Name: Haut débit en évaluation in Vitro de latence en inversant les Agents sur le VIH Transcription et épissage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-22T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Apprenez une méthode à haut débit pour évaluer l'impact des agents de réactivation de la latence sur la transcription et l'épissage du VIH. Cette technique permet d'induire la réactivation virale et l'élimination du réservoir latent.

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Ce travail a été soutenu par le projet APP1129320 et programme de subvention APP1052979 par le NHMRC australien. Nous remercions le Dr Adam Wheatley, Dr Marina Alexander, Dr Jenny L. Anderson et Michelle Y. Lee pour fournir les concepts essentiels et des conseils pour la réussite de ce travail. Nous remercions également le personnel de DMI Flow Facility pour leurs conseils et leur aide généreuse à maintenir le cytomètre en flux utilisé dans cette étude.

Remarque : Procédures de clonage, séquençage et transformation sont traitées ailleurs18,19. Les protocoles aux présentes commencent de la transfection des vecteurs d’expression chez les mammifères (Figure 3).
1. la transfection de cellules HEK293T avec bicolore journaliste construire
<ol><li>Cultiver des cellules HEK293T au moyen de l’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) additionné de 10 % (v/v) sérum fœtal (SVF), la pénicilline (100 U/mL) et la streptomycine (100 μg/mL) dans un 5 % CO2 incubateur à 37 ° C. Après décongélation, expériences de cellules HEK293T passage 2 ou 3 fois avant de les utiliser dans la transfection. Cela donnerait le temps de cellules pour récupérer de la procédure de décongélation. Mise en garde : La contamination des cultures de cellules de mycoplasmes demeure un problème grave. Bonnes pratiques de laboratoire et de tests de routine des cultures de cellules sont indispensables pour diminuer le risque de contamination par mycoplasmes et éviter la diffusion20.</li>
	<li>Fractionner les cellules 1:2 un jour avant de semer et de les transférer dans un milieu DMEM frais. Cultiver les cellules pendant 24 h dans une étuve à2 CO 5 % à 37 ° C.</li>
	<li>La veille de la transfection, retirer le support de la fiole par aspiration et laver les cellules avec tamponnée au phosphate (SPD) du sérum physiologique de Dulbecco sans calcium (Ca2 +) et magnésium (Mg2 +) pour éliminer les traces de sérum.</li>
	<li>Diluer 5 mL de solution de trypsine-EDTA (10 mM dans du PBS 0,05 %) dans le récipient de culture et placez-le à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 % pendant 2 à 5 min.</li>
	<li>Lorsque les cellules sont détachés, ajouter 5 mL de DMEM supplémenté de 10 % (v/v) de SVF encore inhibe l’activité de la trypsine qui peut-être endommager les cellules.</li>
	<li>Resuspendre doucement en pipettant également, la suspension cellulaire up et down pour briser les agrégats.</li>
	<li>Diluer les cellules 01:10 dans tache bleu trypan (0,4 %).</li>
	<li>Compter les cellules vivantes qui ne prennent pas place trypan bleus à l’aide d’un microscope (objectif x 10) et un hémocytomètre.</li>
	<li>Calculer le nombre de cellules viables par millilitre en prenant la moyenne du nombre d’éléments et en multipliant par 10 000 et par le facteur de dilution (01:10) depuis le bleu trypan tacher.</li>
	<li>Plaque de 2 x 104 cellules dans 100 μl de milieu DMEM supplémenté avec 10 % FBS sans antibiotiques dans une plaque à 96 puits à fond plat pendant 24 h.</li>
	<li>Pour chaque puits, diluer 400 ng de pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed, 20 ng du cmvp-RevNL4.3 et 100 ng du cmvp-Tat101AD8-drapeau ADN dans 50 μl de milieu sans sérum. Mélanger doucement. Pour les expériences sans Tat, utilisez un correspondant vide Tat vector pcDNA3.1 (-). Remarque : L’utilisation de l’ADN exempte d’endotoxine est fortement recommandée. Pour cela, préparer exempte d’endotoxine ADN à l’aide d’un kit de purification d’acides nucléiques midi ou maxiprep. Déterminer la pureté de l’ADN en mesurant le ratio 260/280 OD, qui devrait se situer entre 1,7 et 1,9.</li>
	<li>Mélanger le réactif de lipides doucement avant utilisation, puis diluer 0.65 μL dans 50 μl de milieu sans sérum. Mélanger doucement et laisser incuber 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Combiner l’ADN dilué avec le réactif de lipides dilué.</li>
	<li>Mélanger doucement et laisser incuber pendant 20 min à température ambiante. La solution peut sembler nuageuse. Remarque : Passez à l’étape de 1,15. moins de 30 min.</li>
	<li>Pipeter 100 μL / puits des complexes ADN-réactif lipides goutte-à-goutte sur le dessus des cellules.</li>
	<li>Mélanger doucement en balançant la plaque avant et en arrière.</li>
	<li>
Incuber la plaque pendant 5 h dans une étuve humide 5 % CO2 à 37 ° C.
	<ol>
<li>Chaque mélange réactionnel est suffisant pour une transfection de puits unique (96 puits). Ajustez le montant et volume des composants selon le nombre de médicaments et de combinaison qui serait testé et les comptes de variations de pipetage. Toutes les conditions sont habituellement testées en géométrie.</li>
		<li>Transfecter puits supplémentaires avec 100 ng de plasmide EGFP et ADN DsRed-Express pilotée par le CMV fins d’indemnisation.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. traitement de HEK293T transfectées cellules avec une latence inversion des Agents
Remarque : Avant chaque essai, déterminer l’état physiologique de chaque Ars en mesurant la viabilité des cellules après une exposition à haute et basse dose du médicament avec analyse de prolifération cellulaire.
<ol><li>Diluer chaque LRA à la concentration appropriée de travail avec le milieu de culture (p. ex., 1 μM pour JQ1(+)). Mise en garde : Reconstituer les médicaments lyophilisés avec le solvant approprié à une concentration de 10 mM. Magasin stock toutes les collectivités locales et régionales à-80 ° C dans une aliquote à usage unique (5 μL) afin d’éviter les cycles de gel-dégel répétés.</li>
	<li>Aspirer moyen de transfection avec un multicanal avec précaution et remplacer par 100 milieu μL contenant approprié LRA (tableau 1). Ajouter médium très doucement aux côtés de la paroi du puits afin de détacher les cellules HEK293T transfectées, qui sont connus pour détacher facilement de la surface de plaque de culture.</li>
	<li>Incuber les plaques pendant 48 heures dans une étuve humide 5 % CO2 à 37 ° C.</li>
</ol>3. la coloration des cellules transfectées avec le colorant de viabilité Fixable pour analyse en cytométrie en flux
Mise en garde : Enlever les débris et les cellules mortes est essentiel pour éliminer les faux positifs et d’obtenir des résultats de haute qualité.
<ol><li>Détacher les cellules dans les médias à l’aide de 100 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) par puits et par doucement pipetage va-et-vient (~ 5 fois) avec un multicanal, tout en évitant de faire mousser des médias. Le cas échéant, détacher les cellules de la plaque avec 35 µL / puits d’une solution de trypsine-EDTA (10 mM dans du PBS 0,05 %) et en laissant incuber 5 min à 37 ° C, avant de neutraliser avec milieu contenant du sérum.</li>
	<li>Les cellules de transfert à une plaque de fond en V 96 puits.</li>
	<li>Faites tourner les cellules pendant 5 min à 500 x g à 4 ° C, puis aspirer soigneusement le support/PBS sans toucher les cellules.</li>
	<li>Laver les cellules au moins 1 fois avec 200 μL de sérum protéine libre PBS.</li>
	<li>Centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C, puis jeter le surnageant en inclinant la plaque et en supprimant le tampon de lavage sans toucher les cellules.</li>
	<li>Préparer une solution de colorant de viabilité fixable par dilution au 1/1000 de colorant viabilité dans du PBS libre de protéine/sérum. Préparer 50 µL de la tache diluée par puits. Remarque : Colorants de viabilité sont disponibles dans une gamme de couleurs appropriés pour l’usage avec des lasers bleus, rouges et violettes. Préparer une solution de colorant de viabilité fixable par resuspendant un flacon de teinture lyophilisée (composant A) avec 50 μL de DMSO anhydre (composant B). Conserver à-20 ° C dans un aliquote de l’usage unique (1 μL), abri de la lumière.</li>
	<li>Ajouter 50 μL de la teinture de viabilité dilué dans chaque puits et mélanger les cellules par pipetage de haut en bas avec un multicanal.</li>
	<li>Détachant pendant 10-15 min à 4 ° C, abri de la lumière.</li>
	<li>Laver 1 ou 2 fois avec 150 μl de tampon de lavage (PBS 1 % bovine serum albumine et 2 mM EDTA).</li>
	<li>Centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.</li>
	<li>Fixer les cellules avec 100 μL de fraîchement préparée 1 % de formaldéhyde dans le tampon de lavage pendant 10-15 min à 4 ° C dans l’obscurité. Mise en garde : Le formaldéhyde est très toxique. Préparer la solution de formaldéhyde de 1 % dans une hotte aspirante pour éviter toute inhalation tout en portant des gants et des lunettes de protection.</li>
	<li>Laver les cellules 1 - 2 fois avec 100 μL de tampon de lavage.</li>
	<li>Centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.</li>
	<li>Resuspendre le culot dans 70 μL de tampon de lavage. Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Les cellules fixes pourraient être stockés à 4 ° C dans l’obscurité pour analyse le lendemain sur le cytomètre en flux.</li>
</ol>4. EGFP et mesures DsRed par cytométrie en flux et analyse des données
Remarque : Analyser la transcription du VIH (% EGFP) et épissage (% DsRed) sur un cytomètre en flux. Filtrer l’échantillon avant la course avec une cellule-crépine 70 μm ou mailles de nylon 100 μm pour éviter d’obstruer la buse.
<ol><li>Démarrer le cytomètre et l’ordinateur au moins 10 min avant de l’utiliser pour réchauffer les lasers.</li>
	<li>Avant exécution exemples et commençant d’acquisition de données, remplissez le réservoir de la gaine avec la solution saline à 0,9 % et faire en sorte qu’un comprimé d’hypochlorite de sodium est ajouté pour le réservoir à matières.</li>
	<li>Vérifier les cellules de circulation pour les bulles d’air.</li>
	<li>Vérifiez que les détecteurs et les filtres sont appropriés pour l’expérience. Remarque : Pour EGFP, utilisation de laser bleu (488 nm) et passe-bande 530/30, tandis que DsRed Express est parfaitement détecté en utilisant le laser jaune (561 nm) et passe-bande 610/20. Un laser bleu (488 nm) et passe-bande 610/20 peut également être utilisé pour détecter l’expression DsRed.</li>
	<li>Vérifier le cytomètre performance et la sensibilité à travers des détecteurs en exécutant les perles de l’étalonnage.</li>
	<li>Ajuster l’attaquant (FSC-A) et des tensions de dispersion (SSC-A) côté avec non souillées enregistré l’échantillon alors que la population principale est à l’écran et clairement discernable. Remarque : FSC (lumière diffusée vers l’avant) est une mesure de la lumière par diffraction dans un angle plat, qui dépend du volume de la cellule (cell surface ou taille), tandis que SSC (côté-la lumière diffusée) est une mesure de diffraction de la lumière à angle droit, qui est proportionnelle à granularité de la cellule et de la complexité interne.</li>
	<li>Effectuer une compensation manuelle ou automatique en utilisant les échantillons colorés à l’unique assurant des retombées minimes de population EGFP + dans la DsRed détecteur et vice versa. Mise en garde : À des fins d’indemnisation, utiliser un échantillon de cellules exprimant chacun de la protéine fluorescente de couleur unique, mais aussi les cellules colorées individuellement avec le colorant de viabilité réparable. Ne pas utiliser les perles de compensation FITC et PE pour EGFP et DsRed compensations de protéines fluorescentes en raison des caractéristiques spectrales différentes. Contrôles de compensation devraient être suffisamment lumineux pour résoudre positive et négative de la population.</li>
	<li>Créez des parcelles et définissez les portes à l’aide de fluorescence moins un contrôles (FMO).</li>
	<li>Acquérir et enregistrer un minimum de 10 000 événements de cellules viables par exemple. Exécution d’échantillons à vitesse moyenne ou basse pour éviter les doublets en passant par l’intersection de laser. Utiliser l’impulsion géométrie gating tels que SSC-A contre SSC-H pour éliminer les doublets. Vérifier la stabilité de la course et en temps / SSC-A pour voir que même le flux est pendant la course.</li>
	<li>À la fin de la course, nettoyer la fluidique de cytométrie en flux avec les agents de nettoyage concentrés puis d’eau de 5 min chacun.</li>
	<li>Arrêter le système, jeter les déchets et re-remplir le réservoir de la gaine après acquisition.</li>
	<li>Analyser les données à l’aide d’un logiciel d’analyse de données écoulement cytometry. Exclure les débris cellulaires et touffe (doublets) basé sur la diffusion vers l’avant et latérale, puis éliminer les cellules mortes à l’aide de la tache de colorant de viabilité (négatif population = cellules vivantes). Identifier les cellules exprimant EGFP et DsRed (Figure 4), ainsi que le pourcentage du produit épissé DsRed /(DsRed + EGFP) (Figure 5).</li>
	<li>Déterminer l’effet de la LRA sur la VIH transcription et épissage en comparant des cellules non traitées et les cellules exposées à la personne physique ou une combinaison des ALE (Figure 5).</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Compte tenu de la difficulté de mesurer une réactivation du virus ex vivo, un large éventail d’in vitro modèles ont été développés au fil du temps afin d’étudier la latence du VIH, y compris de manière latente infectée lignées de cellules T (J-Lats, ACH2, U1), modèles primaires de l’infection latente de repos) O ' Doherty, Lewin, Greene et Spina modèles) ou des cellules T CD4 + pré-activé (Samir, Marini, Planelles, Siliciano, Karn modèles) avec simple ronde ou réplication journaliste compétente virus22<...

Malgré un traitement antirétroviral à long terme efficace, le VIH persiste dans un état latent comme un provirus intégré dans la mémoire de cellules T CD4 +1. La structure de la chromatine du VIH-1 5 « promoteur de longue répétition terminale (LTR) et des modifications épigénétiques telles que la méthylation des histones et désacétylation par ADN méthyltransférases (DNMT) et les histones désacétylases (HDAC) sont des mécanismes importants conduisant à la répression transcriptionnelle et donc post-intégration latence2,3. Une grande variété d’agents d’inversion (ALE) de la latence a été étudiée pour leur efficacité induire la production de virus in vitro et in vivo de manière latente infectés au repos T CD4 + cellules4,5,6,7 ,,8. Parmi les LRA testés, HDACi (inhibiteurs d’HDAC) et inhibiteurs de la côté du pari (BETis) induisent la décondensation de la chromatine et la libération de la transcription positive élongation facteur b (P-TEFb) respectivement, conduisant aux soulager de la transcription répression à la 5' LTR et activation du VIH expression9,10,11,12,13. Toutefois, l’ampleur de la réactivation atteindre par ces collectivités locales et régionales ne se limitait qu’une modeste augmentation associée aux cellules unspliced VIH ARNm (nous RNA), indicatif de transcription virale, a été observée ex vivo14,15. Ce qui est important, ces collectivités locales et régionales a également omis d’induire une diminution de la fréquence des cellules infectées de façon latente.
Expression du VIH peut être encore plus restreint par épissage inefficace16 ainsi que les défauts dans les exportations nucléaires de multiplier épissés ARN VIH (MS RNA)17. Ainsi, l’identification de nouvelles catégories de collectivités locales et régionales qui sont plus puissants et peuvent affecter des aspects distincts de virus production après intégration sont nécessaires. En outre, le développement de nouveaux tests qui aident à définir les composés optimales pour contrer efficacement les temps de latence est nécessaire.
Ici, un protocole est présenté, qui utilise une approche de haut débit pour l’évaluation fonctionnelle de l’impact des interventions axées sur le VIH LTR transcription et épissage. En bref, un nouveau duel axée sur le LTR couleur journaliste système pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (Figure 1) est utilisé pour évaluer la réactivation du VIH par cytométrie en flux. Dans ce journaliste fluorescent, l’expression de l’ARNm de VIH unspliced (4Ko) conduit à l’expression de la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP), tandis que l’expression de l’ARNm épissé (2KO) conduirait à Acropora SP rouge (DsRed) expression de la protéine fluorescente. En bref, nous avons utilisé une protéine de fusion Env-EGFP fluorescente, gp140unc. EGFP, où la séquence codante de EGFP a été mises en image avec une forme non clivée et tronquée de l’enveloppe (Env). Modifications ont été apportées pour l’ablation du site de clivage empêche la dissociation des Env en gp120 et gp41-EGFP et de tronquer les protéines gp160 avant le domaine transmembranaire créent un analogue Env soluble qui facilite le pliage correct et expression de EGFP. Lors de l’expression dans une cellule, Rev se localise dans le noyau où il intervient dans les exportations nucléaires et cytoplasmiques 4Ko env ARNm via l’interaction avec l’élément sensible de rev (RRE). La troncation d’Env ne compromet pas le RRE, qui se trouve entre le site d’épissage A7 3' gp120 et gp41. Dans ce système, épissure au VIH-1 donneur 4 (SD4) d’épissure et épisser accepteur 7 (SA7) entraîne la production d’un 2KO ARNm codant pour une protéine Rev non fonctionnels sont tronquée lorsque l’acide aminé 38 fusionnée à la protéine fluorescente DsRed, RevΔ38-DsRed. En bref, DsRed a été inséré dans l’exon 2nd de Rev à acides aminés 38 par chevauchement extension18. Afin de faciliter l’exportation nucléaire des ARNm unspliced, un vecteur d’expression mammifère encodage Rev (cmvp-RevNL4.3) a été conjointement transfecté avec la construction de journaliste fluorescent (Figure 2). Cette construction unique journaliste décrite ici est utile dans l’évaluation de haut débit de transcription de VIH et d’épissage, sans la nécessité d’utiliser des vecteurs viraux.

<table><tbody><tr><td>< forte > culture cellulaire </forte ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>cellules HEK293T (cellules rénales embryonnaires humaines)</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>Réplique les vecteurs porteurs de la région de réplication SV40.</td></tr><tr><td>Milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM 1x + GlutaMAX-I)</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td>+ 4,5 g/L D-Glucose + 110 mg/L de pyruvate de sodium</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Gibco</td><td>10099-141</td><td>Origine Australie</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Sigma</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS), sans calcium, sans magnésium</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Coloration au bleu de trypan, 0,4 %</td><td>Gibco</td><td>15250</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,05 %), rouge de phénol</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Réactif de transfection lipidique</td></tr><tr><td>Opti-MEM I (1x) milieu sérique réduit</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Milieu sans sérum</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi</td><td>Marcherey-Nagel</td><td>740414.50</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide pEGFP-N1</td><td>Clontech (TaKaRa)</td><td>6085-1</td><td>Expression de l’EGFP dans les cellules de mammifères, CMVIE promoteur.</td></tr><tr><td>pDsRed-Express-N1</td><td>Clontech (TaKaRa)</td><td>632429</td><td>Expression de DsRed-Express dans des cellules de mammifères, CMVIE promoteur.</td></tr><tr><td>pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed</td><td>Addgene</td><td>115775</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-RevNL4.3</td><td>Addgene</td><td>115776</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-Tat101AD8-Flag</td><td>Addgene</td><td>115777</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Millipore</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>JQ1(+)</td><td>Cayman Chemical</td><td>11187</td><td>Stock à 10 mM dans le DMSO ; concentration de travail 1 &mu ; M</td></tr><tr><td>JQ1(-)</td><td>Cayman Chemical</td><td>11232</td><td>Stock à 10 mM dans DMSO ; concentration de travail 1 &mu ; </td></tr><tr><td>M Phorbol Myristate Acétate (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16561-29-8</td><td>Stock à 100 &mu ; g/mL dans le DMSO ; concentration de travail 10 nM</td></tr><tr><td>Phytohémagglutinine (PHA)</td><td>Remel</td><td>HA15/R30852701</td><td>Stock à 1 &mu ; g/&mu ; L dans PBS ; Concentration de travail 10 &mu ; g/mL</td></tr><tr><td>Vorinostat (VOR)</td><td>Cayman Chemical</td><td>10009929</td><td>Stock à 10 mM dans le DMSO ; concentration de travail 0,5 &mu ; M</td></tr><tr><td>Panobinostat (PAN)</td><td>TRC</td><td>P180500</td><td>Stock à 10 mM dans le DMSO ; concentration de travail 30 nM</td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Prolifération Assay</td><td>Promega</td><td>63581</td><td></td></tr><tr><td>Venor GeM Classic</td><td>Minerva Biolabs</td><td>11-1100</td><td>Kit de détection de mycoplasmes, basé sur</td></tr> <tr><td>PCRName</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Réactifs de cytométrie en flux</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR Fortessa</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Cytomètre en flux (4 lasers-bleu, rouge, violet et jaune)</td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Cytomètre en flux (3 lasers-bleu, rouge et violet)</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit</td><td>Life Technologies</td><td>L34976</td><td>Colorant de viabilité : pour une excitation de 633 ou 635 nm, 400 dosages. Les composants A et B sont tous deux fournis dans le kit.</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5M pH8</td><td>Gibco</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Solution de formaldéhyde 37/10 (37 %)</td><td>Chem-Supply</td><td>FA010</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Diva CS& T Research Beads</td><td>BD Biosciences</td><td>655050</td><td>Perles d’étalonnage</td></tr><tr><td>Sphero Rainbow Calibration Particles (8 pics)</td><td>BD Biosciences</td><td>559123</td><td>3.0 - 3.4 mm</td></tr><tr><td>Solution de gaine</td><td>Chem-Supply</td><td>SA046</td><td>90 g de NaCl dans 10 L d’eau</td></tr><tr><td>HAZ-Tabs</td><td>Guest Medical</td><td>H8801</td><td>Pastilles de libération de chlore pour la désinfection</td></tr><tr><td>Decon 90</td><td>Decon Laboratories Limited</td><td>N/A</td><td>Agents de nettoyage concentrés du cytomètre en flux. Solution de travail Decon 90 5 %.</td></tr><tr><td>Hypochlorite de sodium (solution à 12-13 %)</td><td>Labco</td><td>SODHYPO-5L</td><td>Agents nettoyants concentrés de cytomètre en flux. Solution de travail eau de Javel 1 %.</td></tr><tr><td>7x</td><td>MPBio</td><td>IM76670</td><td>Agents de nettoyage concentrés de cytomètre en flux. Solution de travail 7x 1 %.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Matériaux</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flacons de culture tissulaire (75 cm2, col incliné, capuchon ventilé)</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire (fond plat 96 puits avec couvercle)</td><td>Costar</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire (96 puits à fond en V sans couvercle)</td><td>Costar</td><td>3896</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger (10 mL)</td><td>SARSTEDT</td><td>62.9924.284</td><td>100x16 mm</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger (50 mL)</td><td>CellStar</td><td>227261</td><td>30x115 mm</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger (1,5 mL)</td><td>Corning Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger Pipette (25 mL),</td> pipette sérologique stérile <td>Corning</td><td>CLS4489-200EA</td><td></td></tr><tr><td>(10 mL),</td> pipette sérologique stérile <td>Corning</td><td>CLS4488-200EA</td><td></td></tr><tr><td>(5 mL), réservoirs de réactifs stériles</td><td>Corning</td><td>CLS4487-200EA</td><td></td></tr><tr><td>(50 mL),</td> tube à essai stérile en polystyrène <td>Corning</td><td>CLS4470-200EA</td><td></td></tr><tr><td>5 mL, avec capuchon de crépine</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>12 x 75 mm en nylon, 70 mm</td></tr><tr><td>en nylon</td><td>SEFAR</td><td>03-100/32</td><td>100 mm</td></tr><tr><td>Titertube Micro tubes à essai, en vrac</td><td>BIO-RAD</td><td>2239391</td><td>tubes microfacs</td></tr><tr><td>5 mL Tube à essai en polystyrène à fond rond, sans capuchon</td><td>Corning</td><td>352008</td><td>12x75 mm style</td></tr><tr><td>Snap Caps pour tubes à essai 12x75 mm</td><td>Corning</td><td>352032</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de comptage, double ligne à filet amélioré Neubauer, ligne claire (hémocytomètre, LO-Laboroptik)</td><td>ProSciTech</td><td>SVZ4NIOU</td><td>3x3 grands carrés de 1 mm2 ; Profondeur 0,100 mm ; volume 0,1 mL ; surface minimale 0,0025 mm2</td></tr><tr><td>lamelles (Menzel-Gl&auml ; Ser)</td><td>Grale Scientific</td><td>HCS2026</td><td>Microscope 20 x 26 mm</td></tr><tr><td></td><td>Nikon TMS</td><td>310528</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810R 5811000487 réfrigérée</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>avec rotor A-4-81 avec adaptateurs pour tubes coniques 15/50 mL Lecteur de</td></tr><tr><td>microplaques FLUOstar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td>N/A</td><td>Lecteur de plaques pour test de prolifération cellulaire. Filtre 490 nm.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Diva</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Programme d’acquisition et d’analyse de données de cytomètre en flux, version 8.0.1</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td>FlowJo 10.4.2</td><td>Programme d’analyse de données de cytomètre en flux, FlowJo Engine v3.05481</td></tr><tr><td>Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>FLUOstar contrôle du lecteur multi-utilisateurs, version 5.11</td></tr><tr><td>Omega - Analyse de données</td><td>BMG Labtech</td><td>MARS</td><td>FLUOstar analyse de données, version 3.20R2</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>Excel :mac 2011</td><td>version 14.0.0</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td>Prism 7</td><td>version 7.0c</td></tr></tbody></table>

haut débit en évaluation in vitro de latence en inversant les agents sur le vih transcription et épissage

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

Le VIH reste incurable en raison de l’existence d’un réservoir de cellules qui recèle une forme stable et latente du virus, qui reste invisible pour le système immunitaire et n’est pas ciblée par l’antirétroviraux actuels (cART). Transcription et épissage ont démontré que renforcer la latence du VIH-1 au repos des cellules T CD4 +. Inversion de la latence de l’utilisation d’agents de renversement de latence (ALE) dans l’approche de « choc et d’abattage » a été largement étudiée dans le but de purger ce réservoir mais n’a jusqu'à présent pas montré aucun succès dans les essais cliniques en raison du manque de développement des petits adéquate molécules qui peuvent perturber efficacement de ce réservoir. Le protocole présenté ici fournit une méthode pour efficacement et de façon fiable évaluer les agents de renversement de latence (alr) sur la transcription du VIH et l’épissage. Cette approche repose sur l’utilisation d’un journaliste bicolore axée sur le LTR qui permet de mesurer simultanément les effets d’un LRA transcription et épissage par cytométrie en flux. Le protocole décrit ici est suffisant pour les cellules adhérentes, mais aussi les cellules en suspension. Il est utile pour tester un grand nombre de médicaments dans un système à haut débit. La méthode est techniquement simple à mettre en œuvre et économique. En outre, l’utilisation de la cytométrie permet l’évaluation de la viabilité cellulaire et toxicité des médicaments donc en même temps.

Résultats représentatifs sont indiquées à la Figure 5 pour l’expression de HIV-1 unspliced (EGFP) et épissé (DsRed) produits après le traitement par l’inhibiteur de la côté du JQ1. Fois JQ1(+) et Tat a augmenté significativement le pourcentage de cellules exprimant EGFP (2.18 et 4.13 FC au DMSO respectivement ; n = 3) indicatifs des transcriptions unspliced. Par ailleurs, JQ1(+) a considérablement augmenté le pourcentage de cellules exprimant DsRed (46,6 FC a...

Un protocole de haut débit pour l’évaluation fonctionnelle de la réactivation efficace du VIH et de la clairance du provirus latentes est décrite et appliqué en testant l’impact des interventions sur la transcription de VIH et d’épissage. Des résultats représentatifs de l’effet de latence inversant agents sur LTR axée sur la transcription et épissage sont fournis.

Haut débit en évaluation in Vitro de latence en inversant les Agents sur le VIH Transcription et épissage

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...

L’objectif global de cette procédure est d’évaluer in vitro, l’impact des agents inversion de latence sur le traitement de l’ARNm vih. Le protocole fournit une méthode simple et efficace pour évaluer, simultanément, l’effet de la LRA sur la transcription et l’épissage du VIH. Cette technique a permis de mieux comprendre la capacité des AL d’induire la réactivation et le dégagement du réservoir latent.Après avoir cultivé des cellules, placez 20 000 d’entre elles dans 100 microlitres de DMEM moyen, complétées par 10% FBS, et sans antibiotiques dans les puits d’une plaque inférieure plate de 96 puits pendant 24 heures. Le lendemain diluer la construction journaliste double couleur. Adn de Tat et Rev dans 50 microlitres de milieu sans sérum, et mélanger délicatement.Mélanger délicatement le réaccente lipidique, puis diluer 0,65 microlitres de celui-ci par réaction dans 50 microlitres de sérum moyen libre. Mélanger délicatement et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Mélanger le réaccente lipidique diluée avec l’ADN dilué et mélanger délicatement.Incuber à température ambiante pendant 20 minutes. Ensuite, distribuez 100 microlitres de ce complexe d’ADN de réagent lipidique goutte sage, sur le dessus des cellules dans chaque puits. Faire basculer délicatement l’assiette d’avant en arrière pour mélanger.Et incuber la plaque dans un incubateur humidifié, à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant cinq heures. Après cela, transfect puits supplémentaires avec 100 nanogrammes de CMV conduit EGFP et DsRed plasmide d’ADN express à des fins de compensation. Pour commencer, diluer chaque agent inversant de latence à l’état de fonctionnement approprié avec le milieu de croissance.À l’aide d’une tête de tuyau multicanal, aspirez soigneusement le milieu de transfection et remplacez-le par 100 microlitres de milieu contenant l’agent inverseur de latence approprié. Incuber dans un incubateur humidifié à 37%celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 48 heures. Pour commencer à tacher les cellules, utilisez une tête de tuyau multicanal pour ajouter 100 microlitres de PBS à chaque puits.Dirigez doucement la tête vers le haut et vers le bas environ cinq fois. Tout en s’assurant d’éviter la mousse pour détacher les cellules dans les médias. Ensuite, transférez les cellules dans les puits d’une plaque v-fond de 96 puits.Centrifugeuse à 500 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Aspirer le milieu et le PBS sans toucher les cellules. Lavez les cellules au moins une fois avec 200 microlitres de protéines et de sérum sans PBS.Centrifugeuse à 500 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Inclinez la plaque pour jeter le surnatant et retirez le tampon de lavage sans toucher les cellules. Après cela diluer le colorant de viabilité fixe dans la protéine et le sérum sans PBS à un rapport de 1 à 1000, pour préparer une solution de travail.Ajouter 50 microlitres de colorant dilué à chaque puits, et la tête de tuyau de haut en bas pour mélanger. Incuber à quatre degrés Celsius. Bien qu’il soit protégé de la lumière à l’aide de papier d’aluminium pendant 10 à 15 minutes.Lavez ensuite les cellules une ou deux fois avec 150 microlitres de tampon de lavage. Après cela, centrifugeuse à 500 fois la gravité, et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes, et jeter le supernatant. Pour fixer les cellules, ajouter 100 microlitres de formaldéhyde fraîchement préparé 1% et laver tampon.Et incuber à quatre degrés Celsius tout en étant protégé de la lumière pendant 10 à 15 minutes. Après cela, laver les cellules une ou deux fois avec 100 microlitres de tampon de lavage. Centrifugeuse à 500 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.Jetez le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire dans 70 microlitres de tampon de lavage. Après avoir vérifié les performances et la sensibilité des réglages du cytomètre en exécutant des perles d’étalonnage, ajustez les tensions de dispersion avant et latérale avec un échantillon non taché, de sorte que la population principale soit à l’écran et clairement discernable. Effectuez une compensation manuelle ou automatique en utilisant les échantillons tachés simples, assurant un déversement minimal de la population positive EGFP dans le détecteur DsRed et vice versa.En utilisant la fluorescence moins un contrôle, créer des parcelles et définir les portes. Ensuite, ajustez les tensions de dispersion avant et latérale avec un échantillon non taché, de sorte que la population principale est à l’écran et clairement discernable. Acquérir et enregistrer un minimum de 10 000 événements cellulaires viables par échantillon.Après cela, utilisez le logiciel d’analyse des données de cytométrie de flux pour analyser les données telles qu’elles sont décrites dans le protocole texte. Les résultats représentatifs pour l’expression des produits séropositifs, non épissés et épissés, après traitement avec l’inhibiteur du bromodomain JQ1, montrent que le JQ1 positif et le Tat augmentent considérablement le pourcentage de cellules exprimant l’EGFP. Ce qui est révélateur de transcriptions non compliquées.JQ1 positif est également vu pour augmenter considérablement le pourcentage de cellules exprimant DsRed. Et augmenter la proportion de produits épissés à des niveaux similaires à Tat. Cela confirme la capacité de JQ1 positif à activer la transcription et l’épissage du VIH.Cependant, le traitement par un contrôle stéréoisomer JQ1 négatif, abolit l’effet positif JQ1 sur la transcription et l’épissage du VIH. Une fois maîtrisée, cette méthode peut être effectuée en utilisant des médicaments individuellement ou en combinaison. Test pour leur capacité à synergiser efficacement.Ce qui conduirait à une dose plus faible du médicament et la toxicité. Après chaque développement, cette technique a ouvert la voie à l’essai des combinaisons efficaces de drogue dans les modèles primaires de latence dans les échantillons de patient ex vivo.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Décapsidation est une étape essentielle dans la phase précoce du cycle de vie du VIH-1 et est défini comme le démontage de la coquille de capside et la libération des complexes de ribonucléoprotéines virales (vRNP). Ici, nous montrons des techniques pour isoler des noyaux intacts à partir de virions VIH-1 et pour quantifier leur...

En décapsidation in vitro du VIH-1 Cores

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

Nous décrivons ici la cytotoxicité cellulaire et simples essais d'infectivité rondes qui permettent la sélection rapide et précise des composés de déterminer leur cytotoxicité cellulaire (CC 50) et les valeurs IC50 contre WT et VIH-1 résistant médicament.

Dépistage rapide du VIH de la transcriptase inverse et inhibiteurs de l&#39;intégrase

La pathogenèse du VIH-1 est définie à la fois par les caractéristiques virales et les facteurs génétiques de l’hôte. Nous décrivons ici une méthode robuste qui permet d’effectuer des mesures reproductibles pour évaluer l’impact de la variation de la séquence du gène gag sur la capacité de réplication in vitro du virus.

Une enzyme de restriction basée sur le clonage méthode pour évaluer la<em&gt; In vitro</em&gt; Capacité de réplication du VIH-1 sous-type C Gag-MJ4 chimériques virus

Nous décrivons un protocole permettant d’amplifier les sites d’intégration rétrovirale à partir de l’ADN génomique des cellules infectées, de séquencer les jonctions virus-hôte amplifiées, puis de cartographier ces séquences sur un génome de référence. Nous décrivons également des techniques pour quantifier la distribution des sites d’intégration par rapport à diverses annotations génomiques à l’aide de BEDTools.

Amplification, Séquençage de nouvelle génération, et l&#39;ADN génomique Cartographie des rétrovirales Sites d&#39;intégration

Des méthodes d’évaluation de l’efficacité et de la toxicité des molécules d’ARN ciblant les étapes post-intégration du cycle de réplication du VIH-1 sont décrites. Ces méthodes sont utiles pour cribler de nouvelles molécules et optimiser le format des molécules existantes.

Évaluation de l&#39;efficacité et la toxicité des ARNs Ciblage VIH-1 Production pour utilisation en thérapie génique ou des médicaments

Ce rapport décrit un test in vitro pour mesurer l’activité d’intégration associée au complexe de préintégration (PIC) du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) dans les extraits cytoplasmiques de cellules gravement infectées. L’intégration de l’ADN du VIH-1 associé au PIC dans l’ADN cible hétérologue est quantifiée à l’aide d’une stratégie de réaction en chaîne par polymérase en temps réel emboîtée.

Mesure de In vitro Activité d'intégration du VIH-1 préintégration Complexes

Nous décrivons un essai pour signaler sur la fusion VIH-1 par l’expression de la protéine fluorescente verte détectable par microscopie à écoulement cytometry ou fluorescence cellulaire. Il peut être utilisé pour tester les inhibiteurs d’entrée virale (plus précisément à l’étape de fusion) dans les systèmes de l’infection sans cellule et cellule-cellule.

Un haut débit Cre-Lox activé Membrane virale Fusion test afin d’identifier les inhibiteurs de la Fusion membranaire virale du VIH-1

Ce protocole fournit une méthode pour établir des souris humanisées (hu-NSG) via intrahépatique injection de cellules souches hématopoïétiques humaines à des souris NSG néonatales conditionné par rayonnement. La souris de l’hu-NSG est sensible à l’infection par le VIH et combinatoire antirétrovirales (cART) et sert de modèle physiopathologique adapté pour les enquêtes de réplication et latence du VIH.

(Hu-NSG) souris humanisée NOD/SCID/IL2rγnull modèle d’études de latence et de réplication du VIH

Nous présentons une approche de séquençage en profondeur qui fournit une détermination impartiale du naissant 3'-termini ainsi que des profils de mutations des molécules d’ADN simple brin. L’application principale est la caractérisation de naissants DNAs rétrovirales complémentaires (ADNc), les intermédiaires générés lors du processus de transcription inverse rétrovirale.

Déterminant des séquences de molécules monocaténaires naissant de l’ADN Viral au cours du VIH-1 et 3'-Termini Reverse Transcription dans les cellules infectées

Nous décrivons ici certaines méthodes établies pour déterminer le stress du réticulum endoplasmique (RE) et l’activation de la réponse protéique dépliée (UPR), en mettant l’accent sur l’infection par le VIH-1. Cet article décrit également un ensemble de protocoles pour étudier l’effet du stress du RE/UPR sur la réplication du VIH-1 et l’infectiosité du virion.

Mesure du stress du réticulum endoplasmique et de la réponse protéique dépliée dans les lymphocytes T infectés par le VIH-1 et analyse de son rôle dans la réplication du VIH-1

Apprenez une méthode à haut débit pour évaluer l'impact des agents de réactivation de la latence sur la transcription et l'épissage du VIH. Cette technique permet d'induire la réactivation virale et l'élimination du réservoir latent.

Haut débit en évaluation in Vitro de latence en inversant les Agents sur le VIH Transcription et épissage

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