Préparation de Poly(pentafluorophenyl acrylate) fonctionnalisés SiO₂ perles pour la Purification de protéines

Cette méthode peut être utilisée pour préparer des surfaces activées par la biomolécule, qui ont des applications dans des domaines tels que l’administration de médicaments, la détection de cibles biologiques et la séparation biologique. Le principal avantage de cette technique est que les brosses poly PFPA sont très réactives avec les amines, et l’immobilisation des anticorps est réalisée par incubation en solution tampon pendant quelques heures. Les implications de cette technique s’étendent vers la purification des protéines par immunopurification, car l’anticorps immobilisé peut se lier avec succès avec les antigènes cibles.

Bien que cette méthode soit démontrée pour la mobilisation des anticorps et la purification des protéines, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes nécessitant une mobilisation biomoléculaire. Pour traiter les perles de dioxyde de silicium avec APTES, obtenez d’abord des particules de dioxyde de silicium sous la forme d’une suspension aqueuse de volume de 5%. Combinez 0,8 millilitres de suspension de dioxyde de silicium avec 40 milligrammes d’APTES, et huit millilitres de méthanol dans un flacon de scintillation de 20 millilitres équipé d’une barre de remue-remous.

Laissez la réaction se poursuivre à température ambiante pendant cinq heures en remuant vigoureusement. Après cinq heures, transférer la solution dans un tube conique. Pour isoler les perles de dioxyde de silicone fonctionnalisées APTES, centrifugez la solution à 10 000 G pendant cinq minutes.

Retirez ensuite le surnatant. Lavez maintenant les perles en les redispursant en trois millilitres de méthanol frais. Secouez le tube à la main pour le mélange, mais si nécessaire, améliorer la dispersion par sonication dans un bain d’eau pendant quelques secondes.

Centrifugeuse comme avant, et répéter l’étape de lavage une fois de plus. Mélanger les perles de dioxyde de silicone de lavage de méthanol avec trois millilitres de sulfure de diméthyle, ou DMSO. Secouez le mélange à la main, ou si nécessaire, soniquez pendant quelques secondes jusqu’à ce que les perles soient complètement dispersées dans le DMSO.

Après centrifugation avant, retirer le supernatant. Répétez l’étape de centrifugation une dernière fois pour assurer un échange complet de solvants du méthanol au DMSO. Pour préparer la solution poly PFPA, dissoudre 20 milligrammes de poly PFPA en deux millilitres de DMSO dans un flacon de scintillation de 20 millilitres.

Pour préparer la solution PEG, dissoudre l’amine fonctionnalisée PEG en un millilitre de DMSO. Transférez maintenant la solution PEG à la solution poly PFPA. Réagissez à température ambiante pendant une heure en remuant vigoureusement.

Transférer un millilitre des perles de dioxyde de silicium fonctionnalisées APTES suspendues dans DMSO dans la solution PEG en poly PFPA substituée. Permettre à la greffe entre les perles de dioxyde de silicium fonctionnalisées poly PFPA et APTES de procéder à température ambiante pendant une heure en remuant vigoureusement. Puis isoler les perles par centrifugation à 10 000 G pendant cinq minutes, suivie de l’ablation du supernatant.

Lavez les perles en ajoutant trois millilitres de DMSO, et mélangez à la main ou avec quelques secondes de sonication. Centrifuger les perles comme avant. Et retirez le supernatant avant de répéter le lavage DMSO deux fois.

Lavez les perles deux fois de plus avec trois millilitres d’eau distillée triple. Puis mélanger à la main ou avec quelques secondes de sonication. Centrifuger les perles comme avant et enlever le supernatant.

Enfin sécher les perles à 40 degrés Celsius dans un four à vide pendant la nuit. Ajouter cinq milligrammes de perles de dioxyde de silicium greffées poly PFPA à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Laver les perles en ajoutant 800 microlitres de PBS, et bien mélanger par vortex.

Centrifuger les perles à 10 000 G à température ambiante pendant une minute. Retirer le surnatant et répéter l’étape de lavage trois fois. Maintenant ajouter 350 microlitres de PBS frais, 50 microlitres de 0,1%PBST, et 6,67 microgrammes de l’anticorps.

Incuber environ 20 heures sur un rotateur à quatre degrés Celsius. Le lendemain, laver les perles et la centrifugeuse à 400 G et quatre degrés Celsius pendant une minute. Retirez ensuite le supernatant et ajoutez soigneusement 400 microlitres de tampon de lyse.

Resuspendez doucement les perles en faisant monter et descendre cinq fois. Répétez cette étape de lavage trois fois. Après le lavage final, retirer autant de supernatant que possible.

Préparez les cellules et le tampon de lyse tels que décrits dans le protocole de texte. Puis résuspendez la pastille cellulaire avec 400 microlitres du tampon de lyse. Sonicate les cellules à l’aide d’un sonicateur ultra.

Après la sonication, vortex brièvement. Puis centrifugeuse le lysate à 20 000 G à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Transférer le supernatant dans un nouveau tube centrifugeuse de 1,5 millilitre.

Pour effectuer l’immunoprécipitation, transférez 300 microlitres de lysate cellulaire à des perles de dioxyde de silicium greffées poly PFPA immobilisées précédemment préparées. Conserver 30 microlitres de la cellule lysate comme échantillon d’entrée dans un nouveau tube de microcentrifugeuse. Incuber le mélange de perles de lysate pendant trois heures sur un rotateur à quatre degrés Celsius.

Après incubation, centrifuger le mélange à 400 G à quatre degrés Celsius pendant une minute. Retirer le supernatant et ajouter délicatement 400 microlitres de tampon de lavage. Resuspendez doucement les perles en faisant monter et descendre environ cinq fois.

Après trois lavages, retirer autant de supernatant que possible. Ajouter 30 microlitres de colorant de chargement 2x SDS aux perles et à l’échantillon d’entrée. Ensuite, chauffez-les pendant 10 minutes à 95 degrés Celsius.

Après le chauffage, analysez l’échantillon à l’aide de ballonnements occidentaux ou stockez l’échantillon à moins 20 degrés Celsius. Les perles de silice fonctionnalisées sont examinées par spectroscopie photoélectron à rayons X, ou XPS, pour déterminer la composition de la surface. Les données représentatives XPS sont affichées ici.

Après le traitement aptes, le pic d’azote 1 associé à la zone du groupe amine APTES est détecté. Après le traitement poly PFPA, le pic de fluor 1 associé aux unités PFP sur le polymère est détecté. L’ARN de kinase de protéine activé, ou enrichissement de PKR par immunoprécipitation est exécuté, et l’échantillon de protéine fait allusion sont analysés utilisant le ballonnement occidental.

Comme prévu, les perles immobilisées sans anticorps, ou une mixuture anticorps non spécifique ne montrent aucune récupération PKR. Les perles incubées avec anti-PKR peuvent enrichir avec succès PKR comme l’indiquent la présence d’une bande PKR et l’absence de bande GAPDH. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que lors de la comparaison des systèmes, les expériences de propriété intellectuelle ainsi que l’analyse de ballonnement occidental ultérieure doit être faite simultanément.

Après son développement, cette technique peut être utilisée pour l’immobilisation de différents substrats biomoléculaires ou matériels. En outre, cette méthode a l’avantage supplémentaire de tuning seulement la propriété de surface à adapter aux besoins de chaque application.