Multicolor Flow Cytometry-basé Quantification des mitochondries et des Lysosomes dans les cellules T

Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immuno-métabolisme. L’avantage de cette technique est qu’elle permet la quantification des mitochondries ou des lysosomes dans les cellules vivantes individuelles, dans un mélange complexe de différents types de cellules. Cette méthode pour étudier les cellules T et B peut également être appliquée à de nombreux autres types de cellules telles que les macrophages, les cellules dendritiques, ou toutes les cellules primaires récoltées à partir d’un échantillon de tissu.

La procédure sera démontrée par Chin-Wen Wei, un étudiant diplômé de mon laboratoire. Pour étiqueter les organites pour la quantification, tout d’abord, ajouter une fois dix aux cellules T de la sixième souris à un tube de fax inférieur rond par marqueur. Et pelleter les cellules par centrifugation.

préchauffé à 37 degrés Celsius milieu de culture sans sérum pour diluer les solutions de stock de sonde spécifique organelle aux concentrations finales de travail dans le milieu. Et re-suspendre les cellules dans 100 microlitres de colorant de sonde par tube. Ensuite, incuber les cellules dans un incubateur de culture cellulaire pour la période de coloration appropriée, arrêter la réaction à la fin de l’incubation avec un millilitre de tampon de fax glacé par tube.

Ensuite, recueillir les cellules avec une autre centrifugation et de suspendre à nouveau les granulés dans 100 microlitres du supernatant hybridome 24G2 pré-titré sur la glace. Après dix minutes, ajouter un millilitre de tampon de fax par tube. Recueillir les cellules par centrifugation et étiqueter les cellules avec 50 microlitres de la fluorescence pré-titrée cocktail d’anticorps conjugués d’intérêt.

Ajouter la concentration appropriée selon le tableau. Et tampon fax pendant 20 minutes sur la glace, à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, ajouter un millilitre de tampon de fax par tube.

Recueillir les cellules par centrifugation. Et re-suspendre les cellules en 300 microlitres de tampon de fax complété par un microgramme par millilitre d’iodure de propidium. Immédiatement après l’ajout du contre-tache nucléaire et chromosomique, allumez l’ordinateur d’analyse du cytomètre d’écoulement, le cytomètre d’écoulement, le logiciel d’acquisition de fax et tout autre appareil accessoire selon la plate-forme de la machine.

Exécutez PBS à travers le système pendant environ une minute pour s’assurer que la ligne d’écoulement est remplie de PBS et tampon de sheathe. Ouvrez une nouvelle expérience et définissez les paramètres du cytomètre selon les instructions du fabricant. Filtrer les cellules à l’aide d’une passoire à cellules de 70 micromètres.

Et vortex avant l’acquisition de chaque échantillon pour éviter les touffes et la formation de doublets. Ouvrez le paramètre compensation automatique et créez des parcelles à points pour chaque paramètre fluorescent. Une fois que toutes les tensions ont été réglées, ajustez la compensation et appliquez la compensation aux échantillons.

Créez une parcelle de dispersion avant par rapport à une parcelle de dispersion latérale et optimisez les tensions afin que les cellules d’intérêt apparaissent dans l’intrigue. Créez un scatter vers l’avant par rapport à une parcelle de hauteur de dispersion vers l’avant et portez les cellules individuelles. Créez une zone de dispersion vers l’avant par rapport à la parcelle latérale de la zone de dispersion et portez les lymphocytes.

Créez une zone de dispersion vers l’avant par rapport à la parcelle iodée propidium et portez les cellules vivantes. Une fois que toutes les tensions ont été réglées, ajustez la compensation et appliquez la compensation aux échantillons. Chargez ensuite le premier tube d’échantillon, créez les parcelles de marqueurs de surface cellulaire appropriées et recueillez au moins 1 000 événements de la population d’intérêt.

Lorsque tous les échantillons ont été exécutés, exportez les données de flux pour une analyse ultérieure. Et enregistrer l’expérience comme un modèle pour préserver les paramètres du cytomètre et les paramètres pour des expériences similaires à l’avenir. Le contenu mitochondrial final du site est le plus bas dans les cellules T doublement négatives, le pic au double stade négatif deux et trois, et une légère diminution du double stade négatif quatre.

Avec les thymocytes doubles positifs démontrant des nombres plus élevés de mitochondries que cd4 et CD8 thymocytes positifs simples, suggérant que le contenu mitochondrique fluctue pendant le développement. Les thymocytes positifs simples CD4 et CD8 présentent une intensité moyenne de fluorescence mitochondrique plus élevée que les lymphocytes T CD4 ou CD8 spléniques, ce qui suggère que les lymphocytes T naïfs qui se recirculent dans l’environnement sanguin riche en oxygène ont une masse mitochondriale encore plus faible que les thymocytes. Fait intéressant, cette réduction du contenu mitochondrial est plus importante dans le CD8 que la lignée des lymphocytes T CD4, et l’activation des lymphocytes T diminue encore la présence de ces organites.

Le contenu lysosomal relativement bas, mais détectable, est observé dans toutes les populations de thymocytes, avec une présence plus proéminente dans les thymocytes double négatif. Dans la périphérie, un nombre relativement élevé de lysosomes sont détectés dans la mémoire et l’effecteur CD8 cellules T positives. La combinaison des teintures spécifiques d’organite et du marqueur de surface avec la cytométrie d’écoulement est un moyen puissant de caractériser le statut métabolique des cellules dans un mélange complexe.

Le colorant spécifique d’organelle additionnel peut être employé pour détecter le réticulum endoplasmique, le vacuole autophagique, ou tout autre compartiment intracellulaire d’intérêt.