Name: Diagnostic de la maladie de Hirschspiral par immunostaining des biopsies d’aspiration rectale pour la Calrétinine, le gène protéine et le produit de protéine 9,5 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Apprenez un protocole d'immunomarquage pour biopsies rectales par aspiration afin de diagnostiquer la maladie de Hirschsprung. Cette méthode détecte la calrétinine, la protéine S100 et le PGP9,5 avec une haute sensibilité.

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Les auteurs remercient Weibing Tang pour sa grande aide dans la fourniture du laboratoire de tournage. Cet article est appuyé par la recherche sur le bien-être public, et des fonds spéciaux ont été reçus de la santé nationale et de la planification familiale de la Chine (Grant No. 201402007).

Ce protocole a été approuvé par le Conseil d’éthique de la recherche de l’hôpital de l’Union de l’Université de science et de technologie de Huazhong.
1. biopsie d’aspiration rectale
<ol><li>Effectuer la biopsie d’aspiration rectale par un chirurgien pédiatrique bien formé et un assistant utilisant un système de biopsie rectale d’aspiration Rbi2 après avoir obtenu le consentement éclairé du tuteur.<ol>
<li>Effectuer des RSB sur les patients qui ont les indications suivantes: incapacité de passer le méconium chez les nourrissons ou les ballonnements à long terme avec ou sans constipation chez les enfants; les enfants souffrant de constipation à long terme qui ont besoin d’huile de paraffine pour terminer la défécation; occlusion intestinale ou perforation intestinale avec des raisons inconnues chez les enfants qui subissent une enterostomie. Nota: les contre-indications pour le RSB sont les suivantes: les enfants qui présentent des symptômes sévères, qui sont en mauvais état physique, ou qui ne peuvent pas tolérer le RSB; les enfants présentant une entérocolite à stade aigu; les enfants subissant une anastomose intestinale sans guérison complète.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Effectuer un lavement de rétention saline normale comme préparation intestinale 36 h avant la procédure pour éviter les selles molles et l’œdème excessif de la muqueuse. Ajouter la solution de sulfate de magnésium si l’enfant a une constipation sévère. Administrer la vitamine K (1 mg/kg) aux nouveau-nés. Remarque: ne pas effectuer de tests sanguins préopératoires ou administrer des antibiotiques, car ils ne sont pas nécessaires.</li>
	<li>Mettez le patient en position de lithotomie. Enduire la surface du tube d’huile de paraffine. Insérez le tube arrondi 4-7 cm dans le rectum avec le trou latéral orienté vers les parois postérieures ou latérales.</li>
	<li>Appliquez une pression douce sur le tube pour faciliter l’adhérence adéquate du trou latéral à la paroi rectale. Appuyez sur la gâchette et retirez immédiatement l’outil.</li>
	<li>Utiliser l’instrument de biopsie pour obtenir 4 biopsies d’aspiration d’un diamètre de 2 mm à 3 cm et 6 cm au-dessus de la ligne dentaire, antérieurement et postérieure. Utiliser une aiguille pour placer l’échantillon sur une gaze humidifiée avec une solution saline.</li>
	<li>Observez le patient jusqu’à 2 h après la procédure pour exclure les saignements rectaux. Évitez d’autres manipulations rectales et anales au cours des 24 premières heures après la RSB.</li>
</ol>2. préparation des sections du RSB
<ol><li>Placer les biopsies d’aspiration rectale dans 4% paraformaldéhyde pendant 6 h pour fixer le tissu. Utiliser un volume fixatif 5 fois plus que le volume tissulaire.</li>
	<li>Déshydrater le tissu à l’aide du déshydrateur tissulaire pathologique pendant 11 h. L’ensemble du processus programmé se compose des 5 étapes suivantes:<ol>
<li>Placer le tissu dans du formaldéhyde et le fixer pendant 1 h.</li>
		<li>Placer le tissu dans de l’éthanol à 75% pendant 4 h.</li>
		<li>Placer le tissu dans de l’éthanol absolu (deux changements, 1 h chacun).</li>
		<li>Placer le tissu dans de l’éthanol absolu (deux changements, 30 min chacun).</li>
		<li>Placer le tissu dans du xylène (trois changements, 1 h chacun).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placer le tissu dans de la cire de paraffine (58-60 ° c) (trois changements, 1 h chacun). Incorporer les tissus RSB dans des blocs de paraffine.</li>
	<li>Coupez les blocs de paraffine à l’aide d’un microtome jusqu’à ce que le tissu soit entièrement exposé avec un plan de coupe complet.</li>
	<li>Coupez les blocs en sections de 0,4 μm avec un microtome.</li>
	<li>Placer les sections dans de l’eau à 45-50 ° c pendant quelques secondes chacune pour permettre aux sections de se propager dans une assiette plate.</li>
	<li>Transférer les sections de paraffine sur les glissières.</li>
	<li>Cuire les lames dans un four à 60 ° c pour 3-5 h. Évitez de faire cuire trop longtemps, ce qui peut entraîner la perte des antigènes.</li>
	<li>Placer les lames déparaffinées dans le xylène (2 changements, 15 min chacun).</li>
	<li>Hydrater les lames dans de l’éthanol absolu, 95%, 80% et 75% d’éthanol pendant 5 min chacune. Ensuite, rincez-les à l’eau purifiée par osmose inverse (RO) pendant encore 5 min.</li>
</ol>3. récupération d’antigènes
<ol><li>Faire des dilutions de travail pour la récupération de la calrétinine en mélangeant 4 mL de tampon de récupération de l’antigène EDTA avec 200 mL d’eau purifiée au RO. Faire des dilutions de travail pour la récupération de l’acide citrique et du PGP 9.5 en mélangeant 1 mL de tampon de citrate de sodium (100X) avec 99 mL d’eau purifiée au RO. Remarque: la Calrétinine peut être récupérée préférentiellement par la solution de récupération d’EDTA. Cependant, le tampon de citrate de sodium d’acide citrique est plus approprié pour la récupération de la solution et du PGP 9.5.</li>
	<li>Placez les lames dans un bocal de coloration de Coplin. Remplissez le bocal avec une solution de récupération et placez-le dans un bain d’eau bouillante préchauffé. Après ébullition pendant 20 min, retirez le bocal du bain d’eau et laissez-le refroidir à température ambiante. Le processus de refroidissement dure environ 10 min. Retirez les lames et rincez-les délicatement une fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).</li>
	<li>Dessinez un cercle avec un stylo marqueur autour du tissu et préparez une boîte humide pour les procédures suivantes.</li>
</ol>4. le blocage
<ol><li>Faire des dilutions de travail en mélangeant 3 mL de 30% H2O2 avec 27 ml d’eau roupurifiée.</li>
	<li>Ajouter deux ou trois gouttes de 3% H2O2 solution goutte sur le tissu pour bloquer les peroxydates. Ajoutez rapidement la solution H2O2 pour vous assurer que la solution ne déborde pas du cercle. Effectuer le blocage des peroxydates dans un incubateur de 37 ° c pendant 20 min.</li>
	<li>Rincez doucement les lames avec du PBS (trois lavages, 5 min chacun).</li>
	<li>Bloquer les lames pendant 20 min à 37 ° c avec 5% d’albumine sérique bovine (BSA, préparée en mélangeant 1,5 g de poudre de BSA avec 30 mL d’eau purifiée au RO). Remarque: le blocage avec 3% H2O2 peut empêcher 95% de coloration non spécifique et le blocage avec 5% de BSA peut empêcher les autres 5% de coloration non spécifique. Combinez les deux méthodes pour obtenir un résultat fiable.</li>
</ol>5. réaction antigène-anticorps
<ol><li>Retirer le 5% BSA et ajouter 50 μL d’anticorps primaires (calrétinine, 2, 8 ou PGP 9.5) à la diapositive. Incuber pendant la nuit à 4 ° c.</li>
	<li>Lavez la glissière avec du PBS (trois fois, 3 min chacune).</li>
	<li>Ajouter 50 μL d’exhausteur de polymère (réactif A; voir tableau des matériaux) dans la section et incuber pendant 20 min dans un incubateur à 37 ° c. Ensuite, lavez la glissière avec du PBS (trois fois, 3 min chacune).</li>
	<li>Ajouter 50 μL d’anticorps secondaire B (anticorps secondaire IgG de chèvre anti-lapin/souris) à la section et incuber pendant 30 min dans un incubateur à 37 ° c. Lavez la section avec du PBS (trois fois, 5 min chacune).</li>
</ol>6.3, 3-diaminobenzidine et coloration de l’hématoxyline
<ol><li>Ajouter 850 μL d’eau purifiée dans un tube de 1,5 mL et ajouter les réactifs de coloration (voir tableau des matériaux) dans l’ordre a, B et C. Ajouter 50 μl de chaque réactif pour obtenir un total de 1 ml de solution de travail à la 3,3-diaminobenzidine (DAB). S’il y a des précipités, utilisez la solution après filtration.</li>
	<li>Ajouter une goutte de solution de travail DAB à la section tissulaire et colorer pendant 3-10 min. Incuber les lames en DAB à température ambiante jusqu’à ce que la coloration brune soit détectée. Surveillez avec précaution à l’aide d’un microscope fond clair. Éloignez la solution de travail DAB de la lumière. Ensuite, lavez la lame avec du PBS pendant 5 min.</li>
	<li>Ajouter une goutte d’hématoxyline pour contrer la coloration des noyaux pendant environ 1 min. Ensuite, tenez le bocal de Coplin et lavez-le sous un filet d’eau pendant environ 30-40 s jusqu’à ce que l’excès de colorant soit enlevé. Veillez à ne pas endommager les sections tissulaires.</li>
	<li>Immerger les lames RSB dans un bocal de Coplin contenant du PBS pour 25-30 s. Ensuite, différencier dans 1% d’acide chlorhydrique-éthanol pendant 10 s. laver les lames avec du PBS pendant 1 min.</li>
	<li>Déshydrater les lames dans l’ordre inverse de l’hydratation: 75%, 80%, 95% et l’éthanol absolu (5 min chacun).</li>
	<li>Exposer les lames au xylène (2 changements, 5 min chacun).</li>
	<li>Montez la lamelle en utilisant un montage ultraclean. Laissez les lames sécher avant la visualisation à l’aide d’un microscope.</li>
</ol>

<ol><li>Tam, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirschsprung%27s+disease%3A+A+bridge+for+science+and+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Hirschsprung's disease: A bridge for science and surgery.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 18-22 (2016).</li>
<li>Heanue, T. A., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+nervous+system+development+and+Hirschsprung%27s+disease%3A+advances+in+genetic+and+stem+cell+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enteric nervous system development and Hirschsprung's disease: advances in genetic and stem cell studies.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 466-479 (2007).</li>
<li>Setiadi, J. A., Dwihantoro, A., Iskandar, K., Heriyanto, D. S., Gunadi, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+the+hematoxylin+and+eosin+staining+in+patients+with+suspected+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Surgery%22%5BJournal%5D)">The utility of the hematoxylin and eosin staining in patients with suspected Hirschsprung disease.</a> BMC Surgery. 17 (1), 71(2017).</li>
<li>Agrawal, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholinesterase+histochemistry+%28AChE%29+-+A+helpful+technique+in+the+diagnosis+and+in+aiding+the+operative+procedures+of+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Acetylcholinesterase histochemistry (AChE) - A helpful technique in the diagnosis and in aiding the operative procedures of Hirschsprung disease.</a> Diagnostic Pathology. 10 (1), 208(2015).</li>
<li>Kacar, A., Arikok, A. T., Azili, M. N., Ekberli Agirbas, G., Tiryaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calretinin+immunohistochemistry+in+Hirschsprung%27s+disease%3A+An+adjunct+to+formalin-based+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Turkish+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Calretinin immunohistochemistry in Hirschsprung's disease: An adjunct to formalin-based diagnosis.</a> The Turkish Journal of Gastroenterology. 23 (3), 226-233 (2012).</li>
<li>Bachmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+panel+for+the+diagnosis+of+Hirschsprung%27s+disease+using+antibodies+to+MAP2%2C+calretinin%2C+GLUT1+and+S100%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100.</a> Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).</li>
<li>Jiang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100+and+protein+gene+product+9.5+immunostaining+of+rectal+suction+biopsies+in+the+diagnosis+of+Hirschsprung%27+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">S100 and protein gene product 9.5 immunostaining of rectal suction biopsies in the diagnosis of Hirschsprung' disease.</a> American Journal of Translational Research. 8 (7), 3159(2016).</li>
<li>Takawira, C., D'Agostini, S., Shenouda, S., Persad, R., Sergi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+procedures+update+on+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Gastroenterology+%26+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Laboratory procedures update on Hirschsprung disease.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition. 60 (5), 598(2015).</li>
<li>Meier-Ruge, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholinesterase+activity+in+suction+biopsies+of+the+rectum+in+the+diagnosis+of+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Acetylcholinesterase activity in suction biopsies of the rectum in the diagnosis of Hirschsprung's disease.</a> Journal of Pediatric Surgery. 7 (1), 11-17 (1972).</li>
<li>Barshack, I., Fridman, E., Goldberg, I., Chowers, Y., Kopolovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+loss+of+calretinin+expression+indicates+aganglionosis+in+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">The loss of calretinin expression indicates aganglionosis in Hirschsprung's disease.</a> Journal of Clinical Pathology. 57 (7), 712-716 (2004).</li>
<li>Kapur, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+We+Stop+Looking%3F+Immunohistochemistry+and+the+Diagnosis+of+Hirschsprung+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Can We Stop Looking? Immunohistochemistry and the Diagnosis of Hirschsprung Disease.</a> American Journal of Clinical Pathology. 126 (1), 9-12 (2006).</li>
<li>Guinardsamuel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calretinin+immunohistochemistry%3A+a+simple+and+efficient+tool+to+diagnose+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">Calretinin immunohistochemistry: a simple and efficient tool to diagnose Hirschsprung disease.</a> Modern Pathology. 22 (10), 1379-1384 (2009).</li>
<li>Robey, S. S., Kuhajda, F. P., Yardley, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoperoxidase+stains+of+ganglion+cells+and+abnormal+mucosal+nerve+proliferations+in+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunoperoxidase stains of ganglion cells and abnormal mucosal nerve proliferations in Hirschsprung's disease.</a> Human Pathology. 19 (4), 432-437 (1988).</li>
<li>Monforte-Muñoz, H., Gonzalez-Gomez, I., Rowland, J. M., Landing, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+submucosal+nerve+trunk+caliber+in+aganglionosis%3A+a+%26%2334%3Bpositive%26%2334%3B+and+objective+finding+in+suction+biopsies+and+segmental+resections+in+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Increased submucosal nerve trunk caliber in aganglionosis: a &#34;positive&#34; and objective finding in suction biopsies and segmental resections in Hirschsprung's disease.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 122 (8), 721-725 (1998).</li>
<li>Bachmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+panel+for+the+diagnosis+of+Hirschsprung%27s+disease+using+antibodies+to+MAP2%2C+calretinin%2C+GLUT1+and+S100%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100.</a> Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).</li>
<li>Sams, V. R., Bobrow, L. G., Happerfield, L., Keeling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+PGP9.5+in+the+diagnosis+of+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of PGP9.5 in the diagnosis of Hirschsprung's disease.</a> Journal of Pathology. 168 (1), 55(1992).</li>
<li>Huang, Y., Anupama, B., Zheng, S., Xiao, X., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+enteric+nerve+markers+and+nerve+innervation+in+total+colonic+aganglionosis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Surgical+Pathology%22%5BJournal%5D)">The expression of enteric nerve markers and nerve innervation in total colonic aganglionosis.</a> International Journal of Surgical Pathology. 19 (3), 303(2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous avons décrit ici une procédure utilisant trois anticorps immunohistochimiques différents pour colorer les sections RBS pour le diagnostic de la MH. La sensibilité de notre protocole diagnostique était de 96,49% (95% IC, 0,88-0,99), et la spécificité était de 100% (95% IC, 0,97-1,00).
Les étapes les plus critiques du protocole sont le RSB et la réaction antigène-anticorps. La taille de la biopsie détermine la précision de la coloration. Une petite biopsie ne fournira pas assez de tissu pou...

La maladie de hirschspiral (MH) est une affection intestinale congénitale commune caractérisée par un manque de cellules ganglionnaires dans différents segments du tractus intestinal distal1. Le système nerveux entérique humain est formé lorsque l’invasion des cellules neuronales embryonnaires est achevée. S’il y a une perturbation du processus et que l’invasion ne parvient pas à se terminer, l’intestin distal du nouveau-né devient aganglionique2. Cette condition potentiellement fatale est appelée la maladie de Hirschspiral. La prolifération, la motilité et la croissance intestinale sont les trois composantes principales de la colonisation réussie.
La coloration traditionnelle de l’hématoxyline et de l’éosine (H & E) d’une biopsie submuqueuse limitée ne peut pas atteindre un résultat aussi satisfaisant que la coloration H & E d’un tissu d’épaisseur totale obtenu par chirurgie. En outre, la coloration de l’acétylcholinestérase (AChE) du tissu d’aspiration rectal est théoriquement difficile en raison de sa sensibilité inadéquate, qui est de 91%, et le traitement complexe des sections3,4congelées. Plusieurs autres marqueurs immunohistochimiques des cellules ganglionnaires et des fibres nerveuses qui peuvent être souillés dans des spécimens fixes et paraffines sont progressivement devenus les principaux diagnostics HD. La calrétinine est une protéine liant le calcium dépendante de la vitamine D qui n’est pas exprimée dans le plexus myentérique et sous-muqueuse des segments atteints de MH5. La protéine est exprimée dans les cellules dérivées de la crête neurale, comme les fibres nerveuses et les cellules gliales, qui présentent souvent une hypertrophie neuronale dans le tissu sous-muqueuse des segments atteints de MH6. Le produit du gène protéique 9,5 (PGP 9.5) colore de manière fiable les fibres nerveuses et les cellules ganglionnaires; La coloration PGP 9.5 agit comme un complément à la coloration de la calrétinine, en particulier dans les cas d’hypogangliose isolée. Une double coloration avec les résultats de 2, 9 et 9 peut diminuer le taux de faux-négatif et augmenter la sensibilité. Comme condition préalable, l’étude actuelle vise à assurer une spécificité et une sensibilité suffisantes de cette nouvelle méthode diagnostique. Notre protocole de roman a utilisé les trois marqueurs pour la discrimination de l’intestin aganglionique et des fibres nerveuses hypertrophiques. Une étude prospective de 318 enfants a été réalisée par notre laboratoire et publiée antérieurement sans protocole détaillé7. Le protocole détaillé et les précautions sont discutés dans cet article. Tous les nouveau-nés qui ont souffert d’un problème de défécation sévère depuis la naissance ou les enfants souffrant de constipation chronique excluant d’autres maladies courantes sont des candidats potentiels pour la biopsie d’aspiration rectale (RSB). Notre protocole novateur est adapté pour la coloration non seulement des RSBs mais aussi des biopsies d’épaisseur complète ou des spécimens chirurgicaux pour faire un diagnostic final.

<table><tbody><tr><td>anticorps anti-calrétinine</td><td>MXB Biotechnologies</td><td>MAB-0716 170416405c</td><td>anticorps : anticorps primaire</td></tr><tr><td>Anticorps S-100 Anticorps</td><td>MXB Biotechnologies</td><td>Kit-0007</td><td>Anticorps : anticorps primaire</td></tr><tr><td>Anticorps PGP9.5 Anticorps Shanghai</td><td>Long Island Antibody Co. Ltd</td><td>R-0457-03</td> Anticorps : réactif d’amplification <td>d’anticorps primaire</td></tr><tr><td></td><td>MXB Biotechnologies</td><td>KIT-9902-A 170416405a</td><td>anticorps : anticorps secondaire A</td></tr><tr><td>Chèvre anti-IgG Lapin/Souris Anticorps secondaire</td><td>MXB Biotechnologies</td><td>KIT-9902-B</td><td>Anticorps : anticorps secondaire B</td></tr><tr><td>Kit de coloration DAB (contenant les réactifs A, B et C)</td><td>MXB Biotechnologies</td> Kit <td>de coloration</td><td>DAB-0031</td></tr><tr><td>Incubateur de chaleur</td><td>Shanghai yiheng instrument Co. Ltd</td><td>DHP-9082</td><td>instrument</td></tr><tr><td>Rbi2 aspiration biopsie rectale système</td><td>Aus Systems Pty Ltd, Australie-Méridionale, Australie</td><td>CP1200 HP1000 SS1000</td><td></td></tr><tr><td>instrument Microtome</td><td>Leica</td><td>Leica RM2016</td><td>instrument</td></tr><tr><td>acide citrique citrate de sodium tampon (100X)</td><td>MXB Biotechnologies</td><td>MVS-0101</td><td>tampon de récupération d’antigène</td></tr><tr><td>déshydrateur de tissu pathologique</td><td>wuhan junjie electronic Co. Ltd</td><td>JT-12F</td><td>instrument</td></tr></tbody></table>

diagnostic de la maladie de hirschspiral par immunostaining des biopsies d’aspiration rectale pour la calrétinine, le gène protéine et le produit de protéine 9,5

Diagnosis of Hirschsprung's Disease by Immunostaining Rectal Suction Biopsies for Calretinin, S100 Protein and Protein Gene Product 9.5

La maladie de hirschspiral (MH) est une maladie intestinale congénitale qui est cliniquement manifestée comme une incapacité à passer le méconium chez les nourrissons ou en tant que constipation à long terme chez les enfants. La biopsie d’aspiration rectale (RSB) pour déterminer l’absence de cellules ganglionnaires et l’hypertrophie neuronale est le test le plus précis pour le diagnostic de la MH à l’heure actuelle. La coloration traditionnelle de l’hématoxyline-éosine manque de sensibilité et de spécificité. La coloration de l’acétylcholinestérase ne peut pas être largement utilisée en raison de son processus complexe. Notre protocole novateur d’immunocoloration pour la calrétinine, la protéine et le produit du gène protéine 9,5 (PGP 9.5), que nous avons réalisé sur les rsbs, présente des taux de sensibilité et de spécificité élevés de 96,49% (intervalle de confiance de 95%, 0,88-0,99) et 100% (confiance de 95% de l’intervalle, 0,97-1,00), respectivement. Les segments touchés par la MH sont souvent présents comme l’absence de l’expression de la calrétinine, de la protéine et du PGP 9.5, qui sont des marqueurs de l’hypertrophie neurale dans le tissu sous-muqueuse. Ce protocole décrit le processus d’exploitation détaillé de cette nouvelle méthode de diagnostic.

Au total, 318 patients ont été inscrits à notre étude. Tous les patients ont subi une RSB, et les tissus ont été colorés pour la calrétinine, le c-9 et le PGP 9.5. Le diagnostic basé sur notre protocole de roman a été HD dans 97 cas, non-HD dans 213 cas, et soupçonné de la MH dans 8 cas. Parmi les 132 patients chirurgicaux, 99 patients ont été diagnostiqués avec la MH en immunostant des spécimens de pleine épaisseur après la chirurgie. La coloration de la protéine et du PGP 9.5 a montré q...

Ce protocole décrit le processus d’immunocoloration des biopsies d’aspiration rectale pour la calrétinine, la protéine de 9,5 et le produit du gène protéique. Cette nouvelle méthode de diagnostic adjuvant pour la maladie de Hirschspiral a des taux de sensibilité et de spécificité préférables.

Diagnostic de la maladie de Hirschspiral par immunostaining des biopsies d’aspiration rectale pour la Calrétinine, le gène protéine et le produit de protéine 9,5

Hirschsprung&#39;s disease (HD) is a congenital intestinal disease that is clinically manifested as an inability to pass meconium in infants or as ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions dans le diagnostic de Hirschsprung' la maladie de s. La méthode et les fonctions de cette technique, si vous suivez le protocole, montre une sensibilité élevée et les taux de spécificité qui se suivent en même temps. Mijing Fang, technicien de mon laboratoire, démontrera la procédure.Commencez par fixer les biopsies d’aspiration rectale en cinq fois le volume du tissu en paraformaldéhyde de 4% pendant six heures à température ambiante. Déshydratez les tissus fixes dans un déshydrateur pathologique de tissu pendant 11 heures et intégriez les tissus rectals traités de biopsie d’aspiration dans des blocs de paraffine. Coupez les blocs sur une microtome jusqu’à ce qu’un plan de section complet du tissu soit exposé.Ensuite, utilisez le microtome pour obtenir une section de 0,4 micromètre du tissu incorporé. Placez-le dans de l’eau de 45 à 50 degrés Celsius pour permettre aux sections de s’étendre dans un plan plat. Transférer les sections aplaties sur des glissières en verre et les cuire au four à 60 degrés Celsius pendant trois à cinq heures.Placez les glissières déparaffinées en deux changements de xylène de 15 minutes suivis de leur hydratation dans des immersions séquentielles de cinq minutes à l’éthanol. Rincez ensuite les glissières à l’eau purifiée par osmose inverse pendant cinq minutes supplémentaires. Pour la récupération des antigènes, placez les glissières dans un bocal de récupération Coplin et placez le bocal dans un bain préchauffé d’eau bouillante.Après 20 minutes, laisser refroidir le bocal à température ambiante pendant environ 10 minutes et rincer délicatement les toboggans avec du PBS. Ensuite, utilisez un marqueur hydrophobe pour encercler chaque section tissulaire et placer les glissières dans une boîte humide. Pour bloquer les peroxydates, ajoutez deux ou trois gouttes de solution de peroxyde d’hydrogène à 3 % sur chaque tissu et placez les glissières à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes.À la fin de l’incubation, rincer les toboggans à l’aide de trois lavages PBS de cinq minutes suivis d’un blocage avec de l’albumine sérique bovine à 5 % pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, jetez l’excès d’albumine de sérum bovin et étiquetez les cellules avec 50 microlitres de l’anticorps primaire d’intérêt à 4 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, rincez les glissières avec trois lavages de trois minutes en PBS et ajoutez 50 microlitres d’exhausteur de polymère à chaque diapositive.Après 20 minutes à 37 degrés Celsius, lavez les glissières trois fois en PBS et ajoutez 50 microlitres d’anticorps secondaires B à chaque section tissulaire. Après 30 minutes à 37 degrés Celsius, rincer les sections avec trois lavages de cinq minutes en PBS et ajouter une goutte de solution de travail DAB fraîchement préparée à chaque diapositive. Lorsque le niveau approprié de coloration brune est détecté par microscopie légère, rincez les glissières dans PBS pendant cinq minutes et ténuez les noyaux avec une goutte d’hématoxyline pendant une minute.Retirer l’excès de tache sous un filet d’eau pendant environ 30 à 40 secondes, suivi d’un lavage de 25 à 30 secondes dans du PBS frais. Différencier les tissus en 1 % d’éthanol acide chlorhydrique pendant 10 secondes, suivi d’un lavage PBS d’une minute. Déshydratez les diapositives avec des immersions de cinq minutes dans l’ordre inverse de l’hydratation et exposez les diapositives à deux changements de xylène de cinq minutes.Montez ensuite le bordereau de couverture à l’aide d’un montage ultra-propre et laissez sécher les glissières avant leur visualisation au microscope léger. Dans cette étude représentative de 318 patients rectal de biopsie de section, 99 patients ont été au commencement diagnostiqués par biopsie rectale de section. Beaucoup de cellules de ganglion qui expriment la calretinine ont été observées dans les biopsies normales de tissu.Cependant, aucune cellule ganglionnaire n’a été détectée dans n’importe quelle zone du tissu des segments de la maladie de Hirschsprung. L’immunostaining de S-100 et de PGP9.5 a indiqué les troncs hypertrophiés de nerf dans le submucosa du tissu maladie avec seulement la coloration granulaire de quelques petites brindilles nerveuses observées dans l’intestin normalement innervé. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de prêter attention aux détails comme la taille des biopsies d’aspiration rectale et l’épaisseur des sections.Après sa défragmentation, cette technique ouvrira la voie à des recherches dans le domaine de la chirurgie pédiatrique pour soutenir un diagnostic de hirschsprung' la maladie de s.

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Diagnostic de la maladie de Hirschspiral par immunostaining des biopsies d’aspiration rectale pour la Calrétinine, le gène protéine et le produit de protéine 9,5 (Vidéo) | JoVE Journal

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