Utilisant amélioré Fluorescence verte exprimant protéines Escherichia Coli pour évaluer la phagocytose des macrophages péritonéaux de souris

Ce protocole a démontré une méthode simple et producible pour évaluer la capacité de phagocytose des macrophages utilisant Escherichia coli EGFP-exprimant. Bonjour, je m’appelle Jun-Yu du Deuxième Hôpital de l’Université Médicale de Dalian. Aujourd’hui, nous allons vous montrer un facile et visualiser la façon d’évaluer la phagocytose macrophage qui peut être facilement fait en moins de deux heures.

Cette méthode a été employée couramment dans l’étude de la fonction immunisée innée. On croit que la fonction immunitaire innée est restée intacte chez les personnes âgées. Aujourd’hui, nous allons donc isoler les macrophages péritonéaux des souris âgées et jeunes et voir la capacité phagocytique de ces deux groupes.

Eh bien, commençons. Tout d’abord, synthétiser le fragment du gène EGFP et cloner le fragment à l’aide de polymése d’ADN Taq haute fidélité. Ensuite, ligate le produit PCR dans le vecteur pET SUMO.

Troisièmement, transformer les produits de ligature en souche E.coli et induire l’expression EGFP avec du lactose. Ces E.coli exprimant l’EGFP ont servi de marqueur pour l’essai de phagocytose. Ensuite, un macrophages péritoine de souris ont été isolés et cultivés.

Puis, e.coli exprimant l’EGFP ont été inventés avec les macrophages pendant une heure à 37 degrés centigrees. Après l’étape d’assaisage, les macrophages étaient prêts pour l’évaluation par microscope de fluorescence et cytomètre d’écoulement. Synthétiser le fragment du gène EGFP et amplifier le fragment à l’aide d’amorces avant et arrière à l’aide d’une polymése d’ADN Taq haute fidélité.

Pour s’assurer que les produits PCR avaient un seul surplomb d’adénine à trois extrémités pour le clonage TA dans l’étape suivante, une extension de 30 minutes à 72 degrés centigrees après le dernier cycle est recommandée. Vérifiez le produit PCR par électrophorèse gel agarose. Si le fragment a été amplifié correctement, une bande de 717 bp peut être observée sur le gel.

Clonez le produit PCR dans le vecteur pET SUMO en utilisant la méthode de clonage TA avec ligase d’ADN T4. Incuber la réaction à température ambiante pendant 30 minutes. Ajouter cinq microlitres de produit PCR dans 100 microlitres de cellules compétentes BL21.

La chaleur choque les cellules à 42 degrés centigrees pendant 90 secondes, puis garder le mélange sur la glace pendant trois minutes. Ajouter 400 microlitres de LB moyen, préchauffé à 37 degrés centigrans. Secousses d’une heure à 37 degrés centigrans et 120 rpm.

Inoculer les bactéries à la surface de la plaque LB avec 100 microgrammes par kanamycine millilitre pour filtrer l’E.coli transformé par vecteur. Incuber la plaque dans le four à 37 degrés centigrans pendant la nuit. Le lendemain, inoculer une colonie positive en cinq millilitres de médias LB avec 100 microgrammes par kanamycine millilitre.

Incuber dans l’incubateur de secousses de 37 degrés à 120 rpm pendant deux heures. Ajouter ensuite le lactose inducteur à une concentration finale de 0,5 millimole par litre et continuer à secouer six heures, induisant l’expression EGFP. Empiriquement, en secouant six heures, l’OD600 peut atteindre 0,7 ou plus.

Enfin, à l’aide d’un microscope à fluorescence pour vérifier l’étendue de l’expression EGFP. Ajouter 10 microlitres du milieu de culture bactérienne à une diapositive. Couvrir ensuite d’un bordereau de couverture.

Examiner l’expression de l’EGFP au microscope à fluorescence. Ajouter 3,5 grammes de thioglycollate dans 100 millilitres d’eau distillée. Stériliser en autoclave avant utilisation.

Aspirer le milieu de thioglycollate dans la seringue stérile d’un millilitre dans le capot. Une souris par seringue pour éviter l’infection. Injectez un millilitre de milieu de thioglycollate de 3,5 % dans la cavité péritonéale de la souris à l’aide d’une aiguille de calibre 23 et maintenez la souris avec de l’eau et de l’ad libitum alimentaire pendant trois jours.

Après trois jours, euthanasier la souris par dislocation cervicale après avoir rapidement induire l’anesthésie par sevoflurane dans une boîte fermée. Ensuite, mettez la souris dans un plat avec 75% d’éthanol pour stériler et transférer dans le capot rapidement. Placez la souris sur la plaque et épinglez la patte avant sur le plateau pour fixer la position de la souris.

À l’aide d’une seringue de cinq millilitres avec une aiguille de calibre 20, injecter cinq millilitres de PBS froid au bas-ventre dans la cavité péritonéale de la souris, en évitant de percer l’intestin. Effectuez un massage doux sur les deux côtés de l’abdomen de la souris. Puis aspirer le liquide abdominal doucement et lentement.

Distribuez le liquide péritonéal dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres. Répétez ces étapes deux ou trois fois. Centrifuger les cellules suspendues pendant 10 minutes à 400 g en quatre à huit centigrades.

Jetez le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire dans rpmi 1640 moyen avec 10% sérum bovin fœtal. Ajoutez cinq millions de cellules dans chaque puits de la plaque de six puits pour l’analyse de cytométrie d’écoulement et 500 000 cellules par puits dans une plaque de 24 puits pour le microscope à fluorescence. Culture des cellules à 37 degrés centigrans dans un incubateur de dioxyde de carbone de 5% pendant la nuit.

Le milieu de culture peut être rafraîchi après trois heures pour enlever les cellules nonherent parce que la plupart d’entre eux étaient des lymphocytes. Observez les cellules sous un microscope à champ lumineux pour évaluer la viabilité cellulaire et la densité cellulaire. L’image montrée ici était dans l’état normal de la cellule primaire.

Habituellement, la densité cellulaire de macrophage n’était pas élevée, parce que la partie principale des cellules péritonéales était lymphocytes. Retirer le milieu de culture de la plaque de 24 puits. Ajouter 100 microlitres de culture fraîche moyenne et 10 microlitres de milieu bactérien.

Puis incuber la plaque à 37 degrés centigrans dans un incubateur de dioxyde de carbone de 5% pendant une heure. Lavez doucement avec 500 microlitres de PBS froid par puits trois à cinq fois pour éliminer les bactéries non intériorisées. Incuber les cellules avec 4% de formaldéhyde dans PBS à température ambiante pendant 30 minutes.

Lavez les cellules avec PBS trois fois. Ajouter la phalloidine 633 conjuguée solution de travail pour tacher F-actin. Conserver dans un endroit sombre et humide à température ambiante pendant 60 minutes.

Ajouter la solution de travail DAPI pour tacher la cellule nucléaire et incuber pendant cinq minutes dans un endroit sombre à température ambiante. Rincer une fois avec PBS et une fois avec le même volume dans de l’eau distillée. L’E.coli exprimant l’EGFP affiché en vert a servi de marqueur de phagocytose.

Pour minimiser les erreurs expérimentales et faire une interprétation correcte des résultats, définissez des groupes et des tubes de commande pour l’expérience telle qu’elle est énumérée dans le tableau 2. Pour le groupe témoin qui sera placé sur la glace, retirez le milieu de la plaque de six puits et lavez-le avec du PBS une fois. Ajouter ensuite 70 millimole par litre d’EDTA froid d’un millilitre dans le puits pour détacher les cellules et les transférer dans le tube de cytométrie d’écoulement.

Ajouter 50 microlitres de suspension bactérienne dans le tube et le placer sur la glace pendant une heure. Pour les autres groupes, retirer le milieu de culture, ajouter un milieu frais millilitre dans chaque puits. Ajouter 50 microlitres de suspension bactérienne dans les puits selon le réglage du groupe tel que décrit dans le tableau deux.

Ensuite, placez la plaque de six puits dans l’incubateur de 37 degrés centigrees 5% de dioxyde de carbone pendant une heure. Pour étancher la fluorescence d’E.coli non intériorisé, ajoutez 200 microlitres de solution d’eau violette cristalline de 0,8 % dans le puits et balancez-vous sous peu. Cette étape visait à éviter un résultat faussement positif par la liaison EGFP E.coli à la surface des macrophages mais non intériorisée.

Lavez les cellules avec PBS trois fois pour enlever toute violette cristalline résiduelle. Ajouter ensuite 70 millimole par litre d’EDTA froid d’un millilitre dans le puits pour détacher les cellules et les transférer dans le tube de cytométrie d’écoulement. Centrifugeuse les tubes 2000 rpm cinq minutes et jeter le supernatant.

Ajouter 100 microlitres de PBS pour résuser les cellules. Ajouter cinq microlitres d’anticorps conjugués F4 ATP dans les tubes ou l’isotype selon le réglage du groupe. Vortex brièvement et incuber les échantillons sur la glace pendant cinq à 10 minutes dans l’obscurité.

Ajouter un millilitre de PBS dans chaque tube et centrifugeuse 2000 rpm cinq minutes. Jeter le surnatant. Resuspendez les granulés cellulaires avec 200 à 300 microlitres de PBS pour l’analyse de cytométrie de flux.

Exécutez chaque tube et obtenez des données pour au moins 10 000 événements de cellules F4/80 positives. Voici les images de fluorescence des macrophages péritonéaux des groupes jeunes et âgés. La fluorescence rouge représente la F-actine.

Le vert représente E.coli exprimant l’EGFP, et le bleu représente le noyau taché par DAPI. Ces images suggèrent que les macrophages de la jeune souris avaient une capacité phagocytique plus forte que ceux de la souris âgée. Les cellules F4/80-positives et EGFP-positives ont indiqué la capacité phagocytique des macrophages.

Ces résultats sont conformes à la tendance des résultats du microscope à fluorescence. Eh bien, vous voyez, bien que le nombre de cellules immunitaires innées peut préservé chez la souris âgée, la capacité phagocytique a diminué de façon significative par rapport à la jeune souris. De nombreuses méthodes ont été utilisées pour évaluer la phagocytose macrophage.

Ici, nous démontrons une méthode améliorée qui est pratique, rapide et économiquement faisable. Avec E.coli exprimant l’EGFP, un essai de phagocytose peut être facilement exécuté et mesuré par le cytomètre d’écoulement et le microscope fluorescent selon les préfère du chercheur. Aussi cette méthode mesure directement la capacité phagocytique.

Les résultats sont plus reproductibles que d’autres méthodes indirectes.