Mesure simultanée de Calcium intracellulaire et le potentiel de Membrane dans l’endothélium cérébral de souris fraîchement isolées et intacte

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la physiologie vasculaire cérébrale en ce qui concerne la régulation du flux sanguin cérébral pendant le vieillissement et le développement de maladies chroniques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet la mesure simultanée du calcium intracellulaire et du potentiel membranaire de l’endothélium artérielle cérébral dans sa forme indigène dans des conditions physiologiques. Pour isoler le cerveau de la souris, sous le microscope enlever la peau et les cheveux sur le crâne.

Et enlever le sang excessif avec pss froid sans calcium. Ensuite, faire une incision en utilisant uniquement les extrémités des ciseaux de dissection standard. À partir de l’os occipital et s’étendant à travers l’os nasal du crâne.

Ensuite, ouvrez soigneusement son crâne le long de l’incision, à l’aide de forceps à pointe grossière et séparez le tissu conjonctif pour exposer le cerveau. Lavez doucement le cerveau isolé avec un PSS froid sans calcium dans un bécher pour enlever le sang. Placez le côté ventral cérébral vers le haut dans une chambre contenant la solution froide de dissection pour l’isolement des artères cérébrales.

Pour isoler les artères cérébrales, fixez le cerveau isolé dans la solution de dissection froide en insérant deux broches en acier inoxydable à travers elle, dans un revêtement en polymère de silicium infusé au charbon de bois au fond d’une boîte de Pétri en verre. Plus tard, isolez chirurgicalement les artères cérébrales postérieures environ 0,3 à 0,5 segments de centimètre des artères postérieures de communication et basilaires. Utilisez des broches en acier inoxydable pour fixer les deux artères cérébrales postérieures isolées dans la solution de dissection dans la boîte de Petri.

Nettoyez ensuite soigneusement les artères cérébrales postérieures isolées en enlevant soigneusement le tissu conjonctif à l’aide de forceps aiguisés à pointe fine. Couper les artères intactes en segments d’un à deux millimètres pour une digestion enzymatique. Dans cette procédure, préparez l’appareil de trituration à l’aide d’un microscope, d’une caméra et d’une scène en aluminium tenant une chambre et des micromanipulateurs.

Sécurisez une microsy seringue à l’aide d’un contrôleur de pompe adjacent à la scène et au spécimen. Ensuite, remplissez complètement une pipette de titration avec de l’huile minérale et fixez-la au-dessus du piston à microsyringe. Ensuite, en utilisant la microsyringe avec le contrôleur de pompe retirer environ 130 nanolitres de solution de dissociation dans la pipette tout en assurant l’absence de bulles d’air.

Par la suite, placez les segments artériaux intacts dans un millilitre de solution de dissociation avec les concentrations requises d’enzymes dans un tube en verre de 10 millilitres. Incuber à 34 degrés Celsius pendant 10 à 12 minutes pour une digestion partielle. Après la digestion, remplacer la solution enzymatique par cinq millilitres de solution de dissociation fraîche.

À l’aide d’une pipette d’un millilitre, transférer un segment dans la chambre contenant une solution de dissociation à température ambiante. Placez ensuite la pipette dans la solution de dissociation dans la chambre et placez-la près d’une extrémité du récipient digéré. Réglez un taux de l’ordre de deux à cinq nanolitres par seconde sur le contrôleur de pompe pour une trituration douce.

Tout en regardant à travers 100 fois à 200 fois le grossissement retirer et éjecter le segment artélial pour dissocier les cellules musculaires lisses tout en produisant un tube endothélial. Si nécessaire, utilisez soigneusement des forceps à pointe fine pour séparer l’adventitia dissocié et le laminage élastique interne du tube endothélial. Confirmez que toutes les cellules musculaires lisses sont dissociées et que seules les cellules endothéliales restent intactes.

À l’aide de micromanipulateurs, fixer chaque extrémité du tube endothélial sur le glissement de couverture en verre de la chambre de superfusion à l’aide de pipettes d’épinglant en verre borosilicate. Laver l’adventitia dissociée et lisser les cellules musculaires de la chambre. Et remplacer la solution de dissociation par deux molaire plus chlorure de calcium PSS.

Transférez la plate-forme mobile avec tube endothélial sécurisé sur le microscope de la superfusion et de la plate-forme expérimentale. Ensuite, utilisez six réservoirs propres de 50 millilitres pour la livraison continue de PSS et de solutions médicamenteuse respectives pendant l’expérience. Utilisez la vanne de commande d’écoulement en ligne pour régler manuellement le débit aussi uniforme que le débit du lamineur tout en faisant correspondre l’alimentation d’écoulement à l’aspiration sous vide.

Livrer pss à la chambre pour la superfusion du tube endothélial pendant au moins cinq minutes avant d’enregistrer les données de fond et le chargement des colorants. Pour mesurer le potentiel de la membrane simultanément avec la concentration intracellulaire de calcium, tirez une électrode pointue et remplissez-la de deux chlorure de potassium molaire à enregistrer à partir de cellules chargées de colorant fura-2. Pour étudier le couplage intracellulaire par transfert de colorant, remplissez le microélecrode avec 0,1% d’iodure de propidium dissous dans deux chlorure de potassium molaire.

Placez ensuite l’électrode sur un fil d’argent recouvert de chlorure dans le support pipette fixé à un étage de tête d’électromètre fixé à l’aide d’un micromanipulateur. Utilisez le micromanipulateur pour positionner brièvement la pointe de l’électrode dans le PSS qui coule dans la chambre, tout en regardant à travers l’objectif quatre fois. Par la suite, réglez le potentiel de la membrane de repos à zéro comme compatible avec le potentiel de bain à la terre.

Si vous le souhaitez, utilisez des moniteurs de base audibles reliés à des électromètres pour associer la hauteur sonore à des enregistrements potentiels. Par la suite, augmenter le grossissement à 400 fois à l’aide d’un objectif 40 fois et positionner la pointe de l’électrode juste au-dessus de la cellule du tube endothélial. Ajustez la fenêtre photométrique à l’aide du logiciel de photométrie pour vous concentrer sur environ 50 à 80 cellules endothéliales.

Placez ensuite délicatement l’électrode dans l’une des cellules du tube endothélial à l’aide du micromanipulateur et attendez au moins deux minutes que le potentiel de la membrane de repos se stabilise. Une fois que le potentiel de membrane de repos est stable à sa valeur prévue, allumez le tube photomultiplier sur l’interface de fluorescence en l’absence de lumière et commencez l’acquisition de la concentration intracellulaire de calcium par Fura-2 passionnant alternativement à 340 et 380 nanomètres tout en recueillant l’émission de florescence à 510 nanomètres. Une fois que des mesures simultanées du potentiel membranaire et de la concentration intracellulaire de calcium sont établies, prévoyez environ cinq minutes pour la superfusion du tube endothélial avec PSS à un débit laminaire constant avant l’application des drogues.

Appliquez le médicament préparé en PSS à la chambre de superfusion à un débit constant. Pendant le traitement médicamenteux mesurer le potentiel membranaire dans les rapports F340/F380 simultanément. Une fois l’expérience terminée, retirez l’électrode de la cellule.

Ensuite, arrêtez les enregistrements respectifs du potentiel membranaire et de la concentration intracellulaire de calcium et enregistrez les fichiers pour l’analyse des données. Il s’agit d’une image différentielle de contraste d’interférence d’un tube endothélial artéal cérébral de souris, ajusté pour l’expérience dans la fenêtre photométrique utilisant un objectif de 40 fois. Une électrode tranchante est placée dans une cellule, comme le montre le haut de l’image.

Voici les exemples de traces brutes pour la mesure simultanée du rapport F340/F380 et du potentiel membranaire en réponse à 100 micromolaires ATP. Après cette procédure, d’autres méthodes comme la microscopie fluorescente confocale, peuvent être exécutées afin de répondre à des questions additionnées concernant la signalisation microdomain du calcium endothélial, et les espèces réactives d’oxygène, comme exemples. En général, cette technique continuera d’ouvrir la voie à des recherches en physiologie cellulaire pour explorer la fonction vasculaire et le vieillissement dans le sang et la circulation lymphatique.