Détermination des sous-ensembles de lymphocytes T régulateurs dans le Thymus murin, pancréatique, drainage des ganglions lymphatiques et la rate à l’aide de cytométrie en flux

Ce protocole aide à étudier le rôle des cellules immunitaires dans certains organes dans la santé et la pathologie. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une technique rentable puisqu’il s’agit d’une technique manuelle. Zhengkang Luo, doctorant de mon laboratoire, démontrera la procédure.

Pour commencer, placez les glandes thymiques et la rate des souris précédemment euthanasiées en fiches de scintillation de 20 ml, ou tubes coniques de 15 ml, remplis de 5 ml de solution de sel équilibrée de Hank. Placer les ganglions lymphatiques drainants pancréatiques dans des micro-tubes de 1,5 ml remplis de 1 ml de RPMI-1640. Assurez-vous d’utiliser tout le thymus et la rate, et tous les PNL.

Gardez les organes sur la glace tout au long de la procédure. À l’aide d’une paire de ciseaux, presser soigneusement le thymus et la rate pour libérer les cellules immunitaires. Jeter le reste des capsules thymiques et spléniques.

Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml. Centrifugeuse à 433 fois g et à 4 degrés Celsius pendant cinq minutes, et jeter le surnatant. Pour lyse les globules rouges, suspendre à nouveau la suspension cellulaire dans 5 ml de chlorure d’ammonium molaire de 0,2 molar, et incuber à température ambiante pendant dix minutes.

Inverser délicatement les tubes toutes les deux minutes. À la fin de l’incubation, ajouter 5 ml de HBSS pour arrêter la lyse. Centrifuger les tubes à 433 fois g et à 4 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Jetez le surnatant et suspendez les cellules dans environ 5 ml de HBSS. Ensuite, remplissez les tubes avec HBSS. Répétez ce processus, de la centrifugeuse des échantillons au remplissage du tube avec HBSS, une fois.

Centrifuger les tubes une fois de plus à 433 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et suspendez la pastille dans HBSS. Obtenir 5 ml de tubes à fond rond avec bouchons de passoire cellulaire.

Transférer 1 ml de suspension des cellules thymiques et 500 microlitres de la suspension cellulaire splénique sur les tubes en appliquant la suspension sur les bouchons de la passoire cellulaire. Tout d’abord, placer un tube conique de 15 ml dans une grille. Placez un maillage métallique stérile de 250 micromètres sur le tube.

Rincer le maillage avec 1 ml de RPMI. Ensuite, transférez les ganglions lymphatiques au maillage métallique et utilisez une paire de pinces à épiler à travers le maillage. Appliquer 1 ml de RPMI sur le maillage pour rincer les cellules dans le tube.

Répétez ce processus de transfert et de broyage des ganglions lymphatiques trois fois pour chaque échantillon, puis retirez le maillage. Centrifuger les tubes à 433 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et suspendez les cellules dans environ 5 ml de RPMI.

Ensuite, remplissez les tubes avec RPMI. Répétez ce processus, de centrifugage des échantillons au remplissage du tube avec RPMI, une fois. Centrifugez à nouveau les tubes à 433 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.

Jeter le supernatant et suspendre à nouveau la pastille cellulaire dans 2 ml de RPMI. Transférer 2 ml de suspension cellulaire dans des tubes à fond rond de 5 ml avec des bouchons de passoire cellulaire. Tout d’abord, centrifuger la suspension cellulaire des échantillons de thymus, de rate et de PDLN à 433 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.

Jeter le surnatant. Tacher les cellules avec des anticorps de surface comme indiqué dans le protocole de texte, et incuber les tubes sur la glace pendant 40 minutes. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de tampon FACS à chaque tube.

Centrifugeuse à 433 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes, et jeter le supernatant. Répétez ce processus, en ajoutant le tampon, en centrifugant et en jetant le supernatant, une fois. Suspendre à nouveau la pastille cellulaire dans 500 microlitres de tampon de fixation de perméabilisation pour fixer et perméabiliser les cellules.

Transférer les tubes au réfrigérateur à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, centrifuger les tubes à 433 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et suspendez la pastille cellulaire dans 500 microlitres de tampon de lavage de perméabilisation.

Centrifuger les cellules à nouveau à 433 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes et jeter le supernatant. Tacher les cellules avec des anticorps intracellulaires, comme décrit dans le protocole de texte. Incuber les tubes sur la glace pendant 1 heure.

Après cela, ajouter 500 microlitres de tampon de lavage de perméabilisation à chaque tube. Centrifugeuse à 433 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et suspendez la pastille dans 500 microlitres de tampon de lavage de perméabilisation.

Centrifugeuse une fois de plus à 433 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et suspendez la pastille cellulaire dans 300 microlitres de tampon FACS. Ensuite, analyser les cellules sur un cytomètre d’écoulement, tel que décrit dans le protocole de texte.

Dans cette étude, les cellules simples sont isolées des glandes thymiques, des PDLN et des rate des souris glycémiques normales de NOD, et sont souillées avec des marqueurs de cellules de Treg, CD4, CD25, Foxp3, Helios, et neuropiline-1 pour l’analyse cytométrique de flux. Les résultats sont analysés et sont présentés ici comme des stratégies de gating représentatives. La proportion de cellules helios-positives parmi les cellules Treg cd4-positives, CD8-négatives, CD25-positives, Foxp3-positives est considérée comme plus élevée que celle des cellules Nrp1-positives dans les trois organes.

Plus de 80% des cellules Treg dans le thymus sont vus pour exprimer Hélios, qui est plus élevé que dans le PDLN, et la rate. La proportion de cellules NrP1 positives parmi les cellules Treg helios-positives est considérée comme plus élevée dans le PDLN que dans le thymus ou la rate. La majorité des cellules Treg Nrp1-positives expriment également Helios, et la proportion de cellules helios-positives parmi les cellules Treg positives Nrp1 est considérée comme plus élevée dans le thymus et la rate que dans le PDLN.

Ensemble, ces résultats indiquent qu’Hélios est un meilleur marqueur pour détecter les lymphocytes Treg que Nrp1. Les ganglions lymphatiques sont petits, mais certains marqueurs intracellulaires nécessitent un grand nombre de cellules pour donner un bon signal dans la cytométrie du flux. D’autres méthodes ne peuvent pas être effectuées après cette procédure parce que les cellules sont déjà tachées et mortes.

Mais les quatre marqueurs cellulaires de l’animal peuvent être remplacés pour étudier d’autres types de cellules immunitaires.