In Vitro Scratch test pour démontrer les effets de l’Arsenic sur la Migration cellulaire de la peau

La migration cellulaire est un processus critique de cicatrisation des plaies qui peut modifier radicalement le résultat d’une blessure curative. Ce protocole permet aux chercheurs de mieux comprendre l’effet de divers composés sur la migration cellulaire pendant la cicatrisation des plaies. Ce qui peut souvent conduire à des stratégies de traitement ciblées pour la médecine clinique.

L’analyse à gratter est une approche rentable et à haut débit pour générer des données significatives sur la cicatrisation des plaies avant des tests in vivo coûteux et longs. L’analyse à gratter comme méthode est particulièrement pertinente dans les applications de cicatrisation des plaies. Plus précisément, la peau.

Cependant, l’analyse est vraiment un test de migration, et pourrait être appliquée à n’importe quel type de cellule où la migration des cellules est d’intérêt à mesurer ou à capturer. Semblable à la culture classique de cellules et de tissu, procédures d’opération standard, formation, technique, et pratique, pratique, pratique. Ceux-ci sont la clé du succès avec l’analyse scratch.

Nathan Cruz, étudiant à la maîtrise, et Oscar Lujan, chercheur de premier cycle, démontreront la procédure. Pour commencer cette procédure, préparez l’armoire biosécurité II à l’aide d’une solution aqueuse à 70 % d’isopropyle pour effectuer un lingette sanitaire, en commençant par les parois arrière et latérale, et en travaillant jusqu’à la plaque de base. Essuyez également tous les matériaux qui seront utilisés dans l’analyse avant de les placer dans l’armoire.

Ensuite, obtenez des flacons contenant la lignée cellulaire cryopréservée désirée, et placez-en un dans un bain d’eau d’un centimètre de profondeur à 37 degrés Celsius pour décongeler. Ajouter 10 millilitres de milieu complété avec 10%FBS dans un flacon de culture tissulaire T75. Ouvrez le flacon contenant le stock cellulaire et aspirez soigneusement la solution.

Ensuite, transférez les cellules dans le flacon T75. Retirez un millilitre de supports du flacon et transférez-le de nouveau dans le flacon, puis transférez-le dans le flacon pour maximiser le rendement cellulaire du flacon. Serrez le capuchon du flacon et secouez-le doucement pour disperser uniformément les cellules en suspension sur toute la surface.

Après cela, étiquetez le flacon avec les informations affichées ici, et placez-le dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 72 heures. Tout d’abord, récupérer le flacon de culture tissulaire de l’incubateur, et d’observer les cellules adhérentes comme décrit dans le protocole de texte. Aspirez tout le volume de supports du flacon et transférez-le dans un conteneur à déchets.

Ajoutez cinq millilitres de solution de sel équilibrée au flacon et secouez-le doucement pour rincer tout excès de médias, de cellules mortes ou de déchets. Retirez ensuite tout le volume de solution de sel du flacon et jetez-le dans un conteneur à déchets. Ensuite, ajoutez deux millilitres de trypsine au flacon et secouez-le doucement pour disperser l’enzyme sur les cellules adhérentes.

Assurez-vous que la surface adhérente est complètement saturée et placez le flacon de tissu dans l’incubateur pendant deux à trois minutes. Après cela, appuyez doucement sur le côté du flacon trois à cinq fois pour faciliter le détachement cellulaire. Essuyez le flacon avec 70% d’alcool, et placez-le dans l’armoire de biosécurité.

Ajouter cinq millilitres de bouillon de médias à la fiole de tissu pour arrêter la réaction du substrat enzymatique. Aspirez tout le volume de liquide du flacon et transférez-le dans un tube conique stérile de 15 millilitres. Centrifugeuse à 200 fois g et à 25 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Ensuite, utilisez 70% d’alcool pour essuyer le tube contenant les cellules granulées, et placez-le à l’intérieur de l’armoire de biosécurité. Pipette hors des médias, laissant derrière lui environ 250 microlitres de liquide avec la pastille cellulaire. Exécutez le fond du tube conique à travers les fentes de flacon d’un support de tube de microcentrifugeuse pour créer une vibration rapide et déranger et résuspendre la pastille cellulaire.

Une fois terminée correctement, la nouvelle solution cellulaire apparaîtra comme un mélange nuageux sans granulés restants. Ajouter deux millilitres de médias à la résuspension cellulaire. Pipette les cellules doucement de haut en bas du côté du tube 20 fois pour briser les touffes.

Et enregistrez le volume total de suspension cellulaire. Ensuite, utilisez une pipette stérile pour ajouter 20 microlitres de bouillon bleu trypan à un puits vide d’une plaque de 96 puits. À l’aide d’une pointe stérile de pipette, transférez 20 microlitres de stock cellulaire du tube de 15 millilitres au puits contenant la solution bleue trypan.

Pipette doucement pour mélanger le contenu et transférer 10 microlitres du mélange entre le bordereau de couverture et la chambre de comptage sur un hemocytomètre. Ne comptez que les cellules au centre et les quatre carrés d’angle, en identifiant séparément le nombre total de cellules et le nombre de cellules non viables pour les cinq carrés identifiés. Après avoir calculé le nombre viable de cellules, marquer une ligne horizontale à travers le fond d’une plaque de 12 puits pour servir de marque de référence pendant l’imagerie.

Diluer le stock cellulaire avec du média à une densité de 19 000 cellules par millilitre. Puis ensemencer chaque puits de la plaque de 12 puits avec un millilitre du stock cellulaire dilué, en mélangeant le stock cellulaire périodiquement pour assurer un ensemencement même des cellules dans les 12 puits. Étiquetez chaque plaque avec les informations affichées ici.

Et placez-le dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone jusqu’à ce que les cellules se développent à 100% confluence. Récupérer une plaque de 12 puits avec des cellules de l’incubateur. À l’aide d’un microscope avec un objectif de 10 x, observez les cellules et déterminez la confluence à l’intérieur de chaque puits.

Ensuite, aspirez et éliminez les médias de croissance de chaque puits. Assembler un pipetter P200 avec une pointe stérile de 1 à 200 microlitres. Dans chaque puits, glissez la pointe de la pipette à travers la surface de la cellule de l’endroit de 12:00 à l’endroit de 6:00 pour produire une blessure simulée à gratter.

Rincez chaque puits avec un millilitre de solution de sel équilibrée pour dégager l’excès de débris et les touffes de cellules. Faire basculer la plaque d’un côté à l’autre pour faciliter le lavage. Retirez et jetez ensuite la solution de sel équilibrée de chaque puits.

À l’aide d’un pipetter P1000 avec une pointe de 1000 microlitres, ajouter 1000 microlitres des stocks d’arsenic préparés dans des puits qui ont été assignés au hasard avec un groupe de traitement. Utilisez une nouvelle pointe de pipette pour chaque puits et enregistrez l’heure à l’ajout des traitements. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.

Pour imager les plaques, capturez des images de chaque puits à 10x grossissement objectif toutes les quatre heures sur une période de 24 heures. Référez la ligne précédemment tracée sur le fond de la plaque pour l’image au même endroit le long de l’égratignure à l’intérieur de chaque puits à chaque point de temps. Dans cette étude, un test in vivo à gratter est utilisé pour observer les effets de l’arsenic sur la migration cellulaire.

Des rayures uniformes sont observées dans tous les groupes de traitement, avec une largeur moyenne d’égratignure d’environ 0,8 millimètre. Les cellules de contrôle montrent une égratignure complètement guérie après 20 heures. Les deux groupes d’arsenic ne montrent pas ce niveau de guérison.

Avec le traitement de 10 micromolaires inhibant la fermeture au total pendant 24 heures. Ces résultats démontrent que la présence d’arsenic ralentit la migration cellulaire. Les images brutes capturées pendant l’analyse sont analysées à l’aide d’un logiciel automatisé pour mesurer la largeur de la plaie, puis calculer le pourcentage de fermeture, et enfin calculer la zone sous la courbe.

Le groupe de traitement de 10 micromolaires montre la migration cellulaire statistiquement ralentie des fibroblastes cutanés néonatals humains comparés à tous les autres groupes de traitement. Il est important de pratiquer soigneusement cette technique pour augmenter la consistance lors de l’éraflure des cellules. La variabilité involontaire entre les analyses peut potentiellement fausser les données et modifier les conclusions.

D’autres techniques moléculaires telles que la réaction en chaîne quantitative de polymésase et les analyses immunosorbents enzymatiques peuvent être employées après l’essai d’éraflure pour identifier des signaux et des protéines messagers qui peuvent être la cible des changements à la migration cellulaire observés dans l’essai. Cet essai a contribué à la compréhension par les chercheurs de la métastase du cancer, des nouvelles thérapies contre le cancer émergentes, des cellules souches et de la médecine régénérative, et de nombreuses autres étapes scientifiques.