Interfaçage Microfluidics microélectrode tableaux pour étudier la Communication neuronale et la Propagation des signaux axonale
December 8th, 2018
Ce protocole vise à démontrer comment combiner in vitro les baies de la microélectrode avec dispositifs microfluidiques pour étudier la transmission du potentiel d’action dans les cultures de neurones. Analyse des données, à savoir la détection et la caractérisation des potentiels d’action, de la multiplication est effectuée en utilisant une nouvelle avancée, pourtant facile à utiliser et disponible gratuitement, outil de calcul.
L’objectif global de ce protocole est de démontrer comment combiner l’utilisation de micro fluidiques avec des tableaux de micro-électrodes pour générer la plate-forme adaptée à l’étude de la communication neuronale et de la propagation du signal axonal. Bonjour, je suis Paulo Aguiar et je suis l’IP du Neuro engineering and Computation Neuroscience Lab à l’INEB, utilisé pour coder pour le génie biomédical à l’Université de Porto, Portugal. Comprendre la transmission de l’information dans les circuits neurologiques demeure l’un des plus grands défis en neurosciences.
Aujourd’hui, je vais vous montrer comment nous pouvons combiner des tableaux de micro-actionneurs individuels avec des micro fluidiques et des outils logiciels développés ici à notre laboratoire, pour détecter et caractériser les potentiels d’action de propagation. Nous utilisons cette configuration dans une variété d’études, à savoir le codage neuronal et le décodage, et dans les communications entre les neurones sensoriels et d’autres types de cellules. Nous croyons que la démonstration visuelle de ce protocole est cruciale.
Étant donné que l’assemblage de tableaux micro fluidiques et micro-électrodes est cette difficulté à gérer, et difficile à reproduire simplement en reproduisant des protocoles. Pour le marché, les ventes cultary sur cette plate-forme n’est pas simple, comme les ABA conventionnelles, et il exige une attention particulière à la cellule assis trucs, et les aimants de culture. Cette configuration nous permet d’étudier plusieurs propriétés liées à la communication, telles que la vitesse de propagation et la direction, dans un environnement bien contrôlé.
Bien que la procédure d’enregistrement soit simple, l’analyse des données nécessite des connaissances et l’utilisation des bons outils informatiques. La veille de la séance cellulaire, commencez par préparer les dispositifs micro fluidiques, en nettoyant avec du ruban vinyle. Appuyez doucement sur la bande contre l’appareil pour atteindre toutes les zones du micro fluidique.
Le plasma d’air nettoie l’AAM pendant trois minutes pour nettoyer la surface et la rendre plus hydrophile. À l’intérieur d’une hotte d’écoulement laminaire, submergez les micro fluidiques dans 70 pour cent d’éthanol. Laissez-les sécher à l’air libre.
Placer chaque MEA dans une boîte de Pétri et stériliser par 15 minutes d’exposition à la lumière UV. Ensuite, rendez-vous dans la zone centrale de l’AE AVEC 500 microlitres de solution de l’Î.-P.-É. Incuber pendant au moins une heure.
À l’intérieur d’une hotte d’écoulement laminaire, aspirez la solution de revêtement de l’Île-du-Prince-Édouard à partir de la surface mea. Ensuite, lavez les MEA quatre fois avec un millilitre d’eau stérile. À l’aide d’un microscope stérile, placé à l’intérieur du capot d’écoulement laminaire.
Centrez la puce MEA et ajoutez un millilitre d’eau stérile à la zone centrale de l’AE. Ensuite, placez le dispositif micro fluidique sur le dessus de la surface MEA, et alignez soigneusement la grille micro-active microgrooves de l’AAM. Aspirer l’eau excessive, et incuber toute la nuit à 37 degrés, pour permettre un attachement complet.
Le lendemain, chargez les puits de laminine et incubez à nouveau. Après avoir recueilli les susseds d’embryon, procéder à la dissection préfrontale de cortex. Commencez par exposer soigneusement le cerveau, à l’aide d’une paire de forceps.
Ensuite, retirez doucement le cerveau de sa cavité. Couvrez-le de H-HBSS froid. Lorsqu’elles sont présentes, retirer et jeter les bulbes olfactifs.
Enfin, disséquer le cortex préfrontal. Assurer l’enlèvement complet des méninges. Répétez cette procédure pour les deux hémisphères.
Pour le nombre de cerveaux requis pour votre étude. À l’intérieur d’une hotte d’écoulement laminaire, recueillir les fragments de cortex précédemment disséqués dans un total de cinq millilitres de H-HBSS. Ensuite, transférez ces fragments dans un tube chronique stérile de 15 millilitres.
Pipette, et ont 2,3 millilitres de solution trypsine fraîchement préparée au tube contenant les fragments du cortex. Mélanger la suspension et incuber à 37 degrés pendant 15 minutes. Agiter toutes les cinq minutes.
Ensuite, jetez le supernatant contenant la trypsine, ajoutez H-HBSS contenant FBS, pour inactiver la trypsine restante. Agiter doucement. Laissez les fragments du cortex s’installer et jetez le surnatant.
Lavez-le deux fois avec H-HBSS, pour enlever le FBS, et jetez le supernatant à nouveau. Ajouter le milieu basal neural complété, et dissocier mécaniquement les tissus en pipetting lentement de haut en bas. Jeter le reste du tissu en filtrant la suspension de sel à travers une passoire cellulaire.
Ensuite, mélangez 20 microlitres de suspension cellulaire avec 20 microlitres de bleu trypan. Transférez 10 microlitres dans une chambre Neubauer et comptez le nombre de cellules viables. Immédiatement avant la cellule assise, retirer la laminine de tous les puits du micro EF. Ensuite, ajoutez le petit volume de milieu supernatant à chaque puits du compartiment axonal.
Ensemencer lentement cinq microlitres de suspension cellulaire dans le compartiment somal. Incuber à 37 degrés pendant une heure pour permettre l’attachement cellulaire au substrat. Après une heure, remplir délicatement chaque puits avec un milieu chaud et complété.
Ajouter de petits volumes pour éviter le décollement cellulaire. Ensuite, transférez le micro EF dans un incubateur. Voici montré une culture à cinq jours in vitro.
Après une semaine, les cultures commencent à montrer une activité spontanée. Avant d’effectuer des enregistrements, utilisez un contrôleur de température pour manger la plaque de base d’incendie pré-ampli. Ensuite, placez le micro EF sur le préampli, fermez et verrouiller le couvercle.
Pour enregistrer, ouvrez le logiciel expérimental multicanal. Réglez le taux d’échantillonnage à 20 kilohertz. Faites glisser le filtre et les boîtes enregistrées, et connectez-les séquentiellement pour enregistrer les données brutes et filtrées.
Commencez l’acquisition de données pour visualiser les signaux, et enregistrez rapidement. Les données enregistrées peuvent être rapidement explorées à l’aide de l’analyseur multicanal. Ici, la propagation du signal le long des microgrooves est déjà claire.
Pour identifier et caractériser ces événements de propagation, ouvrez votre enregistrement en chasseur de micro pointes. Cliquez sur le bouton info fichier pour accéder aux paramètres d’enregistrement et sélectionnez l’ensemble des micro-électrodes pour analyse. Fixez le seuil de propagation de la détection d’événements.
Et lisez rapidement les données. Le logiciel énumére toutes les séquences détectées. L’utilisateur peut alors évaluer la vitesse de propagation comme information, entre les paires de micro-électrodes, et en fonction de leur corrélation inter-distance et croisée.
L’outil graphique de chimio permet à l’utilisateur d’estimer manuellement la vitesse de propagation. Voici un événement de propagation. Détecté le long de quatre micro-électrodes dans un microgroove.
Ces événements peuvent être représentés dans une parcelle Rasser. Voici l’activité de propagation le long de 11 microgrooves pour les deux premières minutes de l’enregistrement. Les microgroove à haute et basse activité sont colorés en jaune et rouge, respectueusement.
Remarquez la synchronisation de l’activité le long des 11 microgrooves. La synchronisation est indépendante du taux d’activité. Comme on peut le voir dans les variations de la vitesse de cuisson instantanée des deux microgrooves.
Les microgrooves fonctionnent également comme amplificateurs de signaux axonals, comme le montrent la boîte et l’intrigue des moustaches. Nous vous avons montré comment combiner les micro fluidiques avec les MEA, et comment la culture des neurones sur eux. En outre, comment enregistrer et extraire des données significatives de ces enregistrements.
Nous espérons que cette démonstration sera utile pour vos recherches, pourquoi vous voudrez peut-être étudier la communication dans les circuits neuronaux.
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Aperçu
Ce protocole démontre l'intégration de réseaux de microélectrodes avec des dispositifs microfluidiques pour étudier la transmission du potentiel d'action dans les cultures neuronales. Il souligne l'importance de la démonstration visuelle et l'utilisation d'un outil de calcul convivial pour l'analyse des données.
Composants clés de l'étude
Domaine de la science
- Neuroscience
- Neuro-ingéniérie
- Électrophysiologie
Contexte
- Comprendre la transmission d'informations dans les circuits neuronaux est un défi majeur en neurosciences.
- Les réseaux de microélectrodes permettent l'enregistrement de l'activité électrique des neurones.
- Les dispositifs microfluidiques permettent un contrôle précis de l'environnement cellulaire.
- La combinaison de ces technologies peut améliorer l'étude de la communication neuronale.
Objectif de l'étude
- Créer une plateforme pour étudier la communication neuronale et la propagation des signaux axonaux.
- Détect et caractériser les potentiels d'action se propageant dans les cultures neuronales.
- Faciliter la recherche en codage et décodage neural.
Méthodes utilisées
- Intégration de réseaux de microélectrodes avec des dispositifs microfluidiques.
- Utilisation d'outils logiciels développés pour l'analyse de données.
- Démonstration visuelle du protocole pour plus de clarté.
- Application dans diverses études impliquant des neurones sensoriels.
Résultats principaux
- Détection et caractérisation réussies des potentiels d'action.
- Compréhension améliorée des mécanismes de communication neuronale.
- Démonstration de l'efficacité du protocole dans les applications de recherche.
- Développement d'un outil de calcul convivial pour l'analyse des données.
Conclusions
- L'utilisation combinée des réseaux de microélectrodes et de la microfluidique est efficace pour étudier l'activité neuronale.
- Cette approche peut faire progresser la recherche en neurosciences et en neuro-ingéniérie.
- Les protocoles visuels sont essentiels pour la reproductibilité et la compréhension.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
This microfluidic-MEA platform addresses a key challenge in neuroscience drug discovery: isolating axonal signal propagation from somatic noise in neuronal cultures. By enabling high-resolution, long-term recording of spike propagation with improved signal-to-noise ratio, the method supports mechanistic de-risking of targets involved in neurodevelopment, neurodegeneration, and neuroregeneration. It provides predictive confidence in early discovery by quantifying communication-related phenotypes such as conduction velocity and firing patterns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating axonal signaling to clarify pathway-specific communication in neuronal circuits.
- Operational Value: Supports biological de-risking through functional validation of targets modulating spike propagation velocity and conduction failure.
- Predictive Value: Quantifies anterograde spike transmission and coding mechanisms to inform portfolio triage based on functional target engagement.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated, compartmentalized neuronal cultures for downstream compound evaluation with controlled axonal alignment and microelectrode coupling.
- Quantitative Outputs: Delivers reproducible, high-resolution measurements of propagation velocity, conduction failure, and firing rate for reliable compound screening.
- Scalability & Reuse: Enables platform standardization across studies of sensory neuron communication and co-culture configurations, supporting assay transferability.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models neurodevelopmental and neurodegenerative processes by tracking axonal signal propagation over weeks in vitro.
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation by quantifying communication phenotypes relevant to circuit dysfunction and repair.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions through objective metrics of neuroregenerative potential and information coding fidelity.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing functional readouts that bridge phenotypic screening and mechanistic validation in neuronal systems.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by isolating axonal contributions to network activity in controlled microenvironments.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible neuronal cultures with standardized electrophysiological readouts for compound effect evaluation.
- Analytics: Enables quantitative comparison of conditions via propagation velocity, conduction failure, and firing rate metrics derived from spike train analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling axonal communication dynamics relevant to neurodegeneration and neuroregeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying sensory neuron communication and co-culture systems across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in neuronal signal propagation.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through compartmentalized culture design and long-term stability.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets involved in circuit-based pathologies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantifiable axonal communication phenotypes linked to disease mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device handling, neuronal culture, and electrophysiological recording.
- Depends on access to microelectrode arrays, plasma cleaners, laminar flow hoods, and temperature-controlled recording systems.
- Necessitates cross-team standardization for consistent device alignment, cell seeding, and medium exchange protocols.
- Involves adaptation considerations when extending to different neuronal types or co-culture configurations beyond prefrontal cortex-derived cultures.
- Practical limitations include the technical complexity of microfluidic-MEA assembly and the need for specialized computational tools for spike propagation analysis.
