Détection de l’activité de dimérisation du domaine ligands de œstrogènes Alpha du récepteur à l’aide de l’essai de deux-hybride chez les mammifères
December 19th, 2018
Nous présentons une méthode pour analyser la 4-hydroxy-tamoxifène-dépendants oestrogène receptor ligands domaine dimérisation activité alpha utilisant l’analyse de deux-hybride chez les mammifères.
Ainsi, cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la capacité des ligands oestrogènes à réguler alpha récepteur d’oestrogène et les mécanismes des modulateurs sélectifs récepteur d’oestrogène. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une méthode simple. Il démontre ligand-dépendant récepteur d’oestrogène alpha ligand liaison activité de dimérisation du domaine dans les cellules.
Tanner Jefferson, un étudiant postdoc de notre groupe, démontrera la procédure. Cette méthode utilise trois plasmides différents pour détecter l’activité de dimérisation de domaine de liaison de récepteur d’oestrogène dans les cellules. pG5-Luc est le plasmide journaliste luciferase pour détecter l’efficacité de l’activité de dimémissement.
pBIND récepteur d’oestrogène de souris alpha EF est un facteur de transcription galactose-sensible GAL4 ADN se liant à une souris fusionnée principale oestrogène alpha ligand expression de domaine plasmide qui se lie à l’élément sensible GAL4 sur le journaliste pG5-Luc. pACT souris récepteur d’oestrogène alpha EF est un virus de l’herpès simplex transactivant la protéine segment VP16 domaine d’activation fusionné récepteur d’oestrogène de souris alpha ligand liaison expression de domaine plasmide qui ne se lie pas directement au journaliste pG5-Luc. Quand le ligand approprié est présent, les protéines dérivées du récepteur d’oestrogène de souris de pBIND alpha EF et plasmides alpha EF de récepteur d’oestrogène de souris de pACT se lient par le domaine de liaison alpha ligand de récepteur d’oestrogène.
L’efficacité de la dimémisation est déterminée par l’activité de luciferase. L’étape la plus importante est le contrôle de l’activité du récepteur d’oestrogène de souris pBIND alpha EF protéine dérivée. L’activité du récepteur d’oestrogène dérivé de pBIND alpha ligand lient le domaine dans chaque ligand sans le plasmide alpha EF de récepteur d’oestrogène de pACT doit être évaluée avant d’analyser l’activité ligand-dépendante de liaison de domaine de récepteur d’oestrogène ligand.
Commencez par ajouter les combinaisons de plasmides appropriées en deux tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre par combinaison. Préparer les deux combinaisons du mélange d’ADN. Le premier tube contient le pG5-Luc, le récepteur-alpha EF de pBIND-oestrogène, et les plasmides vides de pACT.
Deuxième tube contient le pG5-Luc, pBIND-oestrogène récepteur-alpha EF, et pACT-oestrogène récepteur-alpha EF plasmides. Pour précipiter l’ADN, ajouter un 1/9 du volume du mélange d’ADN de trois acétate de sodium molaire et un volume d’acétate de sodium 20X trois molaire de 100% éthanol au mélange d’ADN dans chaque tube et vortex les tubes. Conserver les mélanges à 20 degrés Celsius pendant la nuit avant de les centrifuger à vitesse maximale le lendemain matin.
Jetez les supernatants et réutilisez les granulés invisibles dans 120 microlitres de 75% d’éthanol par tube, en prenant soin de rincer tout ADN collé à l’intérieur des tubes. Après une deuxième centrifugation dans les mêmes conditions, jeter les supernatants et sécher l’ADN dans un concentrateur sous vide pendant 30 minutes. Pour la transfection, lavez les cellules de carcinome hépatocellulaires humaines préparées deux fois avec 0,5 millilitres de PBS à température ambiante par puits par lavage et nourrissez les cellules avec 0,5 millilitres de phénol frais de 37 degrés Celsius sans phénol complété par 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par charbon de bois et deux millimolaires de L-glutamine.
Ensuite, suspendre le mélange d’ADN plasmide séché et le réaccente de transfection dans le volume approprié de DMEM par nombre de puits dans des tubes individuels de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Ajouter un volume égal de milieu de réaccente de transfection à chaque tube de mélange d’ADN plasmide suspendu au DMEM. Après une incubation de cinq à dix minutes à température ambiante, ajouter 25 microlitres de mélange d’ADN aux puits expérimentaux appropriés de la plaque de culture de cellules hépatocellulaires humaines de 24 puits pour une transfection de six heures dans l’incubateur de culture cellulaire.
Et la fin de l’incubation, remplacer le milieu de transfection par 0,5 millilitres de frais 37 degrés Celsius phénol sans rouge MEM complété par 10% de charbon de bois dépouillé fbs inactivé par la chaleur, deux millimolaire L-glutamine, 1% streptomycine pénicilline, et ligand par puits et retourner les cellules à l’incubateur de culture cellulaire pour un autre 16 à 18 heures. Le lendemain matin, lavez les cellules avec un millilitre de PBS par puits et fixez les cellules de chaque puits avec 100 microlitres de tampon de lyse passive par puits et secouant vigoureusement à l’aide d’un mélangeur vortex. Congelez ensuite les lysates cellulaires dans de l’azote liquide.
Le jour du double test de luciferase, secouez les lysates sur un shaker jusqu’à ce que la plaque atteigne la température ambiante, et transférez 10 microlitres de lysate aux puits individuels d’une plaque en plastique blanc de 96 puits. Lisez ensuite l’activité de luciferase de chaque échantillon de lysate de cellule sur un lecteur de microplaque. Le traitement du récepteur d’oestrogène de souris de pBIND alpha EF et des plasmides de pACT a transfecté des cellules avec l’estradiol nanomolar de nanomolar stimule l’activité de luciferase pendant que le domaine de liaison alpha ligand de récepteur d’oestrogène contient le domaine fonctionnel ligand-dépendant de transactivation, AF-2.
Les concentrations d’un et de 10 nanomolaires cependant, induisent l’activité de luciferase dans les cellules transfectées avec la combinaison des plasmides alpha EF de récepteur d’oestrogène de souris de pBIND et de pACT, suggérant la faisabilité de cette procédure pour évaluer l’activité de dimérisation de domaine de liaison alpha ligand de récepteur d’oestrogène à jusqu’à un nanomolar du traitement d’estradiol. Le traitement avec 4-hydroxy-tamoxifen n’obtient pas l’activité de luciferase dans le récepteur d’oestrogène de souris de pBIND alpha EF et les cellules transfectées plasmides de pACT, suggérant que la fonction AF-2 du récepteur d’oestrogène alpha n’est pas activée par ce ligand. Jusqu’à 10 concentrations nanomolaires cependant, induit l’activité de luciferase dans les cellules transfectées avec la combinaison des plasmides alpha EF de récepteur d’oestrogène de souris de pBIND et de pACT, suggérant que cette procédure soit faisable pour évaluer l’activité de dimérisation de domaine de liaison d’alpha ligand de récepteur d’oestrogène à jusqu’à 10 nanomolar du traitement de 4-hydroxy-tamoxifen.
L’activité de la combinaison du pBIND et du récepteur d’oestrogène de souris de pACT alpha ligand liant des plasmides d’expression de domaine avec 4-hydroxy-tamoxifen est sensiblement plus élevée que la combinaison des plasmides d’expression de domaine de liaison d’oestrogène humain pBIND et de pACT. Ceci indique que l’activité d’homodimerization 4-hydroxy-tamoxifen-dépendante du domaine de liaison alpha ligand de récepteur d’oestrogène de souris est plus puissante que le domaine de liaison alpha ligand de récepteur d’oestrogène humain. En outre, l’activité d’homodimerization 4-hydroxy-tamoxifen-dépendante du domaine de liaison alpha ligand de récepteur d’oestrogène de souris contenant un domaine humain de F est sensiblement inférieure à celle du domaine de liaison alpha ligand de récepteur d’oestrogène de type sauvage de souris.
En revanche, l’activité d’homodimerization 4-hydroxy-tamoxifen-dépendante du domaine de liaison alpha ligand de récepteur d’oestrogène humain contenant un domaine de souris F est sensiblement plus haut que celui du domaine de liaison alpha ligand de récepteur d’oestrogène humain de type sauvage. Ceci suggère que le domaine de F ait une influence sur l’activité d’homodimerization de domaine de liaison alpha ligand 4-hydroxy-tamoxifen-dépendante de l’espèce. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de tester l’activité basale du domaine de liaison d’ADN GAL4 fusionné récepteur d’oestrogène alpha ligand lier l’activité du domaine avec votre ligand.
Cette activité devrait être la même que le traitement des véhicules.
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Aperçu
Cet article présente une méthode pour analyser l'activité de dimérisation du domaine de liaison du ligand du récepteur des œstrogènes alpha en utilisant l'essai mammaire à deux hybrides. Cette technique est conçue pour étudier comment les ligands œstrogéniques régulent le récepteur des œstrogènes alpha et les mécanismes des modulateurs sélectifs des récepteurs des œstrogènes.
Composants clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neuroscience
- Biochimie
- Biologie cellulaire
Contexte
- Le récepteur des œstrogènes alpha joue un rôle crucial dans divers processus biologiques.
- Comprendre la dimérisation dépendante du ligand est essentiel pour le développement de médicaments.
- Les modulateurs sélectifs des récepteurs des œstrogènes ont un potentiel thérapeutique.
- Les méthodes actuelles pour étudier ces interactions peuvent être complexes.
Objectif de l'étude
- Fournir une méthode simple pour analyser la dimérisation du récepteur des œstrogènes alpha.
- Améliorer la compréhension des interactions des ligands avec les récepteurs des œstrogènes.
- Faciliter la recherche sur les modulateurs sélectifs des récepteurs des œstrogènes.
Méthodes utilisées
- Essai mammaire à deux hybrides
- Utilisation de trois plasmides pour détecter l'activité de dimérisation
- Plasmid rapporteur pG5-Luc luciferase pour la détection de l'efficacité
- Essais basés sur les cellules pour démontrer l'activité dépendante du ligand
Principaux résultats
- La méthode démontre efficacement l'activité de dimérisation dans les cellules.
- Les résultats indiquent l'influence des ligands œstrogéniques sur le comportement des récepteurs.
- Les données soutiennent l'utilité de l'essai pour des recherches ultérieures.
- La procédure est simple et reproductible.
Conclusions
- Cette méthode simplifie l'analyse des interactions des récepteurs des œstrogènes.
- Elle fournit des aperçus sur les mécanismes des modulateurs sélectifs des récepteurs des œstrogènes.
- L'approche peut être appliquée dans divers contextes de recherche.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma teams to evaluate ligand-dependent dimerization of estrogen receptor alpha, a key target in endocrine therapy development. By quantifying species-specific differences in ligand-induced homodimerization, it supports target validation and mechanistic de-risking for selective estrogen receptor modulators. The assay provides a cell-based readout that informs early discovery decisions on ligand efficacy and mechanism of action.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring ligand-dependent receptor dimerization as a functional readout of target engagement.
- Operational Value: Enables comparison of ligand efficacy across species or isoforms to clarify target mechanism and de-risk translational assumptions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing ligand-dependent dimerization as a quantitative assay endpoint.
- Operational Value: Supports assay standardization and reproducibility through controlled plasmid transfection and luciferase readout in mammalian cells.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by testing ligand effects in human hepatocellular carcinoma (HepG2) cells, a model relevant to liver metabolism and endocrine disruption.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical evaluation by providing a mechanistic assay that can be replicated across cell types and ligand concentrations.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, particularly for nuclear receptor modulators where dimerization is a mechanism of action.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring ligand-induced dimerization activity, a key step in clarifying estrogen receptor alpha mechanism.
- Screening: Delivers assay readiness through luciferase-based quantification of dimerization efficiency, enabling compound evaluation in a reproducible format.
- Analytics: Provides quantitative readouts (luciferase activity) that allow comparison of ligand effects across conditions, supporting data-driven prioritization.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by testing ligand effects in mammalian cells, informing mechanism-based advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for studying selective estrogen receptor modulators across multiple ligand series and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity around ligand-receptor interactions.
- Operational Value: Delivers standardization and scalability through defined plasmid transfection and luciferase assay workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing mechanistic data on ligand efficacy, reducing late-stage biological risk in endocrine therapy programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on dimerization activity, supporting capital-efficient advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, mammalian cell transfection, and luciferase reporter assays.
- Dependent on transfection efficiency and luciferase detection instrumentation in a cell culture facility.
- Necessitates standardization across teams for plasmid preparation, ligand dosing, and lysis procedures to ensure reproducibility.
- Must account for cell-type-specific differences in basal activity and ligand response when adapting the model system.
- Limited by the need to control for basal receptor activity, as agonistic ligands can elevate background signals and obscure dimerization-specific readouts.
