Isolement des cellules souches mésenchymateuses du tissu de pulpe et co-culture avec les cellules cancéreuses afin d’étudier leurs Interactions

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des cellules souches sur le rôle des cellules souches adultes dans la régulation du comportement des cellules cancéreuses. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’évaluation in vitro des interactions des cellules cancéreuses et des cellules souches sans l’utilisation d’organismes vivants. Cette technique a un potentiel de métastase du cancer car elle modèle le rôle de promotion des cellules souches adultes dans les métastases cancéreuses aux tissus durs tels que les os.

La démonstration de la procédure sera effectuée par Huseyin Apdik, postdoctoral dans mon laboratoire. Commencez par utiliser des forceps d’extraction stériles pour enlever le tissu pulpeux du centre des dents de sagesse obtenues auprès de jeunes adultes âgés de 17 à 20 ans. Placez le tissu dans le DMEM complet froid dans des plats de culture tissulaire de 10 centimètres et utilisez un scalpel pour hacher les échantillons en fragments de deux à trois millimètres.

Transférer les morceaux de chaque plat dans des puits individuels d’une culture tissulaire traitée à six puits et couvrir les tissus de chaque puits avec 200 microlitres de DMEM complet. Permettre aux tissus de s’attacher au fond du puits avec une incubation d’au moins deux heures dans un incubateur de culture cellulaire humidifié de 37 degrés Celsius et de 5 % de CO2. À la fin de l’incubation, nourrir les tissus avec deux à 2,5 millilitres de milieu frais complet et la culture des cellules pendant huit à neuf jours supplémentaires.

Lorsque la culture a atteint 80%confluency, laver chaque puits avec deux millilitres de PBS suivie d’un détachement des cellules avec deux millilitres de trypsine à 37 degrés Celsius. Après deux minutes, arrêter la réaction avec deux millilitres de DMEM complet par puits et de recueillir les cellules par centrifugation. Ensuite, resuspendez les granulés en 15 millilitres de milieu complet frais par deux puits de cellules et traversez les cellules dans des flacons T75 pour leur culture ultérieure.

Après au moins huit passages, visualisez les cellules par microscopie légère. Les cellules souches de pulpe dentaire devraient s’être attachées aux plats de culture et devraient afficher une morphologie cellulaire en forme de fuseau. Pour l’analyse des marqueurs de surface, après la démonstration de la trypsinisation, fixer les cellules avec 4% de paraformaldéhyde pendant 20 minutes à température ambiante dans des tubes de 1,5 millilitre suivis de trois lavages dans 500 microlitres de PBS par lavage.

Après le dernier lavage, étiquetez les cellules avec les anticorps appropriés d’intérêt dans 100 microlitres de PBS par tube pendant une heure à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, laver les cellules trois fois dans PBS comme démontré et étiqueter les cellules avec les anticorps secondaires appropriés dans 100 microlitres de PBS par tube pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez les échantillons trois fois dans PBS et analyser les cellules par cytométrie d’écoulement selon les protocoles standard.

Pour la différenciation des cellules souches de pulpe dentaire, les graines une fois 10 aux quatre cellules en puits individuels de plaques de 24 puits dans 500 microlitres de DMEM complet pour une incubation de 24 heures dans l’incubateur de culture cellulaire. Le lendemain, remplacez le milieu de chaque puits par le milieu de différenciation approprié et retournez les cellules à l’incubateur, en rafraichissant le milieu deux fois par semaine pendant deux semaines. La différenciation peut être confirmée par von Kossa et la coloration bleue alcienne selon les protocoles standard.

Après deux à quatre passages, recueillir les supernatants moyens conditionnés à partir des cellules souches de pulpe dentaire cultivés lorsque les cultures atteignent 80% confluent. Ensuite, centrifugez le milieu collecté pour enlever les déchets tissulaires et les débris cellulaires et stocker le milieu à 20 degrés Celsius négatifs jusqu’à utilisation. Pour le traitement des cellules cancéreuses, semer une fois 10 aux cinq cellules tumorales dans les puits individuels d’une plaque de 12 puits pour l’incubation pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5% de CO2.

Le lendemain matin, utilisez une pointe stérile de 200 microlitres pour faire une blessure à l’égratignure dans chaque puits et remplacez immédiatement le supernatant dans chaque puits par un milieu frais contenant diverses concentrations de milieu conditionné. Ensuite, observez immédiatement les rayures au microscope inversé et obtenez des images des cultures blessées à intervalles réguliers. À la fin de l’analyse, mesurez la fermeture des rayures au fil du temps dans ImageJ.

Pour évaluer la migration des cellules souches de pulpe dentaire, première graine trois fois 10 vers les quatre cellules souches de pulpe dentaire sur des inserts individuels de plaques de 24 puits avec 0,4 micron pores dans 250 microlitres de DMEM et incuber les inserts pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Ensuite, graine cinq fois 10 les quatre cellules tumorales dans les puits individuels d’une plaque de 24 puits dans 500 microlitres de DMEM pour l’incubation pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain matin, grattez les cellules tumorales comme démontré.

Remplacez les supernatants par 500 microlitres de DMEM frais et placez un insert ensemencé de cellules souches de pulpe dentaire dans chaque bien nourri avec un milieu frais. Observez immédiatement les cellules sur un microscope inversé et imagez les cellules à intervalles réguliers pour évaluer la migration des cellules souches de pulpe dentaire. Pour évaluer les interactions directes des cellules souches de pulpe dentaire avec les cellules cancéreuses, trypsinize chaque culture étiquetée pour obtenir des suspensions unicellules et de recueillir les cellules dissociées par centrifugation.

Resuspendez les granulés dans des solutions distinctes de colorant de liaison cellulaire préparées dans le tampon Diluant C, fournies selon les instructions du fabricant, et incuber les cellules sont à température ambiante pendant 10 minutes. Mettre fin à la réaction de coloration avec 100 microlitres de sérum bovin fœtal et recueillir les cellules par centrifugation. Puis centrifuger les cellules avec un milieu de croissance complet avant de placage cinq fois 10 pour les quatre cellules souches de pulpe dentaire et les cellules tumorales par puits dans une plaque de six puits à un rapport un à un dans deux millilitres de milieu complet.

Recueillir les cellules après 24 ou 48 heures d’incubation par centrifugation suivie d’un lavage en PBS. Ensuite, resuspendez les cellules en 300 microlitres de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence dans des tubes de cytométrie et du vortex à fond rond de cinq millilitres pour disperser les agrégats cellulaires avant d’analyser les cellules selon les protocoles standard d’analyse cytométrique du flux. Les cellules souches dentaires de pulpe présentent une morphologie fibroblaste-comme de cellules après placage et expriment les antigènes mésenchymaux de surface de cellules souches mais pas les marqueurs hématopoïétiques de cellules.

Des changements au niveau morphologique et moléculaire liés à la différenciation ostéo, chondro, et adipogenic sont également observés dans les cultures dentaires de cellules souches de pulpe suivant l’application appropriée de cocktail de différentiation. Le traitement des cultures de cellules tumorales rayées avec des concentrations de 10 et 20% de milieu conditionné augmente la fermeture d’égratignure de manière significative comparée aux cultures de cellules tumorales à traitement moyen-moyen. Les molécules sécrétées des co-cultures d’insertion de cellules souches de pulpe dentaire ont également augmenté la fermeture d’éraflure dans les cellules de tumeur blessées comparées aux co-cultures de cellules de contrôle.

L’analyse au microscope de fluorescence des interactions de la tige dentaire de pulpe et de la cellule de tumeur dans une culture in vitro de cellules indique la création d’une structure bien organisée dans laquelle les cellules de tumeur prolifèrent rapidement après 48 heures. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de garder deux échantillons de tissus dans le milieu froid et de transporter immédiatement des échantillons au laboratoire pour minimiser la mort cellulaire. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans les domaines des cellules souches dans l’exploration des interactions adultes contre le cancer des cellules souches chez l’homme.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes comme le traçage des cellules immunitaires pour les cellules étiquetées différentielles de divers types de cellules souches et de cancer peuvent être effectuées pour répondre à une question supplémentaire sur la façon dont les cellules souches adultes interagissent avec les cellules cancéreuses et contrôlent la métastase du cancer. N’oubliez pas que travailler avec les échantillons humains peut être dangereux et que des précautions telles que l’analyse des échantillons de patients pour les maladies infectieuses et l’obtention du consentement écrit du patient devraient toujours être mises en œuvre lors de l’exécution de cette procédure.