Name: Un essai de mise à mort de sphéroïde par les cellules de T de voiture (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Apprenez à évaluer la cytotoxicité des cellules CAR T contre des sphéroïdes tumoraux 3D en temps réel. Cette méthode combine imagerie avancée et dosage immunologique sensible pour étudier l'efficacité des immunothérapies anticancéreuses.

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Ce travail a été soutenu par le Conseil de recherche norvégien sous subventions #244388, #254817 et #284983 ; la société norvégienne de Cancer (#6829007) ; La région de norvégien de la santé du Sud-est sous Grant #17/00264-6 et #2016006.

1. génération des sphéroïdes de lignée de cellules de Cancer Colorectal
<ol><li>Monocouches de cellules laver HCT 116 (stablement transduites pour exprimer le Cluster de différenciation 19 (CD19) et protéine de Fluorescence verte (GFP)) avec phosphate buffered saline (PBS ; 5 mL pour un 25 cm2 ou 10 mL pour un flacon de2 75 cm). Ajouter la trypsine (0,5 mL pour un 25 cm2 ou 1 mL pour un flacon de2 75 cm) et incuber les cellules à 37 ° C pendant 5 min.</li>
	<li>Vérifier le détachement des cellules au microscope et neutraliser l’enzyme dissociation cellulaire avec milieu de Roswell Park Memorial Institute 160 complet (RPMI 1640) (RPMI 1640 + 10 % FCS + gentamycine ; 10 mL pour un 25 cm2 ou 20 mL pour un flacon de2 75 cm).</li>
	<li>Suspension de cellules de centrifugation à 500 g pendant 5 min. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre en suspension en pipettant également monter et descendre plusieurs fois avec 5 mL de milieu RPM1 1640 complet.</li>
	<li>Compter les cellules à l’aide de bleu Trypan exclusion sur un compteur de cellules compatibles.</li>
	<li>Suspension de cellules de centrifugation à 500 g pendant 5 min. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre en suspension dans un milieu RPMI pour obtenir 5 x 103 cellules/mL.</li>
	<li>Transférer la suspension cellulaire dans un réservoir stérile et pipeter 200 µL/puits dans un 96 puits autour des plaques de fond à l’aide d’une pipette multicanaux.</li>
	<li>Transfert de la plaque de l’appareil d’imagerie automatisée à l’intérieur de l’incubateur (37 ° C, 5 % de CO2, 95 % d’humidité).</li>
	<li>Ouvrez une session dans le logiciel d’acquisition, sélectionnez Calendrier à acquérir | Lancement ajouter navire | Scannez le calendrier | Créer le navire : nouvelle.</li>
	<li>
Sélectionnez l’analyse Type : sphéroïde. Sélectionner les chaînes d’intérêt : Phase + fond clair (pour suivre la croissance de sphéroïdes), vert (pour suivre le signal de la tumeur, acquisition temps 300 ms) et rouge (pour suivre l’apoptose, acquisition temps 400 ms).
	<ol>
<li>Sélectionner l’agrandissement souhaité : 10 x.</li>
		<li>Choisissez le modèle de plaque et de sa position dans le tiroir. Sélectionnez la position des puits à l’image. Entrez la description de l’expérience : nom, type de cellules, nombre de cellules.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour la configuration de l’analyse, sélectionnez Reporter l’analyse jusqu'à ce que plus tard. Faites un clic droit sur la barre temporelle et sélectionnez l’option Set sélectionné Scan groupe intervalle et mis ajouter des scans chaque à 4 h et pour un total de 24 h. régler l’heure de départ souhaitée (au moins 1 h après incubation dans l’appareil d’imagerie automatisée).</li>
	<li>
Vérifier tous les 2 jours pour la croissance des sphéroïdes en ouvrant une session dans le logiciel d’imagerie.
	<ol>
<li>Choisissez l’option Vue Scans récents et cliquez deux fois sur l’expérience souhaitée. Sélectionnez fond clair dans le panneau couches image et utilisez l’image mesure caractéristiques outil pour mesurer le diamètre des sphéroïdes. Il faut compter 6 jours pour un sphéroïde atteindre la taille désirée : 0,5 mm de diamètre. Ajouter 50 µL de milieu RPMI complet / puits à jour 4 pour limiter l’effet de l’évaporation moyenne.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. génération des cellules CD19 voiture T
<ol><li>
Expansion des cellules CD19 voiture T Remarque : Expression stable des cellules CD19 voiture T a été acquise par transduction rétrovirale en vrac du donneur sain PBMC comme précédemment décrit16. La construction rétrovirale codant pour CD19 voiture est une voiture de deuxième génération et se compose de chaîne scFv fmc63, charnière CD8 et domaine transmembranaire, un domaine de costimulation 4-1BB et enfin un domaine CD3ζ.<ol>
<li>Pour développer, culture du T transduite cellules en présence d’anti-CD3/28 billes magnétiques avec une cellule au rapport de la perle de 1:1 pour 10 à 11 jours. Au cours de l’expansion, les cellules sont en milieu complet (VIVO X 15, 5 % sérum remplacement et IL-2 humaine recombinante de 100 U/mL). Remarque : La densité idéale pour un développement efficace est de 1 à 2 x 106 cellules/mL. En fonction du nombre initial, les cellules peuvent être développés dans des flacons (flacons2 25 cm à 20 mL, 75 cm2 flacons de 40 mL du volume total) dans un incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5 % de CO2, 95 % d’humidité).</li>
		<li>Comme groupe témoin négatif pour les épreuves suivantes, notamment non-transduites PBMC (désignera comme Mock) du protocole extension parallèle aux cellules CD19 voiture T.</li>
		<li>Le jour 3, ajouter un milieu frais tous les jours et diviser les cellules en flacons de culture plus si nécessaire.</li>
		<li>Jour 10 – 11, cellules de centrifugation à 500 g pendant 5 min. Retirez le surnageant et combiner toutes les cellules dans un tube de 50 mL et remettre en suspension les cellules dans environ 30 mL de supports complets neufs.</li>
		<li>Placer le tube de 50 mL contenant les cellules remises en suspension sur un support magnétique pour séparer les billes magnétiques de milieu de culture.</li>
		<li>Attendre 2 à 3 min pour les perles de recueillir sur les bords du tube.</li>
		<li>Enlever le milieu de culture avec une pipette et le transfert dans un nouveau tube sans toucher les zones de collecte de billes magnétiques.</li>
		<li>Répétez les étapes concernant le retrait de la perle (2.1.5–2.1.7) une fois de plus pour limiter le nombre de billes dans le milieu de culture.</li>
		<li>Remettre en suspension et compter les cellules non vides, ajuster la densité de 1 à 2 x 106 cellules/mL dans le milieu complet.</li>
		<li>Reposer les cellules au moins 4 h jusqu'à la nuit. Ensuite directement congeler à-80 ° C vers le bas et transférer les flacons dans un réservoir d’azote liquide le lendemain pour le stockage à long terme. Alternativement, on peut prolonger le reste jusqu'à toute la nuit pour une utilisation immédiate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Contrôle d’expression CD19 voiture sur des cellules primaires de T
	<ol>
<li>Compter le nombre de NKT élargi que les chiffres peuvent varier légèrement après une culture ou modérément après gel/dégel.</li>
		<li>Transfert de 5 x 105 cellules de deux voiture CD19 et Mock NKT primaire pour séparer les tubes de cytométrie de flux.</li>
		<li>Laver les cellules avec 200 μL de tampon de flux (2 % FBS dans du PBS) et centrifuger les tubes à 500 x g pendant 5 min. répéter les étapes de lavage pour se débarrasser de tous les artefacts causés par le milieu de culture.</li>
		<li>Préparer l’anticorps primaire (biotine Goat anti-Mouse IgG, F(ab') ₂ Fragment spécifique) en effectuant la dilution de 1 : 200 dans le tampon de flux.</li>
		<li>Remettre en suspension les cellules de 100 μL de mélange d’anticorps par tube et incuber sur la glace pendant 15 min. Répétez l’étape précédente de laver deux fois pour éliminer les anticorps excédentaire.</li>
		<li>Préparer l’anticorps secondaire (streptavidine-PE) en dilution 1 : 400 dans le tampon de flux.</li>
		<li>Remettre en suspension les cellules de 100 μL de mélange d’anticorps par tube et incuber sur la glace pendant 15 min. Répétez l’étape précédente de laver deux fois pour se débarrasser de l’excès anticorps.</li>
		<li>Remettre en suspension les cellules dans 200 μL de tampon de flux par tube et de les analyser sur un cytomètre en flux.</li>
		<li>Utilisation des cellules T se moquer pour mettre en place la porte positif et négatif et analyser CD19 voiture transduites NKT en conséquence.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 3D tumeur sphéroïde Killing Assay
<ol><li>
Après 6 jours ou une fois sphéroïdes atteignent la taille souhaitée, retirez la plaque de l’incubateur. À l’aide d’une pipette multicanaux, Retirez doucement 100 µL/puits de milieu IPMB 1640 complet des plaques sphéroïde.
	<ol>
<li>Pour cette étape, les pointes vers l’intérieur d’angle murale de la plaque 96 puits, en évitant tout contact avec le fond du puits afin de minimiser la perturbation des sphéroïdes. Restant de volume devrait être environ 100 µL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer une solution de 1 : 200 d’annexine V rouge en mélangeant 50 µL de l’annexine V rouge avec 9,95 mL du milieu RPMI 1640 complet.</li>
	<li>Ajouter 100 µL/puits de la 1 : 200 solution annexine V rouge.</li>
	<li>Transférer la plaque dans un incubateur (37° C, 5 % de CO2, 95 % d’humidité) pendant 15 min.</li>
	<li>Récolter les cellules T CD19 voiture transduits dans un tube de 15 mL et centrifuger à 500 g pendant 5 min. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre en suspension en pipettant également monter et descendre plusieurs fois avec 2 mL de milieu RPM1 1640 complet.</li>
	<li>Compter les cellules à l’aide de bleu Trypan exclusion sur un compteur de cellules compatibles.</li>
	<li>Suspension de cellules de centrifugation à 500 g pendant 5 min. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre en suspension dans un milieu RPMI pour obtenir 2 x 105 cellules/mL.</li>
	<li>Transférer la suspension cellulaire à un réservoir stérile et verser 100 µL/puits dans un 96 puits rond plaque de sphéroïde de fond à l’aide d’une pipette multicanaux.</li>
	<li>Transférer la plaque arrière de l’appareil d’imagerie automatisée à l’intérieur de l’incubateur (37 ° C, 5 % de CO2, 95 % d’humidité).</li>
	<li>
Ouvrez une session dans le logiciel d’acquisition, sélectionnez calendrier afin d’acquérir.
	<ol>
<li>Faites un clic droit sur la chronologie de Scan et sélectionnez Modifier chronologie. Faites un clic droit sur le groupe de balayage et supprimez-le. Faites un clic droit sur le calendrier et sélectionnez option Set sélectionné Scan groupe intervalle et définir ajouter des scans chaque à 1,5 h et pour un total de 24 h.</li>
		<li>Régler l’heure de départ souhaitée (au moins 1 h après incubation dans l’appareil d’imagerie automatisée). Sélectionnez enregistrer les scans du calendrier.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. analyse d’images automatisé
<ol><li>Connectez-vous à acquisition, choisissez l’option Vue récente analyse et sélectionnez l’option Lancer l’analyse . Sélectionnez créer nouveau définition d’analyse | Type d’analyse : sphéroïde. Cochez les canaux de l’Image afin d’analyser (Phase + fond clair, vert et rouge).</li>
	<li>Sélectionnez au moins 10 images représentatives : en règle générale, 1 par État et par au moins 3 points dans le temps (début, milieu et fin de l’acquisition).</li>
	<li>Aperçu par défaut analyser la procédure sur la pile de l’ensemble de l’image.</li>
	<li>Modifier les paramètres pour masque fond clair. Les paramètres typiques sont : sensibilité 10, trou remplir 1 000 µm2min zone 1 000 µm2. Un aperçu sur la pile de l’ensemble de l’image et vérifiez que les paramètres sélectionnés détecter les sphéroïdes avec précision.</li>
	<li>Modifier les paramètres pour masque verte (GFP). Les paramètres typiques sont : chapeau haut de forme segmentation avec rayon 200 µm et seuil 3 GCU, bord scindé, trou remplir 5 000 µm2, ajuster taille -2 pixels, zone min 3 000 µm2. Un aperçu sur la pile de l’ensemble de l’image et vérifiez que les paramètres sélectionnés détecter les sphéroïdes avec précision.</li>
	<li>Modifier les paramètres pour masque rouge (annexine V). Les paramètres typiques sont : chapeau haut de forme segmentation avec rayon 150 µm et seuil 2 CUU, bord scindé, trou remplir 5 000 µm2, ajuster taille 0 pixels, zone min 1 000 µm2. Un aperçu sur la pile de l’ensemble de l’image et vérifiez que les paramètres sélectionnés détecter les sphéroïdes avec précision.</li>
	<li>
Lancement de l’analyseur.
	<ol>
<li>Une fois l’analyse terminée, extrait de la mesure de l’intérêt. Sélectionnez le fichier analysé, puis l’option Paramètres du graphique . Sélectionnez les paramètres d’intérêt, l’analyse et le puits. En général, totale intensité rouge et verte sur fond clair territoire donne les mesures les plus précises en limitant le signal de fluorescence aux limites sphéroïdes déterminée par le masque de fond clair (Figure 3). Extraire les mesures choisies dans plusieurs format de fichier en cliquant sur «Exporter les données».</li>
	</ol>
</li>
	<li>Procédez à l’extraction des images et des films en sélectionnant le fichier analysé et puis sélectionnez l’option exporter des Images et des films . Deux options sont disponibles, soit « comme affiché » pour récupérer des images et des films comme vu sur le logiciel d’imagerie (images habituellement composées), soit « sauvegardé » pour récupérer les données brutes pour analyse externe par le biais de logiciels de tierce-partie.</li>
</ol>

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<li>Birgersdotter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culturing+of+the+Hodgkin+lymphoma+cell-line+L1236+induces+a+HL+tissue-like+gene+expression+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culturing of the Hodgkin lymphoma cell-line L1236 induces a HL tissue-like gene expression pattern.</a> Leukemia & Lymphoma. 48 (10), 2042-2053 (2007).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’utilisation des sphéroïdes comme un outil innovant pour valider le traitement du cancer futur est devenu un domaine d’intérêt croissant au cours des années. Sphéroïdes représentent une étape intermédiaire entre le classique 2D analyse in vitro et in vivo évaluation. La méthode plus détient beaucoup de promesse concernant leur puissance en termes de tumeur micro-environnement imitant ainsi que du gène7de profilage. Le protocole présenté dans cette publication est une adaptation de messaoud </...

Transfert de cellules adoptifs (ACT) représente le traitement du cancer la prochain génération. Il repose sur l’injection de cellules effectrices (ou NK-cellules T) dans un patient. Ces cellules peuvent être génétiquement modifiés avec un récepteur qui va les guider vers leur cible, la tumeur et le détruire. Récemment, cette approche s’est avérée possible lorsqu’un récepteur d’antigène chimérique (voiture) dirigé contre le marqueur de cellules B CD19 a été introduit dans les cellules du patient T pour tuer son cancer1. Dans le cas de la voiture, qui est un récepteur artificiel, la conception se compose de fragments d’anticorps spécifiques, l’antigène binding domain réduit à un fragment de variable d’une chaîne unique désigné (scFv), entité liée à des domaines de signalisation de cellules T. Bien qu’il y a plusieurs dessins ou modèles, les versions les plus couramment utilisées dénommé comme deuxième génération modèles de voiture, se composent de CD3z pour la signalisation de TCR et un domaine de costimulation (CD28, 4-1BB, OX40, etc..) 1 , 2. le domaine de l’immunothérapie réalisé la plupart de son attention à cette nouvelle forme de la loi lorsque les cellules CD19 voiture-T traitement efficacement de nombreux patients atteints de tumeurs malignes de lymphocytes B3,4. Suite à ce succès, les chercheurs ont essayé d’exploiter les conceptions semblables en ciblant les autres épitopes pour des tumeurs solides avec un succès limité. Malheureusement, la rareté des antigènes spécifiques de la tumeur et les micro-environnements tumeur plus sévères rendus voiture T cellules moins efficaces vers des tumeurs solides5.
Actuellement, les stratégies de validation plus couramment utilisés in vitro reposent sur des systèmes bidimensionnels (2D) qui portent uniquement sur un fragment des défis déjà mentionné de tumeur solide. Classiquement, 2D en vitro systèmes comportent un mélange de cellules de T de voiture et de lignées de cellules cancéreuses cible comme monocouches pour évaluer la fonctionnalité et la spécificité de ces cellules effectrices. Bien que ces stratégies sont des parties importantes et vitales des études, ils ne prennent pas en considération la morphologie complexe et une structure de tridimensionnelle (3D) des cellules du cancer6. Cellules cancéreuses cultivées dans des systèmes 3D, dénommé sphéroïdes, acquièrent de nouveaux caractères phénotypiques à travers des changements dans le gène expression profil7, susceptibles d’influencer la reconnaissance par les cellules effectrices redirigée. Birgersdotter et ses collègues ont démontré qu’une lignée de cellules de Hodgkin lymphome (HL) lorsqu’il est cultivé seulement dans un modèle de culture 3D acquiert un profil d’expression génique qui est semblable à la tumeur primitive échantillons8. Par conséquent, sphéroïdes ou 3D similaires culture offre des méthodologies plus pertinent dans des modèles in vitro par opposition aux systèmes 2D standards. Ces systèmes sont également semblables à des études in vivo qui sont considérés comme la dernière étape dans le processus de validation d’une voiture donnée. Considérant que les systèmes 2D ne parviennent pas à imiter la morphologie des grappes de cancer, sphéroïdes proposent des formations similaires afin d’évaluer la fonctionnalité des cellules de T de voiture avant modèles in vivo. Dans une étude, Pickl Al identifié qu’un modèle de sphéroïde de récepteur de facteur de croissance épidermique humain (HER2) surexprimant les cellules cancéreuses démontré des profils similaires de signalisation de modèles in vivo9. Cela soutient encore que les sphéroïdes offrent plus pertinentes et fermer-à vivo évaluation des cellules T de la voiture. En outre, validation de lymphocytes-T de voiture contre sphéroïdes peut aider à évaluer leur efficacité plus critique et empêcher que certaines des conceptions études in vivo prématurément10; contribuant ainsi, à la recherche sur le plan éthique concerné en sacrifiant moins d’animaux. En outre, protocoles utilisant des sphéroïdes ne sont pas plus chers que les systèmes 2D classiques et beaucoup plus rapide par rapport aux études classiques en vivo . Globalement, on peut prédire que l’inclusion d’études de sphéroïde va bientôt devenir une pratique standard pour relier les études in vitro et in vivo.
Nous présentons ici la préparation des sphéroïdes de la lignée de cellules cancéreuses du côlon HCT 116. Cette lignée cellulaire a été modifiée afin d’exprimer la molécule CD19 humaine qui la rend sensible aux cellules T voiture CD19 et de fournir une évaluation claire de l’assassinat à l’aide d’une construction de voiture cliniquement validée.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Saline tamponnée au phosphate</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>D8537-500ML</td><<td>strong>Numéro de lot : RNBG7037</td></tr><tr><td>75 cm&sup2 ; flacons de surface végressive</td><td>VWR</td><td>430639</td><td>Numéro de lot : 2218002</td></tr><tr><td>flacons de 75 cm&sup2 ; zone de croissance</td><td>VWR</td><td>734-2705</td><td> Numéro de lot : 3718006</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>SIGM-ALDRICH</td><td>T3924-100ml</td><td>Numéro de lot : SLBTO777</td></tr><tr><td>RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 mL</td><td>Life Technology (Gibco)</td><td>21875-091</td><td>Numéro de lot : 1926384</td></tr><tr><td>Sérum de bovin fœtal</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td>Numéro de lot : 08Q3066K</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Thermo Fischer</td><td>15750060</td><td>Numéro de lot : 1904924A</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4 %</td><td>Thermo Fischer</td><td>15250061</td><td>Numéro de lot : 1886513</td></tr><tr><td>Plaque à 96 puits, fond rond</td><td>VWR</td><td>734-1797<</td><td>strong>Numéro de lot : 33117036</td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td><td>Thermo Fischer</td><td>11132D-X-VIVO</td><td></td></tr> <tr><td>15 avec gentamicine L-Gln, rouge de phénol, 1 L</td><td>BioNordika</td><td>BE02-060Q</td><td>Numéro de lot : 8MB036</td></tr><tr><td>CTS Immune Cell Serum Replacement</td><td>Thermo Fischer</td><td>A2596102</td><td>Numéro de lot : 1939319</td></tr><tr><td>IL-2 Proleukin</td><td>Novartis</td><td></td><td>Numéro de lot : 505938M</td></tr><tr><td>IncuCyte Annexin V Red Reagent</td><td>Essen Bioscience</td><td>4641</td><td>Numéro de lot : 17A1025-122117</td></tr><tr><td>Réservoir de réactifs</td><td>VWR</td><td>89094-672</td><td>Numéro de lot : 89094-672</td></tr><tr><td>Tubes de 15 mL</td><td>VWR</td><td>734-1867</td><td>Numéro de lot : 19317044</td></tr><tr><td>anti-humain CD19-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555413</td><td>Numéro de lot : 4016990 RRID : AB_395813</td></tr><tr><td>Biotine-SP (espaceur long) AffiniPure F(ab')2 Fragment de chèvre anti-souris IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-066-072</td><td>Numéro de lot : 129474 : RRID : AB_2338583</td></tr><tr><td>Streptavidin-PE</td><td>BD</td><td>Biosciences 554061</td><td>Numéro de lot : 5191579 : RRID : AB_10053328</td></tr><tr><td>HCT 116 Carcinome colorectal Line</td><td>ATCC</td><td>CCL-247-Incucyte</td><td></td></tr> <tr><td>S3</td><td>Essen Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un essai de mise à mort de sphéroïde par les cellules de t de voiture

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

L’immunothérapie est devenu un domaine d’intérêt croissant dans la lutte contre le cancer autrement impossibles à traiter. Parmi toutes les méthodes immunothérapeutiques, récepteur de l’antigène chimérique (voiture) redirigé NKT a obtenu les résultats plus spectaculaires, en particulier avec la pédiatrie B-la leucémie lymphoblastique aiguë (lla-B). Les méthodes de validation classique de lymphocytes T de voiture reposent sur l’utilisation de la spécificité et les tests de fonctionnalité des cellules T de voiture contre les cellules cibles en suspension et dans des modèles de xénogreffes. Malheureusement, les observations faites in vitro sont souvent découplées de résultats obtenus in vivo et beaucoup d’effort et d’animaux puisse être épargné en ajoutant une autre étape : l’utilisation de la culture 3D. La production des sphéroïdes hors des cellules cibles potentielles qui imitent la structure 3D des cellules tumorales lorsqu’ils sont greffés dans le modèle animal représente une alternative idéale. Nous rapportons ici une méthode simple, abordable et fiable pour produire des sphéroïdes d’une lignée cellulaire de cancer colorectal transduite comme un outil de validation pour la thérapie cellulaire adoptive (exemplifié ici par les cellules CD19 voiture T). Cette méthode est couplée avec un système d’imagerie live avancé qui peut suivre la croissance de sphéroïde, cytotoxicité et tumeur de l’apoptose des cellules des cellules effectrices.

Comme peut être vu dans la Figure 1, il est crucial de vérifier, par cytométrie en flux, le niveau d’expression du CD19 voiture sur les lymphocytes T (Figure 1 a) et le niveau de CD19 sur des lignées cellulaires tumorales HCT116 (Figure 1 b). La figure 2 illustre le résultat d’une expérience typique sphéroïde. Les appareils d’imagerie automatisée prend des photos en quat...

Ce protocole est conçu pour évaluer la cytotoxicité de lymphocytes (cellules T voiture) redirigée immunothérapeutique contre les cellules cancéreuses structurés (sphéroïdes) 3D en temps réel.

Un essai de mise à mort de sphéroïde par les cellules de T de voiture

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Cette méthode peut aider à répondre à la question clé dans le domaine de l’immunothérapie au sujet de l’évaluation de la cytotoxicité des cellules immunitaires contre les cellules tumorales à structure 3D. Les principaux avantages de cette méthode sont qu’elle est simple et qu’elle combine une technologie d’imagerie avancée et un essai immunologique sensible. Commencez par laver la ligne d’intérêt des cellules cancéreuses colorectales avec cinq millilitres de PBS et en enlevant les cellules du fond du flacon avec 0,5 millilitres de trypsine pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius.Après confirmation du détachement au microscope, neutraliser l’enzyme de dissociation cellulaire avec 10 millilitres de milieu complet et recueillir les cellules par centrifugation. Resuspendez la pastille en cinq millilitres de milieu complet frais pour compter et résuspendre les cellules à une concentration de 1,5 fois 10 à la troisième cellule par millilitre de concentration. Puis ensemencer 200 microlitres de cellules dans chaque puits de plaque inférieure ronde de 96 puits et placer la plaque dans un appareil d’imagerie automatisé à l’intérieur d’un incubateur de 37 degrés Celsius avec 5% de CO2 et 95% d’humidité.Connectez-vous au logiciel d’acquisition de l’appareil et sélectionnez Schedule to Acquire, Launch Add Vessel, Scan on Schedule et Create Vessel New. Ensuite, sélectionnez le type sphéroïde de type scan et sélectionnez les canaux d’intérêt appropriés pour le champ lumineux et la fluorescence. Réglez le grossissement à 10 fois et sélectionnez le modèle de plaque et sa position dans le tiroir de l’appareil d’imagerie.Sélectionnez la position des puits à imager et entrez la description de l’expérience, y compris le nom, le type de cellules et le nombre de cellules. Pour la configuration de l’analyse, sélectionnez Analyse différer jusqu’à plus tard, cliquez à droite sur la chronologie, sélectionnez l’intervalle de groupe d’analyse sélectionné défini et définissez Ajouter des analyses toutes les à quatre heures et pour un total de 24 heures. Réglez ensuite l’heure de départ au moins une heure après l’incubation dans l’appareil d’imagerie automatisé.Pour vérifier l’évolution de la croissance sphéroïde, tous les deux jours, connectez-vous au logiciel d’imagerie et sélectionnez Afficher les analyses récentes. Double clic sur l’expérience d’intérêt et sélectionnez Brightfield dans le panneau Canaux d’image. Utilisez ensuite l’outil Caractéristiques d’image mesure pour mesurer le diamètre des sphéroïdes, en ajoutant 50 microlitres de milieu complet par puits au quatrième jour pour limiter les effets d’évaporation moyenne.Lorsque les sphéroïdes atteignent la taille expérimentale appropriée, inclinez soigneusement la plaque et utilisez une pipette multicanal pour retirer délicatement 150 microlitres de milieu complet de chaque puits sans déranger les sphéroïdes. Ensuite, remplacez le milieu jeté par 50 microlitres d’une solution d’un à 200 d’Annexin V Red et placez la plaque dans un incubateur de culture cellulaire pendant 15 minutes. Centrifugeuse transduced CAR CD19 T cells in a 15 milliliter conical tube and resuspend the pellet in two milliliters of complete medium.Après compter, diluer les cellules à deux fois 10 à la cinquième cellule par millilitre de concentration moyenne complète. Ajoutez ensuite 100 microlitres de cellules T CD19 CAR à chaque puits contenant des sphéroïdes et retournez la plaque à l’appareil d’imagerie automatisé. Dans le logiciel d’acquisition, sélectionnez Schedule to Acquire et cliquez à droite sur la chronologie de l’analyse.Sélectionnez Modifier la chronologie et cliquez à droite sur le groupe d’analyse pour le supprimer. Cliquez à nouveau sur la chronologie et sélectionnez l’intervalle de groupe d’analyse sélectionné défini et définissez Ajouter des analyses toutes les 1 1/2 heures et pour un total de 24 heures. Réglez ensuite l’heure de début de l’imagerie à au moins une heure après le début de l’incubation dans l’appareil d’imagerie automatisé et sélectionnez Enregistrer les analyses d’horaire.Pour l’analyse automatisée de l’image, dans le logiciel d’analyse, sélectionnez Afficher les analyses récentes et l’analyse de lancement. Sélectionnez Créer une nouvelle définition d’analyse et d’analyse type Sphéroïde et définir les canaux d’image à analyser. Sélectionnez au moins 10 images représentatives et prévisualisez la procédure d’analyse par défaut sur l’ensemble de la pile d’images.Modifiez les paramètres du masque à champ lumineux et prévisualisez la pile d’images, confirmant que les paramètres sélectionnés détectent les sphéroïdes avec précision. Modifiez les paramètres du masque vert et prévisualisez la pile d’images pour confirmer que les paramètres sélectionnés détectent les sphéroïdes avec précision. Modifiez les paramètres du masque rouge et prévisualisez la pile d’images pour confirmer que les paramètres sélectionnés détectent les sphéroïdes avec précision.Prenez soin d’obtenir le meilleur signal sur le bruit et la sensibilité par rapport aux ratios de spécificité, en gardant à l’esprit que vous ne serez pas en mesure de trouver un ensemble de paramètres qui permettront de capturer chaque événement à chaque point de temps. Lancez ensuite l’analyseur. Lorsque l’analyse est terminée, extraire la mesure de l’intérêt et sélectionner le fichier analysé et l’option de mesure graphique.Sélectionnez les mesures d’intérêt, l’analyse et le puits. Cliquez sur Données d’exportation pour extraire les mesures sélectionnées dans plusieurs formats de fichiers. Ensuite, pour extraire les images, sélectionnez le fichier analysé et sélectionnez Images et films d’exportation.L’expression CD19 CAR sur les lymphocytes T transduced et l’expression CD19 sur les cellules cancéreuses colorectales transduced peuvent être confirmées par cytométrie de flux. Ici, le résultat d’une expérience sphéroïde typique peut être observé. Contrairement aux cellules T simulées, les lymphocytes T CD19 CAR sont capables de tuer spécifiquement les sphéroïdes dérivés de la lignée des cellules cancéreuses colorectales, ce qui diminue considérablement le nombre de cellules tumorales vivantes.Le suivi de l’évolution des signaux verts et rouges totaux à l’intérieur des limites sphéroïdes au fil du temps révèle que peu de temps après l’injection de lymphocytes T CD19 CAR, la taille des sphéroïdes diminue rapidement à mesure que le signal d’apoptose augmente rapidement. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes comme les tests de toxicité, les analyses de migration cellulaire ou les mesures de la structure sphéroïde peuvent être effectuées pour répondre à d’autres questions sur le dépistage des médicaments, la motilité des lymphes T ou la formation de sphéroïdes, respectivement.

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Les sphéroïdes sont un type de modèle de culture cellulaire 3D utilisé pour représenter plus précisément l’environnement d’une cellule par rapport aux modèles monocouches de culture cellulaire 2D. Dans l’exemple de protocole, nous verrons les scientifiques générer des sphéroïdes à partir d’une lignée cellulaire de cancer colorectal et appliquer l’imagerie de cellules vivantes pour suivre la croissance des sphéroïdes.

Génération de sphéroïdes à partir de lignées cellulaires : une méthode de culture cellulaire tridimensionnelle (3D)

Dans cette vidéo, nous démontrons le test de provocation tumorale répétitive pour évaluer le potentiel de destruction tumorale répétitive des cellules CAR-T lors de charges élevées de cellules tumorales. De plus, les cellules CAR-T peuvent être analysées à l’aide de la cytométrie en flux pour déterminer les différentes sous-populations de cellules CAR-T dans l’échantillon.

Essai de provocation tumorale répétitive : un essai de culture in vitro pour évaluer le potentiel de destruction des tumeurs répétitives des lymphocytes T du récepteur antigénique chimérique (CAR)

Cette vidéo présente une méthode de surveillance de l’activité des cellules CAR-T contre les cellules cancéreuses grâce à des mesures d’impédance électrique en temps réel. Le suivi des changements d’impédance évalue l’efficacité des cellules CAR-T à induire la cytolyse des cellules cancéreuses, ce qui donne un aperçu de leurs capacités cytotoxiques.

Un test de cytolyse in vitro en temps réel pour évaluer la puissance des cellules CAR-T

Cette vidéo présente un test in vitro évaluant les effets cytotoxiques des cellules CAR-T sur des sphéroïdes tumoraux 3D exprimant des protéines fluorescentes. Cette évaluation utilise la sonde fluorescente rouge Annexine V, qui se lie aux résidus de phosphatidylsérine exposés sur le feuillet externe des cellules cancéreuses apoptotiques après des interactions avec les cellules CAR-T. La fluorescence rouge émise par la sonde permet de distinguer ces cellules des cellules saines émettant une...

Un test in vitro pour évaluer la cytotoxicité des cellules CAR-T contre les sphéroïdes tumoraux

Cette vidéo présente un test in vitro pour valider l’activité des lymphocytes T du récepteur antigénique chimérique (CAR). Les cellules de lymphome à cellules B exprimant l’antigène CD19 et la luciférase cytoplasmique sont co-cultivées avec des cellules CAR-T spécifiques de CD19. La liaison des CAR aux CD19 sur une tumeur induit les cellules CAR T à libérer des cytokines et des toxines qui provoquent la cytotoxicité des cellules tumorales. L’activité des cellules CAR-T est évaluée en...

Un test in vitro pour évaluer l’activité antitumorale des cellules CAR-T spécifiques de la tumeur

Nous décrivons une cellule unique à haut débit essai pour mesurer la cytotoxicité des lymphocytes T lorsqu'ils sont incubés avec les cellules cibles tumorales. Ce procédé utilise une matrice élastomère dense, de puits sous-nanolitres (~ 100.000 puits / matrice) à l'espace confiner les cellules T et les cellules cibles à des rapports définis et est couplée à la microscopie par fluorescence pour surveiller effecteur-cible conjugaison et l'apoptose subséquente.

Quantitative à haut débit Test de cytotoxicité cellulaire unique pour les cellules T

Les auteurs décrivent l’évolution d’un modèle tridimensionnel, axée sur le sphéroïde le in vitro qui permet de tester la norme actuelle des régimes de thérapie expérimentale pour la tête et du cou carcinome épidermoïde sur des lignées cellulaires, visant à évaluer la thérapie sensibilité et résistance des cellules primaires de spécimens humains à l’avenir.

Vérifier dans un modèle de Culture cellulaire 3D basé sur l’ellipsoïde tête et cou, carcinome épidermoïde de la thérapie

Nous décrivons un système d'essai in vitro quantitatif de cytolyse en temps réel pour évaluer la puissance des cellules De T de récepteur d'antigène chimérique ciblant les cellules tumorales liquides et pleines. Ce protocole peut être étendu pour évaluer d'autres cellules effectrices immunitaires, ainsi que des traitements combinés.

Un analyse de puissance en temps réel pour les cellules T de récepteur d'antigène chimérique ciblant les cellules cancéreuses solides et hématologiques

Ici, nous présentons une méthode pour identifier les composés qui modulent le mécanisme ADCC, un mécanisme important de destruction des cellules cancéreuses des anticorps antitumoraux. L’effet cytotoxique des cellules NK est mesuré dans les sphéroïdes des cellules cancéreuses du sein en présence de trastuzumab. L’analyse d’images permet d’identifier les cellules tueuses et cibles vivantes et mortes dans les sphéroïdes.

Quantification de la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps dans un modèle sphéroïde tumoral : application à la découverte de médicaments

Ici, nous décrivons une méthode de création de gouttelettes à double émulsion encapsulant un lymphocyte T et une cellule cible cancéreuse afin d’examiner la destruction cellulaire au niveau de la cellule unique. Cette méthode permet une double quantification des molécules cytotoxiques et de l’apoptose des cellules cibles au sein d’une large population de lymphocytes T.

Essai de cytotoxicité basé sur des gouttelettes pour évaluer les lymphocytes T à récepteur de l’antigène chimérique au niveau de la cellule unique

Apprenez à évaluer la cytotoxicité des cellules CAR T contre des sphéroïdes tumoraux 3D en temps réel. Cette méthode combine imagerie avancée et dosage immunologique sensible pour étudier l'efficacité des immunothérapies anticancéreuses.

Un essai de mise à mort de sphéroïde par les cellules de T de voiture

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