1 colonne-volume (1 mL) de méthanol. Nettoyer la cartouche et 1 colonne-volume (1 mL) d’eau de 80 % d’acétonitrile/qualité-HPLC et jeter le cheminement. Equilibrez la cartouche avec 4 colonne-volumes (4 mL) d’eau de 0,1 % d’acide formique/qualité-HPLC et jeter le cheminement.</li>
	<li>Acidifier les échantillons avec 90 µL d’eau à un pH de 2-3 (vérifier le pH avec un indicateur de pH) ou de 10 % d’acide formique. Charger les échantillons acidifiés et collecter le cheminement. Recharger le cheminement (contenant les peptides non retenu). Laver la cartouche avec 6 colonne-volume (6 mL) d’eau de l’acide formique/HPLC-grade de 0,1 %.</li>
	<li>Éluer les peptides de la cartouche avec 1 colonne-volumes (1 mL) d’eau de qualité/acétonitrile-HPLC acid/50% formique 0,1 %. Transférer dans un tube de microtubes de 1,5 mL. Concentrer l’échantillon à l’aide d’une pompe à vide (150 x g, sous vide à 160 mBar).</li>
</ol>11. fractionnement par focalisation isoélectrique (protocole 2)
Remarque : Les Peptides sont séparés selon leurs points isoélectriques utilisant un fractionnateur hors-gel sur une bande de 13 cm couvrant une plage de pH de 3 à 10. Nous avons utilisé le protocole suivant fourni par le fournisseur (résumé ci-dessous) :
<ol><li>Préparer les solutions suivantes : solution un (600 µL de solution de glycérol, 60 µL de tampon de OFFGEL, 4,34 mL d’eau ultrapure) et B (1,776 mL de solution A) et 444 µL d’eau ultrapure.</li>
	<li>Assembler les bandes IPG, cadres et les électrodes selon les instructions du fabricant.</li>
	<li>Remettre en suspension l’échantillon avec 1.8 mL de solution B. ajouter 40 µL de solution B dans chaque puits. Charger 150 µL de l’échantillon dans chaque puits.</li>
	<li>Sélectionnez le mode par défaut pour les peptides : OG12PE00 (OFFGEL méthode par défaut de peptides pour une utilisation avec un 3100 OFFGEL Low Res Kit, cadres de 12 puits de 3 à 10, pH. Attendez jusqu'à ce que cette méthode a été complété (~ 20 h). Recueillir les fractions en tubes correctement étiquetées.</li>
</ol>12. nettoyage Harvard appareil colonne inverse C18 Post-IEF (protocole 2)
<ol><li>Ajouter progressivement de quelques μL à la fois de 1 % TFA dans de l’eau déminéralisée à chaque fraction s’acidifier l’échantillon. Vérifier à l’aide de papier pH que le pH est d’environ 3 ou ci-dessous.</li>
	<li>Préparer les solutions suivantes : solution 1 (5 mL d’acétonitrile, 10 µL d’acide formique, 4,99 mL d’eau ultrapure) et 2 (0,5 mL d’acétonitrile, 10 µL de l’acide formique, 9,49 mL d’eau ultrapure).</li>
	<li>Pré humide la colonne avec 150 µL de la solution 1. Centrifuger pendant 90 s à 750 x g et jeter le cheminement. Laver la colonne avec 150 μl de solution 2. Centrifuger pendant 90 s à 750 x g et jeter le cheminement.</li>
	<li>Passez la fraction par le biais de la colonne. Centrifuger pendant 90 s à 750 x g et jeter le cheminement. Laver avec 150 μl de solution 2. Centrifuger pendant 90 s à 750 x g et jeter le cheminement.</li>
	<li>Éluer les fractions contenant 50 μL de la solution 1. Centrifuger pendant 90 s à 750 x g. Répétez ces étapes une fois de plus.</li>
	<li>Sec-fraction à l’aide d’une pompe à vide (150 x g, sous vide 160 mBar) et stocker à-80 ° C</li>
</ol>13. l’analyse des données protéomiques et bioinformatique18
<ol><li>Analyser les données obtenues par un nano-LC-MS/MS masse spectromètre à l’aide de logiciels de quantification telles que MaxQuant (version 15.2.8) et le moteur de recherche d’Andromède.</li>
	<li>Définir le taux de fausse découverte (FDR) à 1 % de protéines et de peptides et d’une longueur minimale de 7 acides aminés. Définir la spécificité de l’enzyme comme C-terminal pour Arg et Lys. Qu’il soit 2 clivages manqués proline obligations. Sélectionnez carbamidomethylation de cystéine comme modification fixe et oxydation de l’acétylation et méthionine des protéines N-terminal variable modifications.</li>
	<li>Poursuivre l’analyse des données avec le logiciel d’analyse statistique. Effectuer une analyse fonctionnelle de l’enrichissement à l’aide du logiciel FunRich (www.funrich.org/). Effectuer une analyse d’enrichissement ontologie génique à l’aide de logiciels de DAVID (https://david.ncifcrf.gov/).</li>
</ol>

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<li>Court, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+standardized+urine+proteome+analysis+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Toward a standardized urine proteome analysis methodology.</a> Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).</li>
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<li>Lengner, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+pre-X+inactivation+human+embryonic+stem+cells+under+physiological+oxygen+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations.</a> Cell. 141 (5), 872-883 (2010).</li>
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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.

Parce que la protéomique est un outil puissant pour étudier l’expression des différentes protéines d’une cellule entière ou compartiments subcellulaires, optimisation du protocole de la lyse cellulaire et la digestion des protéines a été traitées par un certain nombre d’études. Il y a trois grandes classes de méthodes, qui incluent la digestion en gel (digestion des protéines en gel de polyacrylamide matrice)17, digestion en solution18 et filtre assistée par exemple prépara...

Les macrophages sont des cellules immunitaires innées impliqués dans un certain nombre de fonctions physiologiques allant de réactions aux agents pathogènes infectieux à l’homéostasie tissulaire, y compris l’enlèvement de cellules apoptotiques et remodelage de la matrice extracellulaire1. Ces cellules sont caractérisées par une forte plasticité phénotypique2 qui se traduit par un nombreux États d’activation possible, qui sont aussi appelés les polarisations. La description moléculaire précise de ces polarisations différentes est une priorité dans le domaine des macrophages biologie3. Il a été proposé de classer ces polarisations à l’aide de la dichotomie de M1/M2 ce qu’on appelle, dans laquelle M1 représente pro-inflammatoires et M2 macrophages anti-inflammatoires. Ce modèle s’intègre bien dans diverses situations pathologiques comme les infections aiguës, allergies et obésité4. Toutefois, dans les tissus chroniquement enflammés et le cancer, il a été démontré que cette classification est incapable de comprendre le large répertoire phénotypique que macrophages présent dans certains environnements cellulaires5,,6, 7. le consensus actuel est que polarisation macrophage est mieux décrit en utilisant un modèle multidimensionnel pour intégrer des signaux micro-environnementales spécifiques8. Cette conclusion a été confirmée par analyse transcriptomique des macrophages humains montrant que le modèle M1/M2 est inefficace en décrivant les polarisations obtenu9.
L’étude présentée a pour but de fournir un protocole afin d’obtenir les signatures de protéomique de polarisations différentes dans les macrophages humains. Nous décrivons comment différencier les macrophages humains dans des environnements de divers niveaux d’oxygène et d’obtenir des peptides du protéome macrophage ensemble pour effectuer une quantification exempte d’étiquette. Cette quantification permet la comparaison des niveaux d’expression de diverses protéines. Recherche sur les cellules souches a révélé l’importance de l’oxygène comme un paramètre key environmental10, nous cherchons à comprendre comment ce paramètre tissu peut influencer polarisation macrophages chez les humains. La pression partielle d’oxygène a été trouvée à intervalle de 3 à 20 % (de la pression atmosphérique totale) dans le corps humain, où 20 % correspond à peu près à ce qui est couramment utilisé dans un incubateur de culture cellulaire (la valeur exacte est d’environ 18,6 % tout en prenant la présence d’eau en compte).
Travaux antérieurs ont montré qu’alvéolaire diffèrent des macrophages interstitielles de fonctionnelles et morphologique point de vues11 et que ces différences sont probablement partiellement en raison des niveaux d’oxygène différents auxquels ils sont exposés12. En outre, les dérivés de la moelle osseuse montrent une capacité accrue de phagocyter les bactéries lorsqu’ils sont exposés à un environnement de faible teneur en oxygène12. L’effet inverse a été trouvé pour les macrophages humains dissociés THP113, mais ces résultats appuient l’idée que l’oxygène est un organisme de réglementation de la biologie du macrophage et qu’il est nécessaire de préciser ce rôle au niveau moléculaire dans les macrophages humains. Dans une étude précédente, nous avons appliqué une approche protéomique pour résoudre ces problèmes. En mesurant les niveaux d’expression pour des milliers de protéines en même temps, nous avons mis en évidence l’impact de l’oxygène sur la polarisation ainsi qu’une liste de nouveaux marqueurs moléculaires. Nous avons également pu faire le lien entre ces résultats à certaines fonctions de macrophages. Notamment, nous avons constaté que le taux de la phagocytose des cellules apoptotiques a augmenté dans les macrophages IL4/IL13-polarisé, qui était liée à la stimulation de l’expression de ALOX15 tel que révélé par l' analyse de protéomique14. Dans la présente étude, nous décrivons comment effectuer une telle analyse.

<table><tbody><tr><td>Hypoxie Poste de travail</td><td>Oxford Optronix</td><td>Hypoxylab</td><td></td></tr><tr><td>C6 Cytomètre en flux</td><td>BD</td><td>Accuri C6</td><td></td></tr><tr><td>Urée</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-6435</td><td></td></tr><tr><td>Acide formique (FA)</td><td>ARISTAR</td><td>450122M</td><td></td></tr><tr><td>R-250 Bleu Coomassie</td><td>Biorad</td><td>1 610 436</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS)</td><td>Calbiochem</td><td>437627</td><td></td></tr><tr><td>2D kit de nettoyage</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6484-51</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 moyen, supplément glutamax</td><td>Gibco</td><td>61870044</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solution d’acides aminés non essentiels (NEAA) 100X</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS) 1X</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column</td><td>Harvard Apparatus</td><td>74-4601</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-Tris 4-12 %</td><td>Life Technologies SAS</td><td>NP0321 BOX</td><td></td></tr><tr><td>CD14 Microbilles humaines</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td></td></tr><tr><td>Colonne de séparation MACS LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-485</td><td></td></tr><tr><td>Interleukine 4 (IL4)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-917</td><td></td></tr><tr><td>Interleukine 13 (IL13)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-112-410</td><td></td></tr><tr><td>Interféron gamma (INF&gamma ;)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-482</td><td></td></tr><tr><td>CD14-FITC (clone T&Uuml ; K4)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-080-701</td><td></td></tr><tr><td>Rotateur de tube MACSmix</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>Acide trifluoroacétique (TFA)</td><td>Pierce</td><td>28904</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine/Lys-C Mix</td><td>PROMEGA</td><td>V5073</td><td></td></tr><tr><td>Mini complet, sans EDTA Cocktail d’inhibiteurs de protéase</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Density Gradient Solution ( Histopaque 1077)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Accumax</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7089-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Sérum humain à partir de plasma AB humain mâle (SAB)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4522-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’albumine sérique bovine (BSA) 30 %</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9576-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Trisma-base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>49767</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Bleu de bromophénol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>114405</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium (SDS) 20 %</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5030</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate d’ammonium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34888</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacétamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57670</td><td></td></tr><tr><td>Thiourée</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9426</td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA Kit de dosage</td><td>ThermoFisher</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Pipette en plastique stérile 5 mL</td><td>VWR</td><td>612-1685</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixeur C Eppendorf VWR</td><td></td><td>460-0223</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak tC18 cartouches en phase inverse, 100 mg</td><td>Waters</td><td>WAT036820</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse protéomique de polarisation des macrophages humains dans un environnement pauvre en oxygène

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Les macrophages sont des cellules immunitaires innées impliqués dans un certain nombre de fonctions physiologiques allant de réactions aux agents pathogènes infectieux à l’homéostasie tissulaire. Les différentes fonctions de ces cellules sont liées à leurs États d’activation, qui est aussi appelé polarisation. La description moléculaire précise de ces polarisations différentes est une priorité dans le domaine de la biologie du macrophage. Il est actuellement reconnu qu’une approche multidimensionnelle est nécessaire pour décrire comment la polarisation est contrôlée par des signaux environnementaux. Dans ce rapport, nous décrivons un protocole visant à obtenir la signature de la protéomique des polarisations différentes dans les macrophages humains. Ce protocole est basé sur une quantification exempte d’étiquette d’expression de protéine macrophage provenant de fractionnés en gel et le contenu de lyse cellulaire Lys C/trypsine-digéré. Nous fournissons également un protocole basé sur la solution en digestion et isoélectrique mise au point de fractionnement à utiliser comme solution de rechange. Parce que la concentration en oxygène est un paramètre environnemental pertinent dans les tissus, nous permet de découvrir la composition de l’atmosphère comment ce protocole ou un environnement pauvre en oxygène influe sur la classification de la polarisation du macrophage.

À partir de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) obtenus par centrifugation différentielle, le protocole permet l’obtention d’une population de CD14+ monocytes avec une pureté mises en recouvrement de plus de 98 % par cytométrie en flux (Figure 1). Ces monocytes sont différencient secondairement vers diverses polarisations (Figure 2). Quand un fractionnement sur gel est choisi, la migration sur gel SDS-p...

Nous présentons un protocole visant à obtenir les signatures de protéomique des macrophages humains et cela s’applique à la détermination de l’impact d’un environnement pauvre en oxygène sur la polarisation de macrophages.

Analyse protéomique de polarisation des macrophages humains dans un environnement pauvre en oxygène

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Ainsi, cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie macrophage, comme la façon de caractériser l’état d’activation sous divers environnements au niveau des protéines. Le principal avantage de cette technique est qu’elle offre la possibilité d’obtenir l’expression différente de nombreuses protéines dans les macrophages humains en utilisant la méthode de quantification sans étiquette. Marie Malier et Magali Court de mon laboratoire feront la démonstration de la procédure.Pour commencer, ajoutez 15 millilitres de solution de séparation cellulaire de gradient de densité dans chacun des deux tubes de centrifugation de 50 millilitres afin que la solution puisse chauffer à température ambiante avant de recevoir le LRSC. Ceci est essentiel car la densité dépend de la température. Videz le LRSC dans un tube de centrifugation de 50 millilitres.Ajouter 1x PBS jusqu’à 50 millilitres et mélanger. Puis, très lentement, ajouter 25 millilitres du mélange sur le dessus de 15 millilitres de solution de gradient de densité équilibrée. Veillez à ne pas mélanger les phases au cours de cette étape.Le sang doit être ajouté sur la solution de gradient de densité sans aucune perturbation de cette phase. Centrifugeuse les deux tubes de centrifugation pendant 25 minutes à 700 G sans pauses. À la fin de la centrifugation du gradient de densité, les couches du bas vers le haut sont les érythrocytes et les granulocytes, formant la pastille, la phase de solution de gradient de densité, une couche de PBMCs, et le plasma dilué.Avec une pipette, passer à travers la phase plasmatique sans l’aspirer. Ensuite, rassemblez la couche PBMC dans un nouveau tube de centrifugation de 50 millilitres. Ajouter jusqu’à 50 millilitres de 1x PBS aux PBMCs comme installation de lavage et centrifugeuse pendant 10 minutes à 300 G.Aspirer le supernatant et suspendre à nouveau la pastille en 40 millilitres de macrophage moyen.Après avoir couché les PBMCs dans une chambre Malassez, transférez la quantité de PBMCs nécessaires à la conduite de l’expérience dans un tube de centrifugation. Centrifuger les cellules pendant 10 minutes à 300 G.Aspirate le supernatant et re-suspendre la pastille dans 80 microlitres du tampon de tri pour 10 millions de PBMCs. Ajoutez ensuite 20 microlitres de microbilles de CD14 pour 10 millions de PBMCs.Bien mélanger et incuber pendant 15 minutes à 4 degrés Celsius sous agitation constante. Après l’incubation, ajouter un millilitre de tampon de tri pour 10 millions de PMC comme étape de lavage, et centrifugeuse comme avant. Ensuite, aspirez le supernatant et suspendez la pastille en 500 microlitres de tampon de tri pour 100 millions de PBMCs.Maintenant, placez une colonne dans le champ magnétique du séparateur. Préparez la colonne en la rinçant avec trois millilitres de tampon de tri. Appliquez la suspension cellulaire sur la colonne.Puis recueillir le flux à travers contenant des cellules non étiquetées pour la coloration ultérieure, si nécessaire. Lavez la colonne trois fois avec trois millilitres de tampon de tri. Veillez à ne pas sécher votre colonne.Ensuite, placez un tube de collecte sous la colonne et retirez-le du séparateur. Après le lavage, pipette cinq millilitres de tampon de tri dans la colonne. Rincez immédiatement les cellules étiquetées magnétiquement en poussant fermement le piston dans la colonne.Enfin, répétez ces étapes avec une nouvelle colonne avant de placage des monocytes et d’effectuer la polarisation macrophage tel que décrit dans le protocole de texte. Maintenir les monocytes et les macrophages dans un environnement contrôlé par l’oxygène pour effectuer une analyse de l’état hypoxique. Utilisez un poste de travail d’hypoxie afin de maintenir les cellules sous la pression partielle d’oxygène désirée pendant l’expérience.Lorsque vous travaillez sous basse pression d’oxygène, il est important de préparer tous les supports et les tampons de lavage sous la station, et d’attendre suffisamment pour obtenir la pression partielle correcte dans le liquide. Effectuez la lyse cellulaire dans un tampon sous un capot adapté. Chargez l’équivalent protéique de 300 000 cellules pour chaque échantillon sur des gels acrylamides de 4-12%bis-tris.Contrôler la durée de la migration électrophoretic pour permettre à chaque échantillon de protéines de se diviser en six bandes de gel comme indiqué ici. Après fixation et coloration décrites dans le protocole textuel, excisez les bandes protéiques avec un scalpel propre. Couper chaque bande excisée en dés avant de la placer dans 500 tubes de microlitres.Maintenant, lavez les tranches de gel trois fois dans 200 microlitres de bicarbonate d’ammonium millimolaire pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius, jetant le bicarbonate d’ammonium entre chaque étape. Suivez ceci avec un lavage dans le bicarbonate de ammonium millimolar et l’acétyonitrile. Ensuite, déshydratez les morceaux de gel avec 200 microlitres de 100% acétyonitrile pendant 10 minutes.Incuber chaque morceau de gel avec 10 millimolar DTT et 25 millimolar ammonium bicarbonate pendant 45 minutes à 56 degrés Celsius. Ensuite, jetez la TNT et incubez le morceau de gel avec de l’iodoacetamide de 55 millimollaires en bicarbonate d’ammonium millimolaire pendant 35 minutes dans l’obscurité à température ambiante. Pour arrêter l’alkylation, jetez la solution utilisée et incubez chaque morceau de gel avec 200 microlitres de 10 millimolar DTT en bicarbonate d’ammonium millimolaire pendant 10 minutes à température ambiante.Laver les morceaux de gel en 200 microlitres de bicarbonate d’ammonium de 25 millimlaires. Ensuite, déshydratez avec 200 microlitres de 100% acetonitrile pendant 10 minutes. Digérer les protéines pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec Trypsin /Lys-C Mix selon les instructions du fabricant.Extraire les peptides qui en résultent des morceaux de gel en ajoutant 50 microlitres de 50% d’acétyonitrile pendant 15 minutes dans des tubes à faible absorption. Après avoir ajouté 50 microlitres d’acide 5% formic pendant 15 minutes, ajouter 50 microlitres de 100% acetonitrile pendant 15 minutes. Tirez et séchez chaque fraction dans des tubes à faible absorption pour limiter l’absorption des peptides et la perte d’échantillon.Stockez les échantillons à 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient analysés plus en détail dans le protocole texte. On y voit la pureté représentative évaluée par cytométrie d’écoulement à la suite de la sélection magnétique des monocytes positifs CD14. L’imagerie de contraste de phase des macrophages humains différenciés montrent l’hétérogénéité des morphologies obtenues pour deux polarisations différentes après neuf jours de culture.Un exemple de digestion hors gel à l’aide de gels de page SDS teintés d’argent est montré. L’évaluation des protéines de la lyse cellulaire et après la digestion en solution montre l’absence de dégradation pendant la lyse et l’efficacité de la digestion. Il est indiqué ici un exemple d’un spectre de dissociation induit par collision d’un peptide trouvé au rapport masse-charge de 597,29 sur le spectre de la SP avec une charge électrique de deux positifs.À partir de ce spectre, la séquence correspondante a été déterminée. Le résultat final après analyse est une carte thermique représentant le regroupement hiérarchique de tous les états de polarisation à l’aide de protéines exprimées différemment. L’analyse révèle un groupe de protéines sur-exprimées dans toutes les polarisations dans l’état d’oxygène de 3%.Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que vous devez d’abord décider quel type de fractionnement vous effectuerez sur de nouveaux échantillons pour adapter votre protocole en conséquence. L’approche protéomique utilisant ces travaux est complémentaire aux approches génomiques qui ont été utilisées au cours des dernières années dans le domaine des études de polarisation de la biologie des macrophages. Après son développement, cette technique ouvre la voie à un chercheur dans le domaine de l’immunologie pour explorer les différents états d’activation des cellules immunitaires chez l’homme et aussi chez d’autres mammifères.N’oubliez pas que travailler avec la TNT pourrait être dangereux, vous devez donc travailler sous un capot adapté pour faire cette procédure.

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