Name: Un test de concurrence plaque comme une rapide évaluation préliminaire de la Suppression de la maladie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 23 s
Description: Découvrez un test de concurrence plaque rapide pour évaluer la suppression de Rhizoctonia solani par des composts. Cette méthode simple et efficace réduit le temps d'analyse de trois semaines à seulement deux ou trois jours.

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La recherche financée par le Vermont Agricultural Experiment Station concurrentiel Hatch programme VT-HO1609. Lynn Fang a utilisé la méthode dans le cadre de sa thèse de M.S. à l’Université du Vermont,6.

1. Préparez à l’avance
<ol><li>Master culture fongique (organisme d’essai)<ol>
<li>Commander auprès de l’American Type Culture Collection, Collection de microbiologie9, par sa téléomorphe Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) ou MYA 4031.</li>
		<li>Alternative : Recueillir des souches locales comme fait par les auteurs. Semis de radis rouge (Raphanus sativus) fonctionnent bien comme plante appât ; récupérer la terre d’un endroit connu pour avoir une histoire de pourriture de racine ou de fonte des semis causée par r. solani. Semer les graines dans le sol et isoler des lésions des racines lorsque les semis sont âgés de 3 à 4 semaines.<ol>
<li>Enlever les semis du sol et rincer à l’eau du robinet. Vous cherchez un tissu brun dans la région de l’hypocotyle entre les feuilles et la racine (Figure 1).</li>
			<li>Utiliser une simple lame de rasoir tranchant pour couper les segments de 1 cm de l’hypocotyle ou les racines qui ont une couleur brune. Utiliser forceps stérilisé à la flamme pour tremper les segments en solution à 10 % d’eau de Javel pendant 1 min, suivi d’un rinçage de 10 s dans de l’eau stérile. Remarque : Le haut et le bas d’une boîte de Petri stérile sont des conteneurs utiles pour cette étape.</li>
			<li>Pinces à usage stérilisé à la flamme pour transférer l’usine de pièces à l’intérieur d’une serviette en papier pour pat sécher et puis placer sur la surface d’une boîte de Pétri avec eau gélosée (15 g dans 1 L).</li>
			<li>Placez la boîte de Pétri à l’intérieur d’un récipient en plastique avec un couvercle et laisser incuber à température ambiante (environ 20 ° C). Essuyer l’intérieur du récipient avec l’eau de Javel ou 75 % 10 % d’éthanol et laissez-le sécher à l’air avant d’insérer le plat.</li>
			<li>Garder les isolats dans le stockage à long terme sur un milieu minimal de semoule de maïs gélose inclinée (17 g dans 1 L) (à 5 ° C).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58767/58767fig1.jpg"> Figure 1 : symptômes de la maladie. Sols contenant r. solani se traduit par la germination inégale et mise en place (à gauche). Sur des semis de radis, les symptômes apparaissent comme des lésions brunes à l’hypocotyle (à droite). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58767/58767fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<ol start="2"><li>Utilisez des plaques de gélose de dextrose (39 g dans 1 L) de pommes de terre pour l’inoculum pour cet essai de plaque.<ol>
<li>Établir une culture de la fille de Rhizoctonia culture sur gélose dextrosée à la pomme de terre un ou deux jours avant le dosage, afin d’assurer, il est bien établi sur la plaque de culture avant le dosage. Démarrer la culture de la fille en transférant un petit morceau (10 mm de diamètre) de r. solani de la culture de maître au centre d’une nouvelle plaque de gélose dextrosée à la pomme de terre (Figure 2). NOTE : Travailler sous une hotte à flux laminaire ou essuyer un banc de laboratoire avec 10 % d’éthanol 75 % ou de l’eau de Javel pour minimiser les risques de contamination.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Autoclave 25 mL tubes à essai avec 10 mL d’eau distillée (2 × nombre d’échantillons).</li>
</ol>2. préparation des échantillons pour essai
<ol><li>Ajouter deux échantillons indépendants 0,5 g de chaque échantillon de compost pour 10 mL d’eau stérilisé dans des éprouvettes de 25 mL. Secouer les tubes à essai du jour au lendemain.<ol>
<li>Étiqueter les tubes à essai avec numéros d’échantillon unique et chaque membre de la paire comme (référence) ou B (échantillon).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Après 24 h, ajouter 1,5 g de gélose ordinaire à 90 mL d’eau distillée dans des flacons de deux 125 mLconical.</li>
	<li>Autoclave les deux fioles coniques avec agar et l’échantillon A de chaque paire pendant 20 min avec un réglage d’échappement lent.</li>
	<li>Après l’autoclave, placer les fioles coniques avec agar dans un bain d’eau de 45 ° C jusqu'à l’équilibre (environ 30 min). Ne pas mettre n’importe quel coulis de l’échantillon dans un bain-marie jusqu'à ce qu’il ait refroidi à 45 ° C.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58767/58767fig2.jpg"> Figure 2 : Illustration du protocole. Bouchons de r. solani sont placés sur des plats de Pétri contenant de compost extrait à l’eau. Le diamètre de la croissance mycélienne est mesuré après 1-2 jours à l’aide d’un microscope stéréo pour améliorer la résolution et le contraste. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58767/58767fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<ol start="5"><li>Versez le purin de compost A sample (référence autoclavé) dans l’agar fondu de la fiole d’agar A. Agiter pour disperser le compost dans la gélose.</li>
	<li>Versez le purin de compost B sample (échantillon de vie) dans l’agar fondu du flacon B agar. Agiter pour disperser le compost dans la gélose.</li>
	<li>Versez le mélange de chaque fiole dans cinq plats de Pétri en plastique qui sont de 100 mm de diamètre.</li>
	<li>Laisser la nuit fraîche de plaques donc l’agar se durcit.</li>
</ol>3. ajouter le défi Rhizoctonia
<ol><li>À l’aide d’une technique aseptique, transférer des morceaux de taille égale de r. solani sur chaque paire de plaques de gélose échantillon (3 à 5 mm corkborer fonctionne bien pour créer des morceaux de taille égale). Prenez les morceaux de la colonie du bord extérieur de la colonie pour assurer le mycélium est en croissance active. NOTE : Travailler sous une hotte à flux laminaire ou essuyer un banc de laboratoire avec 10 % d’éthanol eau de Javel ou de 70 %.</li>
	<li>Incuber les plaques à température ambiante pendant 1 à 2 jours jusqu'à ce que la croissance de la colonie atteint à mi-chemin vers le bord des plaques A.</li>
</ol>4. mesurer la croissance de r. solani
<ol><li>Mesurer le rayon du mycélium dans chaque assiette 1 mm près avec une règle claire plate à l’aide d’un microscope stéréo avec éclairage transmis. NOTE : Illumination Oblique ou foncé champ rendra plus facile à voir et mesurer les hyphes transparents. À ce stade, les zones d’inhibition sera visibles autour de fragments de compost dans la plaque B si le compost est suppressif.</li>
	<li>Enregistrer le rayon à trois endroits par plaque et calculer une moyenne de trois pour servir une mesure représentative.</li>
	<li>Soustraire la moyenne des plaques des plaques A B. Si B &lt; A puis il y a des microbes dans les plaques de B qui sont suppressives au pathogène r. solani .</li>
	<li>Le rayon moyen de diviser par le nombre de jours de défi pour exprimer les unités de suppression relative sous forme de taux, mycélium de mm par jour.</li>
</ol>

<ol><li>Gonzalez Garcia, G., Onco, M. A. P., Susan, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review.+Biology+and+systematics+of+the+form+genus+Rhizoctonia%5BTitle%5D)+AND+%22Spanish+Journal+of+Agricultural+Research%22%5BJournal%5D)">Review. Biology and systematics of the form genus Rhizoctonia.</a> Spanish Journal of Agricultural Research. 4 (1), 55-79 (2006).</li>
<li>Bonanomi, G., Antignani, V., Pane, C., Scala, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+soilborne+fungal+diseases+with+organic+amendments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Suppression of soilborne fungal diseases with organic amendments.</a> Journal of Plant Pathology. 89, 311-324 (2007).</li>
<li>Noble, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risks+and+benefits+of+soil+amendment+with+composts+in+relation+to+plant+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Australasian+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Risks and benefits of soil amendment with composts in relation to plant pathogens.</a> Australasian Plant Pathology. 40, 157-167 (2011).</li>
<li>Wichuk, K. M., McCartney, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compost+stability+and+maturity+evaluation+-+a+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Civil+Engineering%22%5BJournal%5D)">Compost stability and maturity evaluation - a literature review.</a> Canadian Journal of Civil Engineering. 37, 1505-1523 (2010).</li>
<li>Alfano, G., Lustrato, G., Lima, G., Vitullo, D., Ranalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+composted+olive+mill+wastes+to+predict+potential+plant+disease+suppressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Control%22%5BJournal%5D)">Characterization of composted olive mill wastes to predict potential plant disease suppressiveness.</a> Biological Control. 3, 199-207 (2011).</li>
<li>Fang, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Biological+indicators+of+compost-mediated+disease+suppression+against+the+soilborne+plant+pathogen+Rhizoctonia+solani%22">Biological indicators of compost-mediated disease suppression against the soilborne plant pathogen Rhizoctonia solani</a>. , University of Vermont. M.S. Thesis (2015).</li>
<li>Bonanomi, G., Antignani, V., Capodilupo, M., Scala, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+the+characteristics+of+organic+soil+amendments+that+suppress+soilborne+plant+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Identifying the characteristics of organic soil amendments that suppress soilborne plant diseases.</a> Soil Biology and Biochemistry. 42, 136-144 (2010).</li>
<li>Neher, D. A., Fang, L., Weicht, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecoenzymes+as+indicators+of+compost+to+suppress+Rhizoctonia+solani%5BTitle%5D)+AND+%22Compost+Science+and+Utilization%22%5BJournal%5D)">Ecoenzymes as indicators of compost to suppress Rhizoctonia solani.</a> Compost Science and Utilization. 25 (4), 251-261 (2017).</li>
<li>American Type Culture Collection. ATCC® Mycology Culture Guide. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/Mycology_Guide.ashx">https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/Mycology_Guide.ashx</a> (2018).</li>
<li>Berns, A. E., Phillip, H., Narres, H. -D., Burauel, P., Vereecken, H., Tappe, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+gamma-sterilization+and+autoclaving+on+soil+organic+matter+structure+as+studied+by+solid+state+NMR%2C+UV+and+fluorescence+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Soil+Science%22%5BJournal%5D)">Effect of gamma-sterilization and autoclaving on soil organic matter structure as studied by solid state NMR, UV and fluorescence spectroscopy.</a> European Journal of Soil Science. 59, (2008).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous savons par les recherches antérieures, que certains composts sont efficaces pour réprimer r. solani et que les effets suppresseurs sont due à des microbes vivant dans le compost, pas les propriétés abiotiques de compost6,8. L’utilisation de l’autoclave afin de « tuer » microbiote a été critiquée parce qu’elle affecte la chimie du carbone des médias10. Nous avons comparé l’utilisation de l’autoclave pour filtration sous vide p...

Rhizoctonia représente un vaste complexe de champignons, de laquelle Donk Thanatephorus cucumeris (Frank) (anamorphe Rhizoctonia solani Kühn de =) est l’agent pathogène causant la pourriture des racines et la fonte des semis1. Rhizoctonia solani est un pathogène agressif et un saprophyte qui peut survivre comme sclérotes sous des conditions environnementales défavorables1. En conséquence, il a une répartition mondiale et peut provoquer des maladies sur la large gamme de plantes hôtes, y compris les Solanaceae, Fabaceae, Asteraceae et Brassicaceae entraînant des pertes économiques sérieuses.
Compost a la capacité d’abriter des agents de lutte biologique pour certains agents pathogènes de plantes2. Cependant, pas tous les terreaux ne se ressemblent ni ils affectent tous les agents pathogènes de la même façon3. Carbone à base de bois a lignine supérieure aux ratios de cellulose que le foin ou la paille-carbone basé composts. R. solani préfère carbone facilement accessible dans la paille. En revanche, la lutte biologique champignons, tels que les espèces de Trichoderma , sont plus efficaces lorsque le carbone est moins facile d’obtenir. Champignons bénéfiques et les bactéries en compost peuvent supprimer des maladies des plantes par le biais de concours, antagonisme ou régulation de la croissance végétale3. Le test proposé détecte principalement antagonisme créée par la production d’antibiotiques, les ecoenzymes ou les chélateurs qui nuisent à l’agent pathogène.
Plantes biologiques sont un étalon-or pour déterminer si les composts favorisent ou dissuader de croissance végétale4. Cependant, plantes biologiques sont beaucoup de temps (semaines ou mois) pour terminer qui peut être plus longtemps que vous le souhaitez et exige plus de travail pour extraire les plantes avec des racines de quantifier la sévérité des systèmes racinaires. Relativement robuste, mais plus rapide des essais (jours) serait idéales pour les programmes de contrôle de la qualité. L’objectif de cet article est de démontrer un test relativement rapide et précis pour prédire le potentiel suppressive de compost. La méthode a été modelée après Alfano et al. 5 à deux exceptions près, des extraits de compost ont été dilués et gélose aqueuse a été utilisé à la place de la gélose dextrosée à la pomme de terre (PDA). R. solani pousse rapidement sur milieu gélosé simple d’eau tandis que le PDA a favorisé la croissance des bactéries et autres champignons qui a contaminé la culture6.
Cet essai de plaque sert d’indicateur de suppression qui s’applique à un éventail d’agents pathogènes des plantes qui survivent dans le sol comme saprophytes y compris r. solani7, les premiers fléaux Alternaria, fusariose, pourridié phytophthoréen et Pythium pourridié. Le test de concurrence de plaque est utile pour dépister une gamme de produits de compost pour endiguer les communautés de microbes qui servent d’agents de lutte biologique des agents pathogènes du sol. Le test a été un des indicateurs plus constants de la suppression de la maladie dans le compost commercial produits6,8. Produits ont été choisis pour leur variation dans la recette, maturité et processus de production.

<table><tbody><tr><td>quantité de Gélose conique en verre autoclavable à col étroit</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-040D</td><td>125 mL</td></tr><tr><td>Tubes à essai en verre autoclavable</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-925J</td><td>25 mL de gélose</td></tr><tr><td>granulée déshydratée</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0145-17-0</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Gants résistants à la chaleur</td><td>Fisher Scientific</td><td>MEMGG1314WL</td><td>plusieurs marques disponibles</td></tr><tr><td>Parafilm (bandes de 2-3 cm de large)</td><td>Fisher Scientific</td><td>PM992 13-374-16</td> 5 <td>ou 10 cm de largeur de travail</td></tr><tr><td>boîtes de Pétri jetables en polystyrène</td><td>Fisher Scientific</td><td>R80116</td><td>est livré en manchons de 20/ch ou en caisses de 500</td></tr><tr><td>gélose au dextrose de pomme de terre déshydratée</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0013-15-8</td><td>est disponible en quantités de 100, 500 et 2000 grammes</td></tr><tr><td>agitateur réciproque de paillasse</td><td>Thomas Scientific</td><td>1227Y31</td><td>d’autres modèles fonctionneront</td></tr><tr><td></td><td>bain-marie ThermoScientific</td><td>S37363</td><td>5L règle transparente à usage général</td></tr><tr><td>, plate, au moins 10 cm</td><td>Toute</td><td></td><td>utilisation règle métrique</td></tr><tr><td>Culture ATCC</td> culture <td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 10154</td><td>téléomorphe Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) ou MYA 4031 ;</td></tr><tr><td>bande de laboratoire</td><td>Fisher Scientific</td><td>15935</td><td>autoclavable et amovible, 1" de large préféré</td></tr><tr><td>marqueur résistant à l’eau</td> de <td>bureau ou de fournitures scientifiques</td><td>Sharpie pointe fine</td><td>écrire le numéro d’échantillon sur la bande</td></tr></tbody></table>

un test de concurrence plaque comme une rapide évaluation préliminaire de la suppression de la maladie

A Plate Competition Assay As a Quick Preliminary Assessment of Disease Suppression

L’objectif était de développer et optimiser un bioessai de simple, abordable et efficace pour détecter les capacité suppressive de maladie d’un compost spécifique contre le champignon terricole Rhizoctonia solani. R. solani est un pathogène d’une large gamme de plantes-hôtes dans le monde entier. Le champignon survit dans le sol comme un saprophyte et pousse rapidement sur milieu gélosé eau simple. L’essai de plaque est une méthode rapide pour comparer les composts pour leur capacité à ralentir la croissance de r. solani. L’essai corrèle aussi bien avec la suppression d’autres pathogènes fongiques terricole qui survivent en tant que saprophytes dans les sols comme les premiers fléaux Alternaria, fusariose, pourridié phytophthoréen, Pythium et pourriture des racines.

Compost fini doit être stable et mature, deux termes qui sont souvent utilisés indifféremment, donc peut être emballé et transporté en toute sécurité et pas entraîner des effets négatifs au cours de son utilisation finale4. La stabilité est une résistance à la décomposition et est habituellement déterminée à l’aide d’indices de l’activité microbienne. Mesures générales de respiration microbienne peuvent mesurer de stabilité compost mais pas nécessairement ...

Présenté est un protocole pour un test de concurrence de plaque déterminer si un compost spécifique est susceptible de contenir des bactéries et des champignons qui inhibent la croissance de Rhizoctonia solani.

Un test de concurrence plaque comme une rapide évaluation préliminaire de la Suppression de la maladie

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés liées à la lutte biologique contre les pathogènes végétaux transmis par le sol. L’étalon-or pour tester des matériaux comme le compost est d’avoir un bioassay végétal pour tester s’il est toxique pour les plantes. Toutefois, cela prend trois semaines.Cette méthode peut être faite en environ deux à trois jours. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est simple, abordable et efficace. Cet essai est un criblage rapide du compost spécifique pour supprimer la croissance de Rhizoctonia solani.Cependant, cet essai peut également être employé contre d’autres pathogènes végétaux soilborne, tels que fusariums, pythiums, et phytophthoras. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle parce qu’elle prend soin d’isoler et de maintenir une culture pure d’un champignon tout en évitant la contamination. Taylor Readyhough, un étudiant diplômé de mon laboratoire, démontrera la procédure d’isolement.Emma Wright, une étudiante de premier cycle de mon laboratoire, fera la démonstration de l’analyse du concours. Pour commencer, semer des graines de radis rouge dans le sol connu pour avoir des antécédents de maladie causée par R.solani. Après trois à quatre semaines, retirer les semis du sol et les rincer à l’eau du robinet.À l’aide d’une lame de rasoir, couper des segments d’un centimètre de l’hypocotyle et de la racine qui ont une couleur brune. Ensuite, utilisez des forceps stérilisés par flamme pour tremper les segments dans une solution d’eau de Javel à 10 % pendant une minute. Après cela, rincer les segments à l’eau stérile.Ensuite, utilisez des forceps stérilisés par flamme pour transférer les segments dans une serviette en papier. Tapoter les segments secs, et les transférer dans une boîte de Pétri avec de l’agar d’eau. Placez la boîte de Pétri à l’intérieur d’un récipient avec un couvercle et incubez les segments à température ambiante.Pour établir une culture de fille, transférez un des segments au centre d’une plaque fraîche d’agar de dextrose de pomme de terre. Après cela, autoclave tubes à essai de 25 millilitres contenant 10 millilitres d’eau. Ajouter deux échantillons de 0,5 gramme de chaque échantillon d’essai à une paire de tubes à essai autoclavés avec 10 millilitres d’eau stérile, et secouer les tubes à essai pendant la nuit.Après 24 heures, ajouter 1,5 gramme d’agar nature et 90 millilitres d’eau distillée à une paire de flacons coniques. Après avoir autoclavant les flacons, placez-les dans un bain d’eau de 45 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, versez l’échantillon de référence autoclavé et l’échantillon vivant dans l’agar fondu.Verser les mélanges de chaque flacon dans cinq boîtes de Pétri. Pour protéger les microbes indigènes, il est important de ne pas ajouter le compost pendant que l’agar est trop chaud. Par conséquent, laisser refroidir l’agar à 45 degrés Celsius avant d’ajouter le compost.En utilisant la technique aseptique, transférer des morceaux de R.solani à chaque paire de plaques d’échantillon. Ensuite, incuber les assiettes à température ambiante pendant un à deux jours. Enfin, utilisez une règle claire et plate et un microscope stéréo pour mesurer le rayon du mycélium dans chaque plaque au millimètre près.Dans ce protocole, des extraits de composts vivants ont supprimé la croissance de R.solani sensiblement plus que les échantillons autoclavés, démontrant que l’effet était microbien et non à base de nutriments. La suppression est mesurée comme une réduction de la croissance par rapport au contrôle autoclavé. La croissance n’a pas été affectée par la durée de maturation ou de séchage du compost.La croissance a été sensiblement affectée par la méthode de compost et les ingrédients de recette, spécifiquement avec le vermicompost, les processus de sillon, et les recettes avec l’écorce de bois dur. Après son développement, cette technique peut être un candidat à la certification commerciale du compost pour les propriétés répressives de la maladie.

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