Autoradiographie comme une méthode Simple et puissante pour la visualisation et la caractérisation des cibles pharmacologiques

L’autoradiographie est une technique puissante et simple pour étudier la distribution des sites de liaison protéique dans les tissus à l’aide de radioligands spécifiques pour la cible. C’est aussi une alternative appropriée à l’immunohistochimie. Cette technique visualise l’expression protéique avec une résolution spatiale via des images numériques qui est plus rapide que l’exposition cinématographique traditionnelle.

Il peut également être utilisé pour l’analyse pharmacologique des cibles protéiques. La méthode implique des tissus de souris montés sur le verre, mais peuvent être étendus à d’autres espèces ou même à des cellules cultivées sur des coverslips. Nane Griem-Krey, doctorante dans mon laboratoire, démontrera la procédure.

Pour commencer, submergez le tissu dans de la glace sèche en poudre pour le congeler. Transférez le tissu congelé directement à un cryostat qui est réglé à moins 20 degrés Celsius. Laissez le tissu s’acclimater à moins 20 degrés Celsius dans le cryostat pendant 20 minutes.

Couvrez ensuite le support tissulaire avec le milieu d’intégration à l’extérieur du cryostat et placez rapidement le spécimen de tissu congelé dans l’orientation désirée tandis que le milieu d’intégration est encore liquide. Transférez le porte-tissus au cryostat et exposez le milieu d’intégration à des températures inférieures à moins 10 degrés Celsius pour le durcissement. Placez le porte-tissus dans la microtome du cryostat.

Ajustez l’orientation du tissu pour éviter les sections inclinées. Couper le tissu avec le guidage d’un atlas stéréotaxique dans les sections de l’épaisseur désirée et déplier la section avec une petite brosse si nécessaire. Décongeler la section sur une lame de microscope.

Puis recueillir séquentiellement les sections de la région d’intérêt pour la répétition technique souhaitée. Laissez sécher les sections sur les glissières pendant une heure avant de les manipuler davantage. Dans un laboratoire de radioactivité certifié, utilisez un crayon pour étiqueter les diapositives avec les conditions expérimentales.

Placez les glissières horizontalement dans des plateaux en plastique. Appliquez soigneusement un volume approprié de tampon SA ajusté à la cible en question sur les sections montées sur les glissières. Assurez-vous que chaque section est entièrement couverte.

Pour la détermination de la liaison non spécifique, compléter sa tampon avec une concentration pertinente de composé non étiqueté. Couvrez ensuite les plateaux de couvercles pour éviter l’évaporation. Pré-incubation à une température pertinente pendant 30 minutes sur un shaker de plaque réglé à 20 rpm.

Ensuite, versez le liquide de pré-incubation de chaque diapositive et transférez les glissières dans le plateau en plastique. Couvrez immédiatement les sections complètement avec la concentration pertinente de radioligand dans le tampon SA. Pour la détermination de la liaison non spécifique, compléter la solution radioligand avec une concentration pertinente de composé non étiqueté.

Couvrir les plateaux de couvercles et incuber dans les conditions désirées avec des secousses douces constantes à 20 rpm. Après cela, versez la solution d’incubation et transférez les glissières dans un support de glissière de microscope. Lavez immédiatement les glissières.

Pour le protocole GHB, lavez-le deux fois avec un tampon SA glacé pendant 20 secondes, puis rincez deux fois en trempant le bac à glissière dans des plateaux remplis d’eau distillée glacée. Placez les glissières verticalement dans des supports et séchez l’air pendant au moins une heure. Ensuite, transférez les glissières à un fixateur contenant du paraformaldéhyde pour une fixation pendant la nuit à température ambiante.

Le lendemain, transférez les glissières dans une boîte de dessiccator contenant du gel de silice à température ambiante. Laissez les glissières dans la boîte de dessiccator pendant trois heures pour éliminer l’humidité. Tout d’abord, placez les sections dans une cassette de plaque d’imagerie blindée par rayonnement avec le tissu face vers le haut.

Inclure une microécoque radioactive dans chaque cassette pour la quantification ultérieure de la liaison radioligand. Immédiatement avant l’utilisation, chargez la plaque d’imagerie au phosphore sensible au tritium dans la machine d’imagerie au phosphore et exposez-la à la lumière infrarouge visible selon les instructions du fabricant pour l’effacer. Retirez ensuite la plaque d’imagerie de la machine d’imagerie au phosphore et placez-la immédiatement sur les sections de la cassette.

Assurez-vous que la cassette est complètement fermée. Exposez les sections à la plaque d’imagerie au phosphore pour le temps d’exposition optimisé à température ambiante tout en étant à l’abri de la lumière. Après l’exposition, ouvrez soigneusement la cassette dans l’obscurité et transférez immédiatement la plaque d’imagerie dans la boîte noire d’un imageur de phosphore.

Numérisez la plaque à la plus haute résolution possible pour obtenir une image numérique. Pour commencer, ouvrez un programme d’analyse d’image approprié. Déterminez les densités optiques relatives pour chaque norme d’étalonnage en sélectionnant la détermination de la région de l’élément de menu.

Sélectionnez l’outil pour la création de la région et utilisez-le pour sélectionner une zone de taille égale pour chaque point de la microscale radioactive. Attribuez un numéro à chaque zone sélectionnée en cliquant sur le numéro sous l’étiquette de l’élément de menu. Cliquez sur L’exportation de fichiers, puis le rapport de région 2D pour exporter les valeurs od pour chaque point de la norme d’étalonnage.

Dans le logiciel d’imagerie propriétaire, utilisez un outil de création de région pour sélectionner la région d’intérêt dans chaque section et mesurer ses OD pour commencer à effectuer la quantification des autoradiogrammes. Sélectionnez la même région dans chaque section en créant un modèle pour la région d’intérêt et copiez-la et ajustez-la aux variations mineures de l’anatomie cérébrale dans chaque autoradiogramme. Par la suite, cliquez sur Rapport de région 2D d’exportation de fichiers pour exporter les valeurs et tailles ROD de zones sélectionnées dans une feuille de calcul.

Déterminer la liaison du radioligand tel qu’il est décrit dans le protocole texte. Dans cette étude, la distribution anatomique des emplacements de liaison de GHB à haute affinité sont visualisées avec le GHB analogique radiolabeled HOCPCA radioactif dans un cerveau de souris qui a été coupé en sections coronal, sagittale, et horizontale. Des niveaux élevés de liaison sont observés dans l’hippocampe et le cortex tandis que des niveaux de liaison inférieurs sont observés dans le striatum et aucune liaison n’est détectée dans le cervelet.

Comme indiqué ici, les structures anatomiques peuvent être visualisées à l’aide de différents plans et l’intégrité anatomique peut être soutenue par la coloration violette crésyle. Des autoradiogrammes représentatifs d’un rat, d’une souris et d’un porc illustrent la conservation évolutive des sites de liaison ghb à haute affinité dans le cerveau des mammifères. Des sites de liaison radioactifs hocpca sont détectés dans les trois espèces permettant la comparaison de l’anatomie brute du cerveau entre eux.

Les sites de liaison ghb à forte affinité sont sondés avec des radioligands GHB qui présentent des affinités différentes pour les sites de liaison, mais des activités spécifiques comparables. Radioactive HOCPCA est doté d’une sensibilité élevée et d’un excellent rapport signal/bruit. En raison de la sensibilité plus faible du NCS-382 radioactif, des concentrations plus élevées de radioligand doivent être utilisées afin d’obtenir des niveaux similaires de liaison.

Des concentrations de radioligands encore plus élevées sont nécessaires pour que le GHB radioactif atteigne des niveaux de liaison comparables. Toutefois, des concentrations plus élevées de radioligands augmentent également le niveau de liaison non spécifique avec un rapport signal/bruit par conséquent plus faible. Il est important d’optimiser les conditions d’analyse comme la concentration de radioligand, le lavage et le temps d’exposition afin d’obtenir le meilleur signal aux rapports de bruit et il est également très important de se rappeler d’effacer la plaque avant.

La procédure peut être étendue à des conditions in vivo pour avoir une idée sur la liaison composée chez un animal vivant qui pourrait être utile pour des projets de découverte. N’oubliez pas de travailler dans un laboratoire avec des matières radioactives certifiées pleines et de porter des vêtements de protection lors de la manipulation de la radioactivité ou du paraformaldéhyde.