Expression et Purification de l’homme sensible lipides canal de Cation TRPC3 pour la détermination de structure par particule Cryo microscopie électronique

Ce protocole nous a permis de résoudre la structure de trpc3 humain, un membre d’une famille importante, mais sous-étudiée de canaux iion. Le principal avantage de cette technique est la grande efficacité avec laquelle elle peut être appliquée pour exprimer et purifier une variété de protéines, pour des études structurelles et fonctionnelles. Cette méthode peut fournir un système efficace d’expression et de purification des protéines, pour une utilisation dans l’étude de la biochimie des protéines et de la biophysique et peut être appliquée à une grande variété de canaux irionaux et d’autres protéines membranaires.

Tout d’abord, vérifiez l’expression relative du virus en regardant la fluorescence GFP du virus dans un échantillon de la culture productrice de virus. Dans un flacon de culture erlenmeyer inférieur déconcerté de taille suffisante, préparez un volume souhaitable d’une culture de suspension cellulaire de mammifère HEK293, à une concentration de 3,5 à 3,8 millions de cellules par millilitre dans le milieu d’expression, complétée par 1% de FBS stérile. Ajouter 8 % en volume de solution préparée de stock de virus P2 et incuber dans un Shaker orbital à 37 degrés Celsius et 135 rPM.

À 12 à 18 heures après l’infection ajouter 10 millimolaires de butyrate de sodium, incuber à 30 degrés Celsius pour la quantité de temps nécessaire pour l’expression optimale des protéines. Après cela, centrifugeuse à 2880 fois la gravité pendant 20 minutes pour récolter les cellules. Laver et résuser les cellules en environ 100 millilitres de SCT par litre de cellules récoltées.

Centrifugeuse à nouveau à 2880 fois la gravité pendant 20 minutes et de recueillir la pastille cellulaire. Recueillir également de petites récoltes de granulés de cellules d’un millilitre à différents moments et solubiliser pendant deux heures à quatre degrés Celsius avec agitation en présence de différents détergents et/ou additifs. Clarifiez ces petits échantillons solubilisés à cellules entières par ultracentrifugation à 235 000 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Ensuite, exécutez-les sous forme d’échantillons de 30 microlitres sur une colonne de chromatographie SEC, afin de déterminer le meilleur moment pour l’expression et les meilleures conditions de solubilisation. Décongeler la pastille en 100 millilitres de tampon par litre de cellules récoltées. Une fois les cellules décongelées, pipette ou remuer pour s’assurer que la solution est homogène.

Laissez les cellules solubiliser à quatre degrés Celsius dans un bécher immergé dans la glace pendant deux heures tout en étant agité par une barre d’agitation. Ensuite, retirez les débris cellulaires par ultracentrifugation à 235 000 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant une heure. Exécutez un échantillon de 30 microlitres du supernatant sur une colonne SCC par HPLC pour vérifier la quantité de protéines et visualiser la protéine cible par sortie de signal GFB.

Appliquez le supernatant lié à la résine d’affinité cobalt contenant la protéine solubilisée sur une colonne gravitationnel et recueillez le débit. Exécutez un échantillon de 30 microlitres de l’écoulement sur une colonne csc pour vérifier que la protéine est contraignante à la résine. Ensuite, lavez la résine avec 10 volumes de colonne de tampon.

Exécutez un échantillon de 30 microlitres du lavage sur une colonne csc pour vérifier la perte de protéines. À l’aide d’un tampon, élitez la résine liée à l’homme TRPC3. Exécutez un échantillon de 90 microlitres de l’eluant dilué de un à 100 sur une colonne SSC pour vérifier que la protéine a été éludée et pour vérifier la présence d’un signal GFP à la position correspondant à la taille de la protéine cible.

Ajouter la thrombine à un rapport de 1 à 20 molaires et ajouter 10 millimolaires d’EDTA à l’échantillon éluté. Incuber à quatre degrés Celsius pendant trois heures. Après cela, transférer l’électrisant dans un tube de filtre centrifuge de 15 millilitres.

Faites tourner le tube à 2 800 fois la gravité et à quatre degrés Celsius par incréments de cinq minutes pour concentrer l’allongement à 500 microlitres ou moins. Pipette la solution protéique de haut en bas entre les spins pour résuspendre la protéine et prévenir la concentration excessive. Chargez le concentré sur une colonne SSC dans le tampon.

Exécutez la chromatographie liquide rapide de protéine et recueillez 300 fractions de microlitre. Ensuite, combinez les fractions de pointe qui contiennent le tétramer TRPC3 tel que visualisé par le signal d’absorption UV. Et concentrez-vous à nouveau à une concentration finale d’au moins cinq milligrammes par millilitre.

Le TRPC3 humain est solubilisé de cellules entières dans une variété de détergents avec une concentration critique de micelle de 0,01 à 20 micromolaires, et a été exécuté dans un tampon contenant du DDM/CHS. Bien que le DDM/CHS montre la solubilité la plus élevée de TRPC3 humain, la position de pointe semble trop grande pour être le TRPC3 humain tétramérique. Après solubilisation des cellules entières, les débris de lyse cellulaire sont enlevés et la protéine solubilisée est chargée sur une colonne SSC et fonctionner sur HPLC dans un détergent DDM/CHS contenant du tampon, afin de comparer la solubilité absolue et le volume de pointe de trpc3 humain dans différentes conditions par rapport à un contrôle TRPM4.

Tous les différents échantillons de TRPC3 solubilisés de détergent montrent des positions de pointe autour de 11,9 millilitres, ce qui est probablement trop grand parce que la forme tétramérique de TRPC3 humain a un poids moléculaire plus faible que le contrôle humain positif TRPM4. Deux tampons de solubilisation et d’exécution différents contenant du DDM/CHS et de la digitonine sont ensuite testés. La protéine fonctionner dans le tampon contenant de la digitonine donne le pic le plus élevé dans une position raisonnable par rapport au contrôle positif.

Tandis qu’une purification à petite échelle utilisant 25 millilitres des cellules montre plusieurs grands pics, la protéine montre des dispositifs d’un canal humain trpc3 tétramérique simple dans la classification 2D par tache négative. Les additifs sont ensuite examinés en fonction du caractère physiologique de l’homme TRPC3. EDTA montre un effet remarquable sur la stabilisation de l’homme TRPC3 dans une position de pointe tétramérique intacte et a considérablement augmenté le nombre de particules dans le micrographe cryo-EM et a diminué le bruit en arrière-plan.

La qualité des résultats finaux dépend d’un bon dépannage des profils FSCC sur HPLC. Et sur l’achèvement de toutes les étapes de purification rapidement, idéalement en une seule journée. La détermination structurale, la génération d’anticorps, et les études fonctionnelles telles que, analyses de liaison ou électrophysiologie peuvent être exécutées après cette procédure.

Cette technique peut et a été adaptée pour étudier d’autres canaux irionaux et familles de protéines et pour produire des protéines purifiées pour des applications au-delà de la détermination structurelle. Les précautions appropriées pour gérer les biorisques de culture cellulaire, comme le travail dans une hotte laminaire, le port de vêtements de protection et l’élimination adéquate des déchets, devraient être prises.