Two-photon Imaging d’Attraction des microglies processus vers l’ATP ou la sérotonine cérébrale aiguë tranches

Pour caractériser pleinement un phénotype microglial, il est important de s’attaquer à la motilité basale et directionnelle. Ce protocole peut être utilisé pour tester la motilité directionnelle des microglies par imagerie à deux photons chez les souris tranches de cerveau, en utilisant l’interface d’impression 3D personnalisée et les chambres de perfusion. Fanny Etienne, doctorante, et Vincenzo Mastriolia, chercheur postdoctoral, tous deux de nos laboratoires, feront la démonstration de la procédure.

Au moins 30 minutes avant la dissection, commencer à bouillonner 70 millilitres de choline liquide céphalo-rachidien artificiel, ou aCSF choline, sur la glace. Ajouter 150 millilitres de choline aCSF à 32 degrés Celsius, avec carbogen. Placer un plat cristallisant de 200 millilitres à l’aide d’un aimant à barres dans une boîte d’aliments scellée et ajouter 200 millilitres d’aCSF au plat.

Placez un support de tranche d’interface imprimé 3D sur le dessus du plat et retirez l’excès de liquide du plat cristallisant, jusqu’à ce qu’il ne reste qu’un mince film de solution couvrant le maillage du support de diapositives de l’interface. Ajouter quelques millimètres d’aCSF au fond de la boîte de nourriture et commencer à bouillonner le liquide avec du carbogen. Ensuite, fermez la boîte scellée tout en maintenant la carbogénation constante pour créer une chambre d’interface humidifiée, 95%oxygène, 5% riche en dioxyde de carbone.

Après la récolte, placez le cerveau sur un morceau de papier filtre imbibé d’aCSF et disséquez la région d’intérêt, selon l’angle préféré de tranchage. Pour les tranches coronales, placez et collez la face caudale du cerveau sur une boîte de Pétri de 10 centimètres fixée au bloc de coupe d’une trancheuse vibrante, et placez le bloc dans la chambre du réservoir de la trancheuse vibrante dans une grande chambre remplie de glace. Remplissez le plat d’aCSF de choline glacée et utilisez la trancheuse pour obtenir des tranches de cerveau de 300 micromètres d’épaisseur, à l’aide d’une pipette de transfert jetable de quatre millimètres de diamètre après chaque passage de la lame pour recueillir chaque tranche.

Laissez chaque tranche récupérer dans l’aCSF choline de 32 degrés Celsius pendant environ 10 minutes après son obtenir, avant de transférer les tranches sur des morceaux de papier nettoyant pour lentilles, surmonté d’une goutte d’aCSF choline. Ensuite, aspirez l’excès de choline aCSF et utilisez une spatule pour transférer les tranches sur le maillage de la chambre d’interface, permettant aux tranches de récupérer dans cet environnement pendant au moins 30 minutes. 30 minutes avant de commencer l’enregistrement, connectez la pompe périssaltique à une chambre d’enregistrement personnalisée avec perfusion supérieure et inférieure pour optimiser l’oxygénation et la viabilité des tranches de tissu, et nettoyez l’ensemble du système de perfusion avec 50 millilitres d’eau ultrapure.

À la fin du cycle de nettoyage, commencer la perfusion de la chambre d’enregistrement avec 50 millilitres d’aCSF dans un bécher en verre sous carbogénation constante, et utiliser un jetable, pipette de transfert à grande bouche pour transférer la première tranche à être photographié au bécher pour enlever le papier objectif. Lorsque la section est descendue au fond du bécher, transférez la section dans la chambre d’enregistrement et placez le support de la tranche sur la tranche afin de minimiser le mouvement induit par le flux de perfusion. Utilisez l’éclairage à champ lumineux pour cibler la région cérébrale d’intérêt sous un grossissement de cinq à 10 x.

Ensuite, utilisez un objectif 25x avec une lentille d’immersion d’eau de 0,35 x pour ajuster la position du champ d’observation. Utilisez l’éclairage de fluorescence pour localiser les cellules microgliales fluorescentes et remblayer la pipette avec 10 microlitres d’aCSF contenant le composé d’intérêt à sa concentration finale. Dirigez la pointe vers le bas avec des secousses douces pour enlever les bulles d’air emprisonnées dans la pointe et monter la pipette remplie dans un support de pipette relié à une seringue de cinq millilitres avec le piston placé à la position de cinq millilitres et monté sur un micromanipulateur à trois axes.

Abaissez doucement la pipette vers la tranche, en contrôlant et en ajustant l’objectif en même temps, jusqu’à ce que la pointe de la pipette touche légèrement la surface de la tranche. Maintenant, régler le laser et passer le microscope au mode multiphoton. Assurez-vous que cette chambre est filtrée à partir de n’importe quelle source de lumière et allumez les détecteurs non descanned.

Définissez le gain et utilisez une table de recherchez avec une limite supérieure codée en couleur pour éviter de saturer les pixels de l’image. Ensuite, commencez à enregistrer pour une durée totale d’au moins 30 minutes, en déprimant lentement le piston de seringue de la position de cinq à un millilitre, après cinq minutes, sur une période de cinq secondes, pour appliquer le composé sur la section. Pour l’analyse d’image, effectuez d’abord la correction z-projection et drift avec ImageJ dans le fichier d’intérêt.

Ensuite, ouvrez le fichier modifié dans Icy et dessinez une zone circulaire d’intérêt de 35 micromètres de diamètre, centrée sur le site d’injection. Exécutez le film à nouveau avec le roi, pour s’assurer qu’il est bien positionné. Ensuite, utilisez le plugin d’évolution de la région d’intensité d’intérêt pour mesurer l’intensité moyenne au fil du temps dans la région d’intérêt, et enregistrer les résultats comme un fichier xls.

Ce protocole permet de mesurer les réponses induites par différents composés, comme l’ATP ou la sérotonine. Bien que l’injection d’ATP provoque une augmentation de la fluorescence, après la plupart des injections d’ATP, il ya une diminution immédiate et légère de la fluorescence due à la distorsion des tissus qui revient après quelques minutes. La taille de la région d’intérêt a également une incidence sur la quantification, car l’augmentation du diamètre réduit la variabilité entre les expériences, mais diminue l’exactitude et l’ampleur de la réponse détectée.

L’évaluation de la réponse microgliale à un moment précis peut être utile pour la comparaison statistique de différents composés, ou pour tester les effets d’antagonistes spécifiques ajoutés à la solution de perfusion. Pour quantifier la motilité en trois dimensions, sachez que vous devrez peut-être modifier l’intervalle z-step et le taux d’échantillonnage de l’acquisition pour vous adapter aux exigences d’analyse.