Haute sensibilité mesure des affinités de liaison de l’ADN-facteur de Transcription par titrage concurrentiel à l’aide de la microscopie en Fluorescence

Pour améliorer la compréhension de la liaison facteur-ADN transcription, nous avons développé une méthode pour mesurer les constantes de dissociation à grande échelle en utilisant par exemple des mesures d’anisotropie. Cette technique permet d’obtenir automatiquement des courbes de titration complètes pour déterminer la constante de dissociation avec une sensibilité élevée. Il fonctionne en solution à l’équilibre, a un débit modéré et une large plage dynamique.

Nous avons appliqué HiP-FA pour affiner le paysage d’affinité contraignante des facteurs de transcription. Cependant, le protocole pourrait être appliqué à d’autres types d’événements contraignants comme les interactions protéine-protéine ou protéine-médicament, par exemple. Je conseille d’abord d’effectuer plusieurs titrations avec les mêmes partenaires contraignants pour obtenir une estimation de la reproductibilité des mesures.

Si disponible, utilisez un système automatisé pour une réductibilité encore meilleure. Pour anneal les oligomers d’ADN de l’ADN de référence, mélangez sept microlitres de chaque dix millimolar di-étiqueté vers l’avant et le brin inverse non étiqueté dans un tube. Pour l’ADN concurrent, mélanger 20 microlitres de chaque brin non étiqueté de 100 millimlaires en deux puits d’une plaque PCR bien nantie de 96.

Ensuite, utilisez une machine PCR standard pour chauffer les solutions d’ADN à 70 degrés Celsius pendant les trois minutes. Ensuite, réduisez à la température ambiante à la vitesse de 0,1 degré Celsius par seconde. Utilisez un four à micro-ondes pour faire fondre 0,5 gramme d’agarose dans un tampon de liaison de 100 millilitres.

Ajouter de l’eau distillée double pour ajuster le volume final afin de compenser une éventuelle évaporation. Préparer dix millilitres de stock aliquots. Pour préparer les puits de titration et d’étalonnage d’une plaque de puits de 96, transférez deux aliquots de stock de gel à un shaker d’incubateur de 75 degrés Celsius.

Pour chaque puits de titration, ajouter 1,4 nanomoles d’ADN de référence, protéine de facteur de transcription, à une concentration finale de 20-60 nanomoles, 0,2 millimollar DTT, et le tampon de liaison à 240 microlitres du gel fondu. Bien mélanger en inversant et en secouant le tube. Puis, pipette lentement 200 microlitres par puits du gel contenant de l’ADN dans les puits de titration désignés d’une plaque de puits 96.

Pour chaque puits d’étalonnage, ajouter 5 nanomoles de colorant bleu nil à 240 microlitres du gel fondu. En évitant les bulles d’air, pipette lentement 200 microlitres de la solution gel contenant des colorants dans cinq à six puits de la plaque de puits 96. Placez le gel sur une surface parfaitement horizontale et incubez pendant dix minutes à température ambiante, et encore 10 minutes à 4 degrés Celsius.

Utilisez un lecteur de plaques multi-puits pour vérifier l’homogénéité des niveaux de hauteur de gel dans différents puits de la plaque. Pour préparer la solution d’ADN concurrente, combinez d’abord l’ADN de référence étiqueté, la protéine et le tampon de liaison trois fois concentré. Ensuite, mélangez 20 microlitres de la solution avec 40 microlitres de chacune des solutions d’ADN concurrent annealed.

Pour chaque puits d’étalonnage, combinez les quantités appropriées d’une des solutions d’ADN concurrent annealed et le tampon de liaison concentré triple contenant la solution de colorant bleu nil de 15 millimlaires. Enfin, ajoutez 50 microlitres des solutions concurrentes mixtes sur le dessus des gels aussi simultanément que possible. Pour commencer l’acquisition d’images, placez la plaque de puits 96 au stade du microscope.

Ensuite, prenez des séries de temps d’images Z-stack de puits jusqu’à ce que le déliement complet de la protéine de l’ADN de référence. Effectuez l’analyse de titration selon le manuscrit. Utilisez ensuite le logiciel HiP-FA pour créer des courbes de titration pour les séquences concurrentes individuelles.

Ensuite, cliquez sur le bouton d’exportation pour obtenir la constante de dissociation et la concentration de la protéine active dans chaque puits de titration. Prenez un soin particulier lors de la pipetting les solutions de gel qui sont visqueux. Le pipetage inexact peut abaisser la précision pour la détermination des constantes de dissociation.

Dans cette étude, la méthode HiP-FA est appliquée pour déterminer les préférences liant l’ADN d’un facteur de transcription à fermeture éclair B. Géant, à partir du réseau génétique de segmentation des mouches. La forte similitude des PWM pour les répliques préparées manuellement ou utilisant des techniques d’automatisation a démontré la reproduisabilité élevée de la méthode HiP-FA.

PwM obtenus par cette méthode et d’autres méthodes sont globalement similaires. Cependant, des écarts significatifs peuvent être vus aux positions deux et sept du motif principal où les mutations peuvent mener à la perte complète de liaison, ou à la liaison beaucoup plus forte que les mesures précédentes. Nous utilisons HiP-FA pour générer des raffinements pour les liaisons de dizaines de facteur de transcription et il montre que obtient à la fin une meilleure prédiction des données.

Nous croyons que sa mesure de haute précision peut être très utile pour mieux comprendre la liaison TF-ADN pour l’ensemble du système ou pour toutes sortes d’interactions.