Name: Micronisation mécanique de Lipoaspirates pour la thérapie régénérative (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 2 s
Description: Découvrez la micronisation mécanique de lipoaspirates pour obtenir la fraction stromale vasculaire sans collagenase. Cette méthode préserve la matrice extracellulaire native et réduit les risques de contamination.

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Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale de Science de Nature de Chine (81471881, 81601702, 81671931), la Fondation des sciences naturelles de la Province du Guangdong en Chine (2014A030310155) et la fondation d’administrateur de l’hôpital Nanfang (2014B009, 2015Z002, 2016Z010, 2016B001).

Cette recherche a été approuvée par la Commission d’examen éthique dans l’hôpital Nanfang, Guangzhou, Chine. Le tissu adipeux a été prélevé de donneurs sains qui a donné consentement éclairé pour participer à l’étude. Toutes les expérimentations animales ont été approuvées par le Comité de l’emploi et de Nanfang hôpital Institutional Animal Care et effectuées conformément aux lignes directrices de la National Health and Medical Research Council (Chine).
1. ECM/SVF-gel de préparation
<ol><li>Graisse de récolte.<ol>
<li>Effectuer la liposuccion sur un être humain avec une canule de 3 mm multiport, qui contient plusieurs trous côté pointu de 1 mm de diamètre, à -0,75 atm de pression d’aspiration.</li>
		<li>Recueillir 200 mL de lipoaspirates dans un sachet stérile.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer la graisse Coleman.<ol>
<li>Transférer le lipoaspirates dans quatre tubes de 50 mL et laisser la graisse récoltée reposer encore pendant 10 min.</li>
		<li>Recueillir la graisse sur la couche supérieure dans deux tubes de 50 mL à l’aide d’une pipette à embout large pour transférer et jeter la partie liquide à la couche inférieure.</li>
		<li>Utilisant des tubes de 50 mL, centrifuger la couche de graisse à 1 200 g à la température ambiante (RT) pendant 3 min.</li>
		<li>Définir la couche supérieure (environ 80 mL) sous forme de graisse de Coleman.</li>
		<li>Transférer les 2/3 supérieurs de la graisse de Coleman dans un tube de 20 mL à l’aide d’une pipette à embout large et définir cette partie sous forme de graisse faible densitée.</li>
		<li>Transférer 1/3 inférieur de la graisse de Coleman dans un autre tube de 20 mL à l’aide d’une pipette à embout large et définir cette partie sous forme de graisse haute densitée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Produire des ECM/SVF-gel provenant des lipides de basse densité.<ol>
<li>À l’aide de deux seringues de 20 mL, reliés par un connecteur Luer-Lock de femelle-femelle (d’un diamètre interne de 2,4 mm) pour intershift 20 mL de graisse faible densitée.</li>
		<li>Maintenir la stabilité de la vitesse de déplacement (à 20 mL/s) et répéter pour 6 x à 8 x.</li>
		<li>Centrifuger le mélange à 2 000 x g RT pendant 3 min.</li>
		<li>Recueillir la portion de l’huile sur le dessus dans un tube de 10 mL à l’aide d’une pipette de l’échelle-pointe à ta pour une utilisation ultérieure.</li>
		<li>Recueillir la substance collante dans la couche intermédiaire, qui est ECM/SVF-gel (Figure 1A), à l’aide d’une pipette à embout large et jetez le liquide à la couche inférieure.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Produire des ECM/SVF-gel provenant des lipides de haute densité.<ol>
<li>Ajouter 5 mL d’huile (recueillie à l’étape 1.3.4) à 15 mL de graisse à haute densité.</li>
		<li>Intershift la graisse mixte entre seringues 6 x à 8 x jusqu'à ce qu’un floculent est observée au sein de l’émulsion.</li>
		<li>Centrifuger le mélange à 2 000 x g RT pendant 3 min.</li>
		<li>Jeter la partie de l’huile sur le dessus.</li>
		<li>Recueillir la substance collante dans la couche intermédiaire (ECM/SVF-gel) à l’aide d’une pipette à embout large et jeter le liquide à la couche inférieure.</li>
		<li>Mélanger l’ECM/SVF-gel des étapes 1.3.5 et 1.4.5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. modèle ECM/SVF-gel greffe souris nue
<ol><li>Anesthésier les souris Nudes (8 semaines femme) à l’isoflurane (1 % - 3 %) anesthésie par inhalation dans une salle d’exploitation animale.</li>
	<li>Transférer l’ECM/SVF-gel dans une seringue de 1 mL.</li>
	<li>Connecter la seringue de 1 mL avec une canule infiltration émoussé.</li>
	<li>Insérer la canule sous la peau à chaque flanc de la souris.</li>
	<li>Injecter 0,3 mL de l’ECM/SVF-gel.</li>
</ol>3. tissu récolte sur 3, 15 et 90 jours après l’Injection de l’ECM/SVF-gel
<ol><li>Anesthésier les souris à l’isoflurane (1 % - 3 %) anesthésie par inhalation.</li>
	<li>Sacrifier les souris par la méthode de dislocation cervicale.</li>
	<li>Faites une incision à la ligne médiane de la peau du dos de la souris avec des ciseaux chirurgicaux.</li>
	<li>Disséquer et récolter les greffes de graisse sur les deux côtés de la souris. Incorporer les greffes de graisse à la paraformaldéhyde à 4 % à la droite du jour au lendemain.</li>
	<li>Déshydrater le tissu dans l’augmentation des concentrations d’éthanol : éthanol à 70 %, deux changements, 1 h chacun ; l’éthanol à 80 %, un changement, 1 h ; l’éthanol à 95 %, un changement, 1 h ; 100 % éthanol, trois changements, 1,5 h de chacun ; xylène, trois changements, 1,5 h chacune.</li>
	<li>Infiltrer le tissu avec de la cire de paraffine (58-60 ° C), deux changements, 2 h chaque.</li>
	<li>Incorporez le tissu dans des blocs de paraffine. Coupes sur une épaisseur d’environ 4 µm et placez-les sur des diapositives.</li>
</ol>4. l’hématoxyline et éosine coloration
<ol><li>Déparaffiner les diapositives de bloc de paraffine en les trempant dans du xylène, I, II et III (10 min chacun).</li>
	<li>Réhydrater les coupes de tissus en les passant à travers la baisse des concentrations (100 %, 100 %, 95 %, 80 %, 70 %) des bains d’éthanol pendant 3 min chaque.</li>
	<li>Rincer les sections de tissu dans l’eau distillée (5 min).</li>
	<li>Tacher les coupes de tissus à l’hématoxyline pendant 5 min.</li>
	<li>Rincer les coupes de tissus dans la gestion de l’eau du robinet pendant 20 min. Decolorize à 1 % d’alcool acide (1 % HCl dans l’alcool à 70 %) pour 5 s. rinçage à l’eau courante jusqu'à ce que les sections sont à nouveau en bleues.</li>
	<li>Ajouter deux ou trois gouttes d’éosine Y colorant directement sur les diapositives de la pipette et laissez le colorant durant 10 min.</li>
	<li>Laver les lames dans l’eau du robinet pendant 1 à 5 min.</li>
	<li>Déshydrater les diapositives de l’augmentation des concentrations (70 %, 80 %, 95 %, 100 %, 100 %) d’éthanol pendant 3 min chaque.</li>
	<li>Désactivez les diapositives dans le xylène I et II de 5 min chacun.</li>
	<li>Monter des diapositives dans le support de montage.</li>
</ol>5. immunofluorescence
<ol><li>Déparaffiner les coupes de tissus dans le xylène I, II et III (5 min).</li>
	<li>Réhydrater les coupes de tissus en les passant à travers différentes concentrations (100 %, 100 %, 95 %, 95 %, 70 %) des bains d’alcool pendant 3 min chaque.</li>
	<li>Incuber les sections dans une solution de2 % de 3 H2O dans le méthanol à RT pendant 10 min.</li>
	<li>Rincer les lames 2 x avec de l’eau distillée, 5 min chacun.</li>
	<li>Supprimer les diapositives dans un panier de diapositive. Ajouter 300 mL de tampon citrate de 10 mM (pH 6.0) et incuber les lames à 95-100 ° C pendant 10 min.</li>
	<li>Cool les diapositives de RT pendant 20 min.</li>
	<li>Rincer les lames 2 x avec saline tamponnée au phosphate (PBS), 5 min chacun.</li>
	<li>Ajouter 100 µL de sérum de veau fœtal de 10 % sur les diapositives et les incuber dans une chambre humidifiée à RT pendant 1 h.</li>
	<li>Incuber les sections avec la solution d’anticorps primaire (cobaye anti-souris Perilipin, 1 : 400) à 4 ° C jusqu’au lendemain.</li>
	<li>Rincer les lames avec du PBS 3 x, 5 min chaque.</li>
	<li>Incuber les sections avec la solution d’anticorps secondaire (IgG de chèvre anti-Guinée pig-488) pendant 2 h à température ambiante.</li>
	<li>Rincer les lames avec du PBS 3 x, 5 min chaque.</li>
	<li>Essuyez l’eau autour de la section avec le mouchoir en papier propre.</li>
	<li>Déposez 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et conjugué Alexa Fluor 488 isolectine dans le cercle pour couvrir la section sur la diapositive.</li>
	<li>Monter les lamelles et les laisser sécher dans l’obscurité.</li>
	<li>Observer les diapositives avec un microscope à fluorescence.</li>
</ol>

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<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Long-Term+Volume+Retention+of+Stromal+Vascular+Fraction+Gel+Grafting+with+Enhanced+Angiogenesis+and+Adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Improved Long-Term Volume Retention of Stromal Vascular Fraction Gel Grafting with Enhanced Angiogenesis and Adipogenesis.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (5), 676-686 (2018).</li>
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<li>Qiu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+Centrifuged+Lipoaspirate+Fractions+Suitable+for+Postgrafting+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Identification of the Centrifuged Lipoaspirate Fractions Suitable for Postgrafting Survival.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 137 (1), 67-76 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Sur les cellules souches de thérapie régénérative a montré un grand bénéfice potentiel dans différentes maladies. CRA est les candidats thérapeutiques exceptionnels parce qu’ils sont faciles à obtenir et ont la capacité de réparation tissulaire et la régénération des tissus nouveaux15. Cependant, il y a des limites à l’élargissement de son application clinique, car cela nécessite des procédures complexes d’isoler les cellules et collagénase de traitement6. Ainsi, il est ess...

Cellules souches offrent un changement de paradigme pour la régénération et la réparation des tissus, afin qu’ils puissent offrir un autre schéma thérapeutique pour diverses maladies1. Les cellules souches (par exemple, les cellules souches pluripotentes induites et les cellules souches embryonnaires) ont un grand potentiel thérapeutique, mais sont limités en raison de la régulation cellulaire et des considérations éthiques. Dérivé d’adipeux mésenchymateuses stromales/cellules souches (ASCs) sont faciles à obtenir de lipoaspirates et pas soumis aux mêmes restrictions ; ainsi, il est devenu un type de cellule idéal pour la pratique de la médecine régénérative,2. En outre, ils sont nonimmunogenic et disposent de ressources abondantes de graisse autologue3.
Actuellement, CRA est obtenus principalement par digestion de collagénase médiée par du tissu adipeux. La fraction stroma vasculaire (SVF) du tissu adipeux contient NASC, cellules endothéliales, péricytes et cellules immunitaires. Bien que l’obtention d’une haute densité de SVF/CRA enzymatiquement s’est avéré avoir des effets bénéfiques, la législation de plusieurs pays réglemente strictement l’application clinique des produits à base de cellules à l’aide de collagénase4. Digérer le tissu adipeux avec la collagénase pendant 30 min à 1 h pour obtenir les cellules SVF augmente le risque de ces deux matières exogènes dans la préparation et la contamination biologique. La culture adhérente et la purification des CRA, qui prend les jours de semaines, exigent l’équipement de laboratoire spécifiques. En outre, dans la plupart des études, des cellules SVF et CRA est utilisés en suspension. Sans la protection de la matrice extracellulaire (mec) ou un autre transporteur, cellules libres sont vulnérables, provoquer une rétention d’une pauvre cellule après l’injection et compromettre le résultat thérapeutique5. Toutes ces raisons limitent l’autre demande de thérapie de cellules souches.
Pour obtenir des CRA du tissu adipeux sans digestion induite par la collagénase, plusieurs procédures de traitement mécanique, y compris de centrifugation, mécanique, hacher, broyer, réduire en purée et hacher, ont été développés6,7 , 8 , 9. ces méthodes sont censés se condensent les tissus et CRA en perturbant mécaniquement les adipocytes matures et leurs vésicules contenant de l’huile. En outre, ces préparations, contenant des concentrations élevées des CRA, a montré un potentiel thérapeutique considérable comme médecine régénérative des animaux modèles8,9,10.
En 2013, Tonnard et coll. a présenté le nanofat technique, qui consiste à produire lipoaspirates émulsifiée par intersyringe traitement de11de greffage. La force de cisaillement créée par intersyringe déplacement peut briser sélectivement les adipocytes matures. Se fondant sur leurs constatations, nous avons développé une méthode de traitement purement mécanique qui élimine la plupart des lipides et fluide dans les lipoaspirates, laissant seulement les cellules SVF et fractionné ECM, qui est ECM/SVF-gel12. Ici, les auteurs décrivent les détails du processus mécanique d’origine humaine de tissus adipeux pour produire l’ECM/SVF-gel.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488-conjuguée isolectine GS-IB4</td><td>Sondes moléculaires</td><td>I21411</td><td></td></tr><tr><td>cobaye anti-souris perilipin</td><td>Progen</td><td>GP29</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>pipette à pointe large</td><td>Celltreat</td><td>229211B</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal&nbsp ;</td><td>Leica&nbsp ;</td><td>TCS SP2</td><td></td></tr><tr><td>nude nice&nbsp ;</td><td>Université Mdical du Sud</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>microscope optique&nbsp ;</td><td>Olympus</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Tube de 50 mL</td><td>Cornig</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>sac stérile</td><td>Laishi</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>microtome</td><td>Leica&nbsp ;</td><td>Centrifugeuse CM1900</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Heraus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

micronisation mécanique de lipoaspirates pour la thérapie régénérative

Mechanical Micronization of Lipoaspirates for Regenerative Therapy

Stroma vasculaire fraction (SVF) est devenu un outil régénératrice pour diverses maladies ; Cependant, la législation réglemente strictement l’application clinique des produits cellulaires à l’aide de la collagénase. Nous présentons ici un protocole visant à générer un mélange injectable de cellules SVF et native matrice extracellulaire du tissu adipeux par un procédé purement mécanique. Lipoaspirates sont placés dans une centrifugeuse et filés à 1 200 x g pendant 3 min. La couche intermédiaire est recueillie et séparée en deux couches (graisses haute densité en bas) et faible densité sur le dessus. La couche supérieure est directement émulsifiée par transfert intersyringe, à raison de 20 mL/s pour 6 x à 8 x. La graisse émulsionnée est centrifugée à 2 000 x g pendant 3 min, et la substance collante sous la couche d’huile est recueillie et définie comme la matrice extracellulaire (ECM) / SVF-gel. L’huile sur la couche supérieure est recueillie. Environ 5 mL d’huile est ajouté à 15 mL de graisse à haute densité et émulsionnée en décalant intersyringe, à raison de 20 mL/s pour 6 x à 8 x. La graisse émulsionnée est centrifugée à 2 000 x g pendant 3 min, et la substance collante est aussi ECM/SVF-gel. Après la greffe de l’ECM/SVF-gel sur des souris Nudes, le greffon est récolté et évalué par l’examen histologique. Le résultat montre que ce produit a le potentiel pour se régénérer dans le tissu adipeux normal. Cette procédure est une procédure de dissociation mécanique simple et efficace de condenser les cellules SVF incorporés dans leur ECM soutien naturel à des fins de récupération.

Après le traitement de la graisse de Coleman à ECM/SVF-gel, le volume d’huile mis au rebut reprend 80 % du volume final, et seulement 20 % du tissu adipeux, conservé sous la couche d’huile est considérée comme ECM/SVF-gel (Figure 1A). ECM/SVF-gel a une texture liquide lisse qui lui permet de passer par une fine aiguille 27 G ; Cependant, graisse de Coleman se compose d’une structure adipeuse intégrale avec des fibres de gros et ne peut aller ...

Nous présentons ici un protocole pour obtenir la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux grâce à une série de procédés mécaniques, incluent l’émulsification et plusieurs centrifugations.

Micronisation mécanique de Lipoaspirates pour la thérapie régénérative

Stromal vascular fraction (SVF) has become a regenerative tool for various diseases; however, legislation strictly regulates the clinical application of ...

L’obtention de fractions vasculaires stromales, ou SVFs, à partir de lipoaspirates nécessite une digestion avec la collagène, ce qui augmente le risque de contamination biologique. Une meilleure façon d’obtenir SVF sans collagène devrait être développée. Ces techniques nous permettent d’obtenir le SVF dans sa matrice extracellulaire native grâce à un simple processus mécanique.Xihang Chen, un étudiant diplômé de notre laboratoire, démontrera la procédure. Après avoir obtenu les échantillons de graisse, transférer les lipoaspirates dans un tube de 50 millilitres, et permettre à la graisse récoltée d’équilibrer pendant 10 minutes. Ensuite, utilisez une pipette à pointe large pour tirer la graisse de la couche supérieure du tube dans un nouveau tube de 50 millilitres et faire tourner la graisse par centrifugation.La couche supérieure dans le tube est la fraction de graisse Coleman. Transférer les 2/3 supérieurs de la graisse Coleman dans un nouveau tube de 15 millilitres. Cette partie est considérée comme la graisse de faible densité.Transférer le tiers inférieur de la graisse Coleman dans un deuxième tube de 15 millilitres. Cette partie est considérée comme la graisse à haute densité. Pour produire un gel de fraction vasculaire stromal de matrice extracellulaire à partir de la graisse de basse densité, utilisez deux seringues de 20 millilitres reliées par une femelle au connecteur femelle de serrure de luer pour interculer 10 millilitres de la graisse de basse densité.C’est l’étape clé pour détruire les adipocytes. La vitesse et l’heure à laquelle le déplacement de l’intersyringe est effectué contribuent à la qualité du produit final. Après la dernière séance d’inter-décalage, recueillir la graisse par centrifugation et transférer la couche d’huile supérieure dans un tube de 15 millilitres.Ensuite, transférez la couche collante de gel vasculaire stromal de matrice extracellulaire moyenne dans un nouveau tube conique de 15 millilitres. Pour produire un gel de fraction vasculaire stromal de matrice extracellulaire de la graisse de haute densité, ajoutez deux millilitres de la fraction d’huile de basse densité à cinq millilitres de l’échantillon de graisse de haute densité. Interculez la graisse mélangée comme démontré jusqu’à ce qu’un flocculate soit observé dans l’émulsion.Recueillir le flocculate par centrifugation et jeter la couche d’huile supérieure. Puis recueillir la couche moyenne collante et mélanger cette fraction avec la faible densité extracellulaire matrice stromale échantillon gel vasculaire fraction. Après traitement de la graisse Coleman au gel stromal de fraction vasculaire de matrice extracellulaire, le volume de l’huile jetée prend jusqu’à 80% du volume final, et seulement 20% du tissu adipeux préservé sous la couche d’huile est considéré comme gel stromal de fraction vasculaire de matrice extracellulaire.Le gel stromal de fraction vasculaire de matrice extracellulaire a une texture liquide-comme lisse qui lui permet de passer par une aiguille fine de calibre 27. Cependant, la graisse coleman est composée d’une structure adipeux intégrale avec de grandes fibres qui ne peuvent passer par une canule de calibre 18. Le troisième jour après la transplantation, un grand nombre de pré-adipocytes de petite taille avec les gouttelettes intracellulaires multiples de lipide, le tissu conjonctif bien vascularisé étendu, et les cellules inflammatoires infiltrées apparaissent.À partir du jour 15, le nombre de cellules inflammatoires commence à diminuer progressivement, et les adipocytes commencent à mûrir. Au jour 90, la plupart du tissu conjonctif vascularisé dans les greffes a été remplacé par des adipocytes matures. Les greffes de gel vasculaire stromal de fraction vasculaire de matrice extracellulaire contiennent également quelques adipocytes positifs de perilipin trois jours après la transplantation, avec de petites tailles pré-adipocytes, avec les gouttelettes intracellulaires multiples de lipide commençant à apparaître le jour 15.Chaque champ du jour 90 sections stromal de greffe de gel vasculaire de matrice extracellulaire montrent de nombreux adipocytes positifs de perilipin et les vaisseaux sanguins nouvellement formés. La cytométrie d’écoulement peut être exécutée pour déterminer la population cellulaire dans le produit. Et la microscopie électronique à balayage peut être effectuée pour visualiser la microstructure du produit.Cette technique fournit une méthode simple pour les chirurgiens et les chercheurs pour obtenir un produit avec une forte concentration de cellules SVF avec des fibres matricielles extracellulaires indigènes à partir de tissu adipeux.

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Fabrication de patchs microaiguilles dissolvables chargés de nanomicelles α-lactalbumine pour l’administration transdermique de capsaïcine et la réduction du tissu adipeux

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