Détection d’endotoxines dans les Nano-formulations utilisant la Limulus Amébocytes Lysate (LAL)
30 janvier 2019
Détection d’endotoxines dans les nanomatériaux représente un des grands défis dans le domaine de la nanomédecine. Nous présentons ici une étude de cas décrivant le cadre composé de trois formats différents de LAL pour évaluer la contamination potentielle d’endotoxines dans les nanoparticules.
Cette méthode peut aider à répondre dans le domaine médical sur la sécurité des nanomédicinaux. Les avantages de cette technique est qu’il est standard, et est utilisé dans le monde entier pour l’évaluation des produits, Aux nanomédicinaux. Démonstration de la procédure, sera Barry Neun, au Laboratoire de caractérisation nano technologie.
Pour une préparation standard d’étalonnage, utilisez 900 microlitres de lysate d’amebocyte limulus ou d’eau de qualité LAL. Et 100 microlitres d’endotoxine standard de contrôle, pour préparer autant de dilutions intermédiaires que nécessaire, pour permettre la préparation d’une norme d’étalonnage avec une concentration d’une unité d’endotoxine par millilitre. Ensuite, à l’aide de 900 microlitres d’eau de qualité LAL, et 100 microlitres de l’unité d’endotoxine par millilitre étalonnage standard, préparer une deuxième norme d’étalonnage, à une concentration de 0,1 unité d’endotoxine par millilitre.
Répétez ensuite la dilution décuplée en série pour préparer deux normes d’étalonnage inférieures. Pour obtenir un total de quatre normes d’étalonnage, allant de 0001 à une unité d’endotoxine par millilitre. Pour préparer un contrôle de qualité de 05 endotoxines par millilitre, combine 50 microlitres de l’unité d’endotoxine par millilitre de solution d’endotoxine standard de contrôle, avec 950 microlitres d’eau de qualité LAL.
Ensuite, dans le logiciel sélectionnez les paramètres de l’instrument, et de créer le modèle. Sélectionnez collecter des données et entrez l’ID de test et le groupe de données dans l’onglet général. Sous l’onglet matériel, sélectionnez le type d’instrument et la méthode LAL, et vérifiez qu’un numéro de série, l’ID du système et les informations du port de série apparaissent à l’écran.
Cliquez bien deux fois pour confirmer la sélection des instruments, et la communication avec l’instrument, et entrez l’iD de l’échantillon dans le même ordre que les échantillons seront testés. Utilisez ensuite les boutons par défaut pour entrer dans la courbe standard de contrôle négatif et testez des échantillons. Ajoutez le volume approprié de normes d’étalonnage de contrôle négatif et de contrôle de la qualité dans des tubes en verre préétiquetés en double.
Et ajouter le volume approprié de LAL au premier test vile. Vortex le vil brièvement, et placez le flacon dans les fentes de test appropriées dans le carrousel d’instrument. Avant de charger les échantillons, effectuer plusieurs dilutions du matériau nano d’essai dans la dilution maximale valide comme démontré.
Pour préparer une unité d’endotoxine de 05 par millilitre de contrôle d’amélioration de l’inhibition, combinez 25 microlitres de l’unité d’endotoxine par millilitre de solution d’endotoxine standard de contrôle, avec 475 microlitres du matériau nanométrique d’essai à une dilution donnée. Après le vortex, chargez les contrôles appropriés d’amélioration de l’innovation et les échantillons d’étude non prélevés dans l’instrument. Puis aliquot décombre et les nanomatériaux à pointes à une dilution spécifique dans les tubes pré-étiquetés.
Avant le vortex, et le chargement dans le carrousel d’instrument. Pour effectuer un Gel-Clot LAL, préparer l’endotoxine standard de contrôle à une concentration finale de quatre lambda, et combiner 100 microlitres de norme, avec 100 microlitres d’eau, ou échantillon d’essai pour atteindre une concentration finale d’endotoxine standard de contrôle deux lambda. Ajouter 100 microlitres de Lysine à chaque dilution lambda.
Vortex les tubes brièvement, et placer la grille de tubes dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant une heure. À la fin de l’incubation, inverser les tubes avec un mouvement lisse, et enregistrer manuellement les résultats en utilisant plus pour un caillot ferme, et moins pour aucun caillot, ou un caillot lâche. Dans cette analyse représentative, la doxorubicine liposomale PEGylated a interféré avec le LAL chromogenic à la dilution cinq, cependant cette interférence a été surmontée aux dilutions plus élevées.
La récupération de pointe était entre 50 et 200%quand la formulation a été examinée aux dilutions 50 et 500 dans la turbidité et le LAL chromogenic, aussi bien qu’à la dilution cinq, dans la turbidité LAL. Une fois ajustés par le facteur de dilution, les résultats étaient cohérents entre les illusions dans les deux essais. En outre, les résultats étaient cohérents entre les trois formats d’essai.
Rappelez-vous que chaque échantillon a sa propre gamme de dilutions, chaque format LAL utilise sa norme de contrôle dans la doxine et le lysate, et que les tubes utilisés pour préparer les dilutions, et d’effectuer une réaction à différents pour chaque essai LAL. Pour cette procédure, d’autres méthodes comme peut être effectuée pour répondre à des questions supplémentaires sur le matériel Après son développement, cette technique a ouvert la voie pour les sutures et le domaine de la nanomédia, d’explorer les applications médicales de la nano-technologie formulé des médicaments chez l’homme, et des modèles cliniques, y compris, mais pas limité aux primates non humains, lapins, chiens et rats. N’oubliez pas que le travail avec la doxine peut être extrêmement dangereux et les précautions telles que le port d’équipement de protection individuelle, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
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Aperçu
Cette étude aborde le défi de la détection des endotoxines dans les nanomatériaux conçus, une question cruciale en nanomédecine. Elle présente un cadre utilisant trois formats différents du test LAL afin d'évaluer une éventuelle contamination par des endotoxines dans les nanoparticules.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Nanomédecine
- Détection des endotoxines
- Évaluation de la sécurité des nanoparticules
Contexte
- Les endotoxines peuvent présenter des risques importants dans les applications médicales des nanomatériaux.
- Les méthodes normalisées de détection des endotoxines sont essentielles pour garantir la sécurité des nanomédicaments.
- Le lysat d'amébocytes de Limulus (LAL) est un réactif largement utilisé pour les tests de détection des endotoxines.
- La compréhension des niveaux de contamination des nanoparticules est essentielle pour le respect des exigences réglementaires.
Objectif de l'étude
- Développer un cadre fiable pour estimer la contamination par les endotoxines dans les nanomatériaux conçus.
- Montrer l'application des formats LAL dans l'évaluation de la sécurité des nanoparticules.
- Fournir une méthode normalisée aux chercheurs du domaine.
Méthodes utilisées
- Préparation d'étalons de calibration à l'aide du LAL et de l'endotoxine standard de contrôle.
- Création de dilutions intermédiaires pour atteindre les concentrations souhaitées.
- Démonstration de la procédure par un chercheur qualifié.
- Utilisation d'eau de qualité LAL pour un essai précis.
Résultats principaux
- Le cadre développé permet une estimation efficace des niveaux d'endotoxines dans les nanoparticules.
- Les méthodes normalisées améliorent la fiabilité des évaluations de sécurité.
- La démonstration de la procédure confirme son applicabilité dans des scénarios réels.
- Les résultats indiquent l'importance de tests rigoureux en nanomédecine.
Conclusions
- L'étude propose une approche précieuse pour la détection des endotoxines dans les nanomatériaux.
- Des méthodes d'essai normalisées sont essentielles pour faire progresser la sécurité en nanomédecine.
- Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour affiner ces méthodes et garantir des évaluations de sécurité complètes.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La détection des endotoxines est une étape critique de contrôle qualité dans le développement des nanomédicaments, car les formulations nano peuvent interférer avec les tests standards et compromettre la sécurité du produit. Le test LAL fournit une méthode normalisée et reconnue mondialement pour quantifier la contamination par les endotoxines dans les médicaments à base de nanoparticules, les vaccins et les adjuvants. Un test fiable des endotoxines soutient la conformité réglementaire et réduit les risques lors du passage en préclinique, en identifiant précocement les dangers inflammatoires dans le processus de découverte.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'analyse des profils de sécurité des nanomatériaux en détectant les artefacts inflammatoires induits par les endotoxines, qui pourraient fausser les études de validation ciblée.
- Valeur opérationnelle : Fournit un protocole normalisé permettant de distinguer les effets pharmacologiques réels des faux positifs induits par les endotoxines lors du criblage précoce.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Permet la préparation de systèmes biologiques qualifiés pour des criblages en aval en certifiant des taux faibles d'endotoxines dans les bibliothèques de composés formulés sous forme nano.
- Valeur opérationnelle : Fournit des résultats quantitatifs et reproductibles selon les formats LAL de turbidité, chromogénique et en gel-caillot, permettant la standardisation des tests et la comparabilité entre plates-formes.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Garantit que les systèmes pertinents pour la maladie ne sont pas compromis par une inflammation induite par les endotoxines, préservant ainsi la dé-risquisation mécanistique dans les modèles translationnels.
- Valeur opérationnelle : Facilite les décisions d'avancement ajustées au risque en assurant une quantification cohérente des endotoxines dans les lots de matériels de découverte, précliniques et cliniques.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Le test LAL s'inscrit dans la continuité découverte-préclinique en tant que point de contrôle de sécurité qui suit la synthèse précoce des nanomatériaux et précède l'évaluation biologique dans des modèles de maladies.
- Découverte en biologie : Confirme que l'activité biologique observée dans les tests de validation ciblée n'est pas attribuable à une contamination par des endotoxines, soutenant ainsi la vérification des hypothèses et la clarification des voies impliquées.
- Écrantage : Fournit des mesures normalisées d'endotoxines permettant une évaluation fiable des composés et une sélection pertinente des « hits » dans des bibliothèques formulées à l'échelle nanométrique.
- Analytique : Génère des résultats quantitatifs en unités d'endotoxines par mL à partir de trois formats du test LAL, permettant aux équipes de comparer les niveaux de contamination entre différentes formulations et séries de dilutions.
- Recherche translationnelle : Assure la continuité préclinique en associant l'évaluation de la sécurité des nanomatériaux à la garantie que les échantillons testés respectent les seuils d'endotoxines avant les études in vivo.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une plateforme reproductible de test des endotoxines applicable à l'ensemble des projets de nanomédecine, de vaccins et de développement d'adjuvants.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique en éliminant l'endotoxine comme variable perturbante dans les essais pharmacologiques et immunologiques.
- Valeur opérationnelle : Garantit la standardisation, la reproductibilité et la possibilité de mise à l'échelle de la détection des endotoxines dans divers formats de LAL et types de nanomatériaux.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'orientation (go/no-go) en fournissant des données de sécurité précoces, réduisant ainsi l'échec biologique en phase avancée et l'inefficacité du capital.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation fondée sur les risques des nanoformulations selon leurs profils quantifiés d'endotoxines et leur performance de récupération après ajout.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en principes de dosage des endotoxines, en manipulation des nanomatériaux et en stratégies d'atténuation des interférences.
- Dépend de l'accès à des réactifs LAL, à des instruments étalonnés (par exemple, lecteurs de microplaques, incubateurs) ainsi qu'à de l'eau et du matériel de laboratoire exempts d'endotoxines.
- Implique une standardisation interéquipes des protocoles de dilution, de l'inclusion de contrôles (négatif, positif, d'inhibition/amplification) et de l'interprétation des résultats à travers les formats de turbidité, chromogénique et de gelation.
- Implique des adaptations en fonction des propriétés variées des nanomatériaux (par exemple, charge, taille, chimie de surface) qui peuvent influencer la réactivité du LAL et nécessiter des plages de dilution personnalisées.
- Comprend des limites pratiques telles que les interférences induites par les nanoparticules dans le dosage (amplification ou inhibition), qui doivent être corrigées par une optimisation des dilutions et des contrôles de récupération par ajout connu, comme illustré dans l'étude.
