Isolement et Culture des embryons de souris des cellules souches neurales

L’objectif de ce protocole vidéo est d’établir une source et un protocole efficace pour l’isolement et la culture des cellules souches neurales de souris embryonnaires. Bonjour, je suis Maryam Sadeghi-Zadeh. Je suis étudiant à la maîtrise en biologie cellulaire et moléculaire à l’Institut Royan.

Aujourd’hui, mon collègue et moi voulons vous montrer comment récolter les cellules souches neurales à partir de 13 éminence ganglionnaires de souris embryonnaires. Bonjour, je suis Bahareh Alizadeh-Shoorjestan. Je suis étudiant à la maîtrise en biologie cellulaire et moléculaire au département de cellules souches de l’Institut Royan pour la biotechnologie.

Bonjour, je suis Reza Dehghani-Varnamkhasti. J’étudie aussi la biologie cellulaire et moléculaire à l’Institut Royan. Les interventions chirurgicales comprennent la récolte de chaque 13 embryons de souris de l’utérus.

Couper l’avant du fontanel de l’embryon avec une pointe d’aiguille pliée extrayant le cerveau du crâne. Micro-dissection du cerveau isolé pour récolter l’éminence ganglionnaire. Dissociation du tissu récolté dans un milieu de cellules souches neurales pour obtenir une suspension cellulaire unique.

Et enfin, placage des cellules dans une culture de suspension pour générer des cellules nerveuses. Nettoyez et désinfectez la peau de l’abdomen en pulvérisant à 70 % d’éthanol. Contrôlez la peau vers le haut de l’abdomen, puis coupez la peau et soulignez le visage avec des ciseaux pour découvrir la cavité abdominale et les cornes utérine.

Retirer les cornes utérinnes contenant les embryons par ciseaux et les transférer dans un tube conique de 50 ml contenant 25 ml de tampon HEPES MEM froid. Placez le tube conique sous le capot d’écoulement laminal. Ouvrez le bouchon sous le capot.

Sortez les cornes utérinnes du tube et rincez trois fois avec suffisamment de volume de la tampon fraîchement froide HEPES MEM pour éliminer les débris et le sang. Transférer le tissu utérin dans une boîte de Pétri de 10 cm contenant de 7 à 10 ml de tampon HEPES MEM froid. Ouvrez les cornes utérinnes à l’aide de ciseaux fins et transférez les embryons dans un nouveau plat contenant de 7 à 10 ml de tampon HEPES MEM froid.

Maintenant, mettez le plat de 10 cm avec des embryons sous le microscope de dissection pour l’opération de micro-dissection. Pliez le bout d’une aiguille de seringue en poussant sa pointe sur une poignée de lame de scalpel en acier. Pliez le bout de l’aiguille jusqu’à ce que la pointe soit pliée à un angle de 70 à 90 degrés.

Vérifiez le bout de l’aiguille sous le microscope disséquant pour voir la courbure à l’extrémité de l’aiguille. Naturellement, les embryons ont une position latérale dans ce. Sans changer leur position, a tenu le cou et le corps de l’embryon avec des forceps fins, puis insérer la partie pliée de l’aiguille profondément dans l’avant de la fontanel de la tête de l’embryon.

Il y aurait un petit saignement ou un caillot de sang là-bas. Déplacez la pointe de l’aiguille superficiellement pendant que la partie pliée est à l’intérieur du renflement vers le front, puis vers l’arrière de la tête. Assurez-vous de couper à travers la peau et le crâne, et de ne pas endommager le cerveau sous-jacent.

Poussez la peau avec la pointe de l’aiguille latéralement pour découvrir le cerveau. Insérez l’aiguille du côté latéral de la peau au dessous du cadre du côté latéral de la peau à la zone sous le cerveau. Et puis enlever le cerveau de ce cuir chevelu en le poussant à sortir du crâne disséqué.

L’éminence ganglionnaire est clairement montrée en vidéo avec ses parties médials et latérales. A maintenu le cerveau stable en utilisant les forceps de soins, puis en utilisant des microscisseurs pour couper le cortex de chaque hémisphère pour exposer l’éminence ganglionnaire. A tenu le cerveau et place l’éminence ganglionnaire disséquée dans le tube de centrifugeuse de 15 ml contenant le média neural de cellules souches.

Répétez cette procédure jusqu’à ce que tout le cerveau ait été micro-disséqué. Coupez l’éminence ganglionnaire disséquée en plaçant la pointe pipette contre le fond du tube et pipette la suspension de haut en bas pendant 2 5 fois pour briser le tissu pour obtenir une suspension à cellule unique. Centrifuger la suspension à 110 g pendant 5 minutes.

Retirer le supernatant et résuspendre les cellules dans 1 ml de tube de 0,05% dans EDTA. Incuber la suspension cellulaire dans un 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Et puis ajouter un volume équivalent d’inhibiteur de la trypsine de soja pour arrêter l’activité de la trypsine.

Pipette la suspension cellulaire de haut en bas pour s’assurer que la trypsine a été totalement inactivée. Centrifuger la suspension cellulaire à 110 g pendant 5 minutes. Enlevez le supernatant et resuspendez les cellules dans 1 ml de milieu complet de cellules souches neurales et comptez le nombre de cellules.

Plaquez les cellules au milieu des cellules souches neurales dans le flacon de culture tissulaire de taille appropriée. Transférer 5 ml de 2T25, 20 ml au T75 et 40 ml dans des flacons T175. Les neurosphères apparaîtront après 3 jours de culture à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5% de CO2.

Pour aspirer la culture des neurosphères, transférer le milieu avec des neurosphères suspendues à la centrifugeuse à la centrifugeuse à 110 g pendant 5 minutes, puis jeter le supernatant. À 1 ml de 0,05% trypsine EDTA et incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Puis inactivez la trypsine à l’aide de l’inhibiteur de la tyrpsine de soyben et pipette les neurosphères doucement de haut en bas pour en faire des cellules simples.

Centrifuger la suspension cellulaire à 110 g pendant 5 minutes. Jetez le supernatant et resuspendez les cellules dans 1 ml de cellules souches neurales moyennes. Ces cellules sont prêtes pour la culture ou la culture de prochaine étape sur la surface stratifié et entièrement enduite pour des expériences avancées.

En cultivant un million de cellules souches neurales primaires après sept jours, le nombre de cellules passera à trois à quatre millions. Après six à sept jours, les sphères doivent mesurer entre 150 et 200 micromètres de diamètre et seront prêtes pour la sous-culture sur les plats enrobés de poly ornithine stratifié en l’absence de bFGF et d’EGF pour la différenciation neuronale. Les résultats de l’analyse de cytométrie de flux montrent que près de 95% des cellules constituant les neurosphères étaient nestin positives qui est un marqueur connu pour les cellules souches neurales.

Les analyses utilisant des anticorps bêta tubulin III et ganglio fibrous de protéine révèlent qu’en cultivant des cellules souches neurales sur la surface enduite environ 94% ont montré le phénotype neuronal et environ 5% montrent le phénotype glial. Dans cette courte vidéo, une technique de laboratoire pour l’isolement rapide des cellules souches neurales de 13 embryons de souris éminence ganglionnaire. J’espère que vous réussirez dans votre culture de cellules souches neurales.