Détection de l’activité de dimérisation du domaine ligands de œstrogènes Alpha du récepteur à l’aide de l’essai de deux-hybride chez les mammifères

Ainsi, cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la capacité des ligands oestrogènes à réguler alpha récepteur d’oestrogène et les mécanismes des modulateurs sélectifs récepteur d’oestrogène. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une méthode simple. Il démontre ligand-dépendant récepteur d’oestrogène alpha ligand liaison activité de dimérisation du domaine dans les cellules.

Tanner Jefferson, un étudiant postdoc de notre groupe, démontrera la procédure. Cette méthode utilise trois plasmides différents pour détecter l’activité de dimérisation de domaine de liaison de récepteur d’oestrogène dans les cellules. pG5-Luc est le plasmide journaliste luciferase pour détecter l’efficacité de l’activité de dimémissement.

pBIND récepteur d’oestrogène de souris alpha EF est un facteur de transcription galactose-sensible GAL4 ADN se liant à une souris fusionnée principale oestrogène alpha ligand expression de domaine plasmide qui se lie à l’élément sensible GAL4 sur le journaliste pG5-Luc. pACT souris récepteur d’oestrogène alpha EF est un virus de l’herpès simplex transactivant la protéine segment VP16 domaine d’activation fusionné récepteur d’oestrogène de souris alpha ligand liaison expression de domaine plasmide qui ne se lie pas directement au journaliste pG5-Luc. Quand le ligand approprié est présent, les protéines dérivées du récepteur d’oestrogène de souris de pBIND alpha EF et plasmides alpha EF de récepteur d’oestrogène de souris de pACT se lient par le domaine de liaison alpha ligand de récepteur d’oestrogène.

L’efficacité de la dimémisation est déterminée par l’activité de luciferase. L’étape la plus importante est le contrôle de l’activité du récepteur d’oestrogène de souris pBIND alpha EF protéine dérivée. L’activité du récepteur d’oestrogène dérivé de pBIND alpha ligand lient le domaine dans chaque ligand sans le plasmide alpha EF de récepteur d’oestrogène de pACT doit être évaluée avant d’analyser l’activité ligand-dépendante de liaison de domaine de récepteur d’oestrogène ligand.

Commencez par ajouter les combinaisons de plasmides appropriées en deux tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre par combinaison. Préparer les deux combinaisons du mélange d’ADN. Le premier tube contient le pG5-Luc, le récepteur-alpha EF de pBIND-oestrogène, et les plasmides vides de pACT.

Deuxième tube contient le pG5-Luc, pBIND-oestrogène récepteur-alpha EF, et pACT-oestrogène récepteur-alpha EF plasmides. Pour précipiter l’ADN, ajouter un 1/9 du volume du mélange d’ADN de trois acétate de sodium molaire et un volume d’acétate de sodium 20X trois molaire de 100% éthanol au mélange d’ADN dans chaque tube et vortex les tubes. Conserver les mélanges à 20 degrés Celsius pendant la nuit avant de les centrifuger à vitesse maximale le lendemain matin.

Jetez les supernatants et réutilisez les granulés invisibles dans 120 microlitres de 75% d’éthanol par tube, en prenant soin de rincer tout ADN collé à l’intérieur des tubes. Après une deuxième centrifugation dans les mêmes conditions, jeter les supernatants et sécher l’ADN dans un concentrateur sous vide pendant 30 minutes. Pour la transfection, lavez les cellules de carcinome hépatocellulaires humaines préparées deux fois avec 0,5 millilitres de PBS à température ambiante par puits par lavage et nourrissez les cellules avec 0,5 millilitres de phénol frais de 37 degrés Celsius sans phénol complété par 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par charbon de bois et deux millimolaires de L-glutamine.

Ensuite, suspendre le mélange d’ADN plasmide séché et le réaccente de transfection dans le volume approprié de DMEM par nombre de puits dans des tubes individuels de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Ajouter un volume égal de milieu de réaccente de transfection à chaque tube de mélange d’ADN plasmide suspendu au DMEM. Après une incubation de cinq à dix minutes à température ambiante, ajouter 25 microlitres de mélange d’ADN aux puits expérimentaux appropriés de la plaque de culture de cellules hépatocellulaires humaines de 24 puits pour une transfection de six heures dans l’incubateur de culture cellulaire.

Et la fin de l’incubation, remplacer le milieu de transfection par 0,5 millilitres de frais 37 degrés Celsius phénol sans rouge MEM complété par 10% de charbon de bois dépouillé fbs inactivé par la chaleur, deux millimolaire L-glutamine, 1% streptomycine pénicilline, et ligand par puits et retourner les cellules à l’incubateur de culture cellulaire pour un autre 16 à 18 heures. Le lendemain matin, lavez les cellules avec un millilitre de PBS par puits et fixez les cellules de chaque puits avec 100 microlitres de tampon de lyse passive par puits et secouant vigoureusement à l’aide d’un mélangeur vortex. Congelez ensuite les lysates cellulaires dans de l’azote liquide.

Le jour du double test de luciferase, secouez les lysates sur un shaker jusqu’à ce que la plaque atteigne la température ambiante, et transférez 10 microlitres de lysate aux puits individuels d’une plaque en plastique blanc de 96 puits. Lisez ensuite l’activité de luciferase de chaque échantillon de lysate de cellule sur un lecteur de microplaque. Le traitement du récepteur d’oestrogène de souris de pBIND alpha EF et des plasmides de pACT a transfecté des cellules avec l’estradiol nanomolar de nanomolar stimule l’activité de luciferase pendant que le domaine de liaison alpha ligand de récepteur d’oestrogène contient le domaine fonctionnel ligand-dépendant de transactivation, AF-2.

Les concentrations d’un et de 10 nanomolaires cependant, induisent l’activité de luciferase dans les cellules transfectées avec la combinaison des plasmides alpha EF de récepteur d’oestrogène de souris de pBIND et de pACT, suggérant la faisabilité de cette procédure pour évaluer l’activité de dimérisation de domaine de liaison alpha ligand de récepteur d’oestrogène à jusqu’à un nanomolar du traitement d’estradiol. Le traitement avec 4-hydroxy-tamoxifen n’obtient pas l’activité de luciferase dans le récepteur d’oestrogène de souris de pBIND alpha EF et les cellules transfectées plasmides de pACT, suggérant que la fonction AF-2 du récepteur d’oestrogène alpha n’est pas activée par ce ligand. Jusqu’à 10 concentrations nanomolaires cependant, induit l’activité de luciferase dans les cellules transfectées avec la combinaison des plasmides alpha EF de récepteur d’oestrogène de souris de pBIND et de pACT, suggérant que cette procédure soit faisable pour évaluer l’activité de dimérisation de domaine de liaison d’alpha ligand de récepteur d’oestrogène à jusqu’à 10 nanomolar du traitement de 4-hydroxy-tamoxifen.

L’activité de la combinaison du pBIND et du récepteur d’oestrogène de souris de pACT alpha ligand liant des plasmides d’expression de domaine avec 4-hydroxy-tamoxifen est sensiblement plus élevée que la combinaison des plasmides d’expression de domaine de liaison d’oestrogène humain pBIND et de pACT. Ceci indique que l’activité d’homodimerization 4-hydroxy-tamoxifen-dépendante du domaine de liaison alpha ligand de récepteur d’oestrogène de souris est plus puissante que le domaine de liaison alpha ligand de récepteur d’oestrogène humain. En outre, l’activité d’homodimerization 4-hydroxy-tamoxifen-dépendante du domaine de liaison alpha ligand de récepteur d’oestrogène de souris contenant un domaine humain de F est sensiblement inférieure à celle du domaine de liaison alpha ligand de récepteur d’oestrogène de type sauvage de souris.

En revanche, l’activité d’homodimerization 4-hydroxy-tamoxifen-dépendante du domaine de liaison alpha ligand de récepteur d’oestrogène humain contenant un domaine de souris F est sensiblement plus haut que celui du domaine de liaison alpha ligand de récepteur d’oestrogène humain de type sauvage. Ceci suggère que le domaine de F ait une influence sur l’activité d’homodimerization de domaine de liaison alpha ligand 4-hydroxy-tamoxifen-dépendante de l’espèce. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de tester l’activité basale du domaine de liaison d’ADN GAL4 fusionné récepteur d’oestrogène alpha ligand lier l’activité du domaine avec votre ligand.

Cette activité devrait être la même que le traitement des véhicules.