Name: COLLETOTRICHUM fioriniae Développement dans l’eau et des extraits floraux axée sur le chloroforme aux bleuets et aux canneberges (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Découvrez un protocole économique pour étudier le développement de Colletotrichum fioriniae à l'aide d'extraits floraux chloroformiques et aqueux de bleuets et canneberges. Cette méthode permet de surveiller en temps réel les interactions hôte-pathogène.

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Nous remercions les Haines de William S., SR. doué Cranberry Research Fund et New Jersey Blueberry et Cranberry Research Council, Inc. pour la prise en charge. Nous remercions également Jennifer Vaiciunas (conseils et préparations florales), Christine Constantelos (culture fongique et préparations florales), David Jones (préparations florales et extractions), Langley Oudemans (préparations florales, tournage/photographie), Jesse Lynch (préparations florales), Roxanne Tumnalis (appui général) et nombreux stagiaires étudiant/été.

<ol><li>Pszczółkowska, A., Okorski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+report+of+anthracnose+disease+caused+by+Colletotrichum+fioriniae+on+blueberry+in+western+Poland%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">First report of anthracnose disease caused by Colletotrichum fioriniae on blueberry in western Poland.</a> Plant Disease. 100, 2167(2016).</li>
<li>Oudemans, P. V., Caruso, F. L., Stretch, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranberry+fruit+rot+in+the+northeast%3A+a+complex+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">Cranberry fruit rot in the northeast: a complex disease.</a> Plant Disease. 82, 1176-1184 (1998).</li>
<li>Damm, U., Cannon, P. F., Woudenberg, J. H. C., Crous, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Colletotrichum+acutatum+species+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Studies+in+Mycology%22%5BJournal%5D)">The Colletotrichum acutatum species complex.</a> Studies in Mycology. 73, 37-113 (2012).</li>
<li>Marcelino, J., Giordano, R., Gouli, S., Gouli, V., Parker, B. L., Skinner, M., TeBeest, D., Cesnik, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colletotrichum+acutatum+var.+fioriniae+%28teleomorph%3A+Glomerella+acutata+var.+flioriniae+var.+nov.%29+infection+of+a+scale+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologia%22%5BJournal%5D)">Colletotrichum acutatum var. fioriniae (teleomorph: Glomerella acutata var. flioriniae var. nov.) infection of a scale insect.</a> Mycologia. 100, 353-374 (2008).</li>
<li>Pennycook, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colletotrichum+fioriniae+comb.+%26+stat.+nov.%2C+resolving+a+nomenclatural+muddle%5BTitle%5D)+AND+%22Mycotaxon%22%5BJournal%5D)">Colletotrichum fioriniae comb. & stat. nov., resolving a nomenclatural muddle.</a> Mycotaxon. 132, 149-154 (2017).</li>
<li>Shivas, R. G., Tan, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+taxonomic+re-assessment+of+Colletotrichum+acutatum%2C+introducing+C.+fioriniae+comb.+et+stat.+nov+and+C.+simmondsii+sp+nov%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Diversity%22%5BJournal%5D)">A taxonomic re-assessment of Colletotrichum acutatum, introducing C. fioriniae comb. et stat. nov and C. simmondsii sp nov.</a> Fungal Diversity. 39, 111-122 (2009).</li>
<li>Wharton, P. S., Diéguez-Uribeondo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+Colletotrichum+acutatum%5BTitle%5D)+AND+%22Anales+del+Jard%C3%ADn+Bot%C3%A1nico+de+Madrid%22%5BJournal%5D)">The biology of Colletotrichum acutatum.</a> Anales del Jardín Botánico de Madrid. 61, 3-22 (2004).</li>
<li>Prusky, D., Alkan, N., Mengiste, T., Fluhr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quiescent+and+necrotrophic+lifestyle+choice+during+postharvest+disease+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Quiescent and necrotrophic lifestyle choice during postharvest disease development.</a> Annual Review of Phytopathology. 51, 155-176 (2013).</li>
<li>Milholland, R. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMilholland%2C+RD+%22Compendium+of+Blueberry+and+Cranberry+Diseases%22">Compendium of Blueberry and Cranberry Diseases</a>. , American Phytopathological Society. St. Paul, MN. (1995).</li>
<li>DeMarsay, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Anthracnose+fruit+rot+of+highbush+blueberry%3A+biology+and+epidemiology%22">Anthracnose fruit rot of highbush blueberry: biology and epidemiology</a>. , Rutgers University. New Brunswick, NJ. Dissertation (2005).</li>
<li>Madden, L. V., Yang, X. S., Wilson, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+rain+intensity+on+splash+dispersal+of+Colletotrichum+acutatum%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Effects of rain intensity on splash dispersal of Colletotrichum acutatum.</a> Phytopathology. 86, 864-874 (1996).</li>
<li>Yang, X., Madden, L. V., Wilson, L. L., Ellis, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+surface-topography+and+rain+intensity+on+splash+dispersal+of+Colletotrichum+acutatum%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Effects of surface-topography and rain intensity on splash dispersal of Colletotrichum acutatum.</a> Phytopathology. 80, 1115-1120 (1990).</li>
<li>Wharton, P. S., Dickman, J. S., Schilder, A. M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+spore+release+by+Colletotrichum+acutatum+in+Michigan+blueberry+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Timing of spore release by Colletotrichum acutatum in Michigan blueberry fields.</a> Phytopathology. 92, 86(2002).</li>
<li>MacKenzie, S. J., Peres, N. A., Timmer, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonization+of+citrus+leaves+and+secondary+conidiation+response+to+citrus+flower+extracts+by+non-postbloom+fruit+drop+strains+of+Colletotrichum+acutatum%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Colonization of citrus leaves and secondary conidiation response to citrus flower extracts by non-postbloom fruit drop strains of Colletotrichum acutatum.</a> Tropical Plant Pathology. 35, 333-342 (2010).</li>
<li>Leandro, L. F. S., Gleason, M. L., Nutter, F. W., Wegulo, S. N., Dixon, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strawberry+plant+extracts+stimulate+secondary+conidiation+by+Colletotrichum+acutatum+on+symptomless+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Strawberry plant extracts stimulate secondary conidiation by Colletotrichum acutatum on symptomless leaves.</a> Phytopathology. 93, 1285-1291 (2003).</li>
<li>Waller, T. J., Vaiciunas, J., Constantelos, C., Oudemans, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+the+blueberry+floral+extracts+influence+secondary+conidiation+and+appressorial+formation+of+Colletotrichum+fioriniae%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Evidence the blueberry floral extracts influence secondary conidiation and appressorial formation of Colletotrichum fioriniae.</a> Phytopathology. 108, 561-567 (2017).</li>
<li>Gager, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+influence+of+cranberry+floral+wax+on+appressorium+formation+in+Colletotrichum+fioriniae%22">The influence of cranberry floral wax on appressorium formation in Colletotrichum fioriniae</a>. , Rutgers University. New Brunswick, NJ. Masters thesis (2015).</li>
<li>Podila, G. K., Rogers, L. M., Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+signals+from+avocado+surface+wax+trigger+germination+and+appressorium+formation+in+Colletotrichum+gloeosporioides%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chemical signals from avocado surface wax trigger germination and appressorium formation in Colletotrichum gloeosporioides.</a> Plant Physiology. 103, 267-272 (1993).</li>
<li>Polashock, J. J., Caruso, F. L., Oudemans, P. V., McManus, P. S., Crouch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+North+American+cranberry+fruit+rot+fungal+community%3A+a+systematic+overview+using+morphological+and+phylogenetic+affinities%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">The North American cranberry fruit rot fungal community: a systematic overview using morphological and phylogenetic affinities.</a> Plant Pathology. 58, 1116-1127 (2009).</li>
<li>Miller, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V-8+juice+agar+as+a+general+purpose+medium+for+fungi+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">V-8 juice agar as a general purpose medium for fungi and bacteria.</a> Phytopathology. 45, 461-462 (1955).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les essais biologiques sur la détection de la réponse de c. fioriniae aux extraits floraux (FEs) ont été développées pour le bleuet et la canneberge fruit rot pathosystems mais peut être facilement adaptée à d’autres cultures horticoles. Le protocole décrit ci-dessus a été précieux dans l’acquisition de plusieurs ensembles de données importants y compris, mais sans s’y limiter : des effets sur plusieurs isolats de nombreux pathogènes, temps d’informations se rapportant à des stades de croissance fongique en présence de FEs divers, FE comparaison des techniques d’extraction, inspection des produits chimiques individuels sur fioriniae c. croissance et la différenciation, évaluation des organes individuels fleur extraits, effets de la température sur le c. fioriniae , tandis qu’en présence de FE, effets de phénologie cire dépendant extractions et les effets de l’eau de pluie floral. Grâce à l’utilisation de ces techniques, les données générées ont fourni une compréhension beaucoup plus claire de la vie de c. fioriniae met en scène et élucide partiellement pourquoi la période de floraison est cruciale pour le contrôle de nombreux fruits pourris des agents pathogènes.
Au départ, toutes les fleurs ont été traités identiquement à l’active-FE, mais le procédé d’extraction a déménagé vers l’utilisation des fleurs entières. Dissection florale était beaucoup de temps et avait très peu d’effet sur la bioactivité de la FEs qui en résulte. Cependant, certains organes floraux peuvent et ont été évalués à l’aide de ce protocole, mais beaucoup de soin doit être pris à ne macérer pas complètement les tissus floraux (Supplemental Movie 1avec précautions détaillées dans étape 2.3), car cela peut entraîner libéré composés de champignons toxiques/statique dans le FE qui risquent de fausser l’évaluation microscopique. Moins les extractions envahissantes comme le pass -FE (2 film supplémentaire) et FE-rw sont plus favorables en raison de leur facilité d’acquisition. En outre, ces techniques d’extraction nécessitent seulement une filtration sous vide afin d’acquérir des signaux chimiques biologiquement actifs florales.
Les fleurs utilisées dans toutes les extractions ont été généralement réfrigérés pour les 0-3 jours avant la préparation de l’extrait. Une contestation de ce protocole est la gestion du temps du chiffre d’affaires de FE (collection de champs grâce au stockage des extraits). Cela a été exacerbée par les nombreux échantillons provenant de plusieurs sources et les dates. Gelée de fleurs n’ont pas été évalués de façon réelle, comme décongelé noud détériorées et décoloré. Cependant, une fois que la FEs à base d’eau ont été préparés, répétés de gel et de dégel n’a montré aucun effet sur la bioactivité de la FE, donc aussi longtemps que le FE sont recongelés rapidement après la préparation de l’essai biologique (FE 3 an viable).
Chloroforme d’extraction permet l’étude des réponses de pathogène à cires surface tridimensionnelle floral/fruits dans un plan à deux dimensions par évaporation de ch-FE sur couvre-objet en verre. Toutefois, il est peu probable que les structures cristallines réelles des cires déposés de la ch-FE sont identiques à la surface, d'où ils ont été recueillis. Intentionné, complémentaires des techniques devraient être appliquées si réponse fongique à cire spécifiques structures in vivo est le principal objectif de l’enquête. Axée sur le chloroforme extraits ont besoin d’entretien stockage plus que les extractions à base d’eau. En plus de conserver le ch-FE extraits dans l’obscurité, la culture de cellules PTFE bordée tube casquettes et parafilm étanchéité wrap besoin d’être régulièrement vérifiée pour des fuites par évaporation et remplacé si nécessaire.
Le concept de contrôle de floral de l’écoulement des eaux est enraciné dans l’idée de faire progresser les outils de surveillance spécifique de la maladie. Les dispositifs de collecte d’eau de pluie peuvent être adaptés à beaucoup d’autres architectures végétales, tant que le dispositif de prélèvement capte l’eau de pluie qui a couru hors de fleurs. Cette approche fournit des informations sur si oui ou non stimulation florale est présente sur le terrain à un moment donné et peut être surveillée tout au long de la saison. Alternativement, des dispositifs de collecte peuvent être déployés sur plusieurs sites de la canopée pour déterminer dans quelle mesure florales repères ont été lavés pendant tout mouillage-événement. À l’avenir des expériences, rw-FE dictera quand les applications de fongicides devraient commencer et quand ils se terminent en toute sécurité. De plus, en surveillant les extractions de cire dépendant de phénologie (protocole, article 9), l’importance de la période de floraison à la biologie de l’agent pathogène est devenu encore plus évident. Cet article a été également inclus pour démontrer la flexibilité de ces tests biologiques, fournit également des méthodes qui permettent la comparaison by-side de cires de surface hôte qui sont séparés dans le temps. Les données générées en utilisant les techniques d’extraction floral et dosages biologiques représentent des indicateurs tangibles de stimulation de l’agent pathogène, les classes chimiques spécifiques importants de biologie de l’agent pathogène et de cibles pour les stratégies futures de lutte.

COLLETOTRICHUM fioriniae provoque une pourriture des fruits de bleuet en corymbe (Vaccinium corymbosum L.) et le grand américain Cranberry (V. macrocarpon Aiton)1,2. Ce pathogène a été récemment délimité de la c. acutatum espèce complexe3,4,5,6 et est un agent causal de l’anthracnose du bleuet et membre de la pourriture du fruit de canneberge complexe, en plus de causer de nombreuses autres plantes des maladies dans le monde7. C. fioriniae a un hemibiotrophic latente, mode de vie8, souffrant d’infections survenant au cours du développement de bloom et symptôme ne pas évident jusqu'à ce que les fruits soient en phase finale de maturation9. Dans le bleuet et la canneberge, pourriture des fruits est seulement maîtrisée avec des applications de fongicides réalisées pendant la période de floraison. L’agent pathogène hiverne au bleuet dormants bourgeon floral échelles10 et sporule pendant la floraison. Les conidies sont déplacés tout au long de la voile par les éclaboussures de pluie dispersion11,12 et accumulation de l’inoculum a été fortement corrélée à la période de floraison13. Réponse de Colletotrichum espèces aux fleurs de l’hôte n’est pas unique à Vaccinium, fleurs sont importants composants des fruits de citrus post floraison drop (PFD)14 , mais aussi fraise anthracnose15, dans les deux cas causant l’agent pathogène à sporuler. Tous ces cas soulignent la nécessité de méthodes efficaces pour évaluer la dynamique temporelle des signaux chimiques florales sur c. fioriniae et autres agents pathogènes qui infectent pendant la floraison. Les renseignements fournis par les méthodes décrites ici sont de plus en plus plus précieux.
Ce protocole détaille les méthodes d’approvisionnement extrait floral (FE) et guide de l’évaluation des réponses de c. fioriniae à FE via verre couvre-objet bioessais15,16. Les techniques d’extraction floral sont divisées en deux types principaux ; extractions à base d’eau (actif-FE, passive (pass -FE) et champ axée sur l’eau de pluie (rw-FE)) et les extractions de17 axée sur le chloroforme (ch-FE). Les extractions aqueux permettant l’inspection des signaux chimiques floral eau mobilisée. Ces repères mobilisés sont des éléments importants susceptibles de la Cour de l’infection, puisque FE augmente considérablement la vitesse de l’infection à16, en plus de fournir l’humidité nécessaire pour l’infection de se produire. En outre, ils représentent un état plus naturel comme stimulation florale peut être lavée tout au long de la voile au cours du mouillage-événements comme déjà observée dans les bleuets et autres cultures systèmes14,16. Les extractions florales axée sur le chloroforme (ch-FE) fournissent également des informations précieuses relatives à la réponse de pathogènes à la surface de l’hôte cires17,18, élucider les premiers stades de croissance des conidies, une fois déposés sur sensibles organes de l’hôte (ovaires,c'est-à-dire de fleurs et fruits en développement). Réponse de pathogène aux changements saisonniers dans les cires surface hôte peut être également surveillée à l’aide de ce protocole. En conséquence, les essais biologiques sont conçus pour travailler avec FE aqueux ou FE axée sur le chloroforme pour atténuer les différences inhérentes entre ces deux matériaux.
Les données générées par les bio-essais ont révélé que les extractions aqueux stimulent des niveaux plus élevés de conidies secondaires que les extractions axée sur le chloroforme où il y avait une réponse définitive appressorium, donc impliquant plusieurs composés présent dans le FE. Fait intéressant, les deux de ces réactions de croissance ont été observées quand à l’aide d’eau de pluie qui avait couru hors de fleurs de bleuet et la canneberge, indiquant plusieurs composés stimulants peut être lavé à la surface des fleurs. Ainsi, suivi de stimulation florale se donnent un aperçu de la probabilité de succès de pathogène dans un système agricole.
Le but ultime de ce protocole est de fournir une méthodologie de production information biologique de base sur les agents pathogènes fongiques des plantes en réponse à des signaux chimiques florales ainsi que responsable méthodologies qui peuvent utiliser cette information florale pour aider à les maladies propres au site gestion et les processus décisionnels.

<table><tbody><tr><td>0,22 et micro ; m taille des pores, filtre stérilisant en acétate</td><td>VWR</td><td>101102-280</td><td>Clarification de l’extrait floral de myrtille (FE)&nbsp ;</td></tr><tr><td>200-1000 et micro ; l pipette avec pointes</td> <td>-</td><td></td> <td>Équipement, toute marque dans la portée sera adéquate</td></tr><tr><td>40-200 & micro ; l pipette avec pointes</td> <td>-</td><td></td> <td>Équipement, toute marque à portée sera adéquate</td></tr><tr><td>5-40 & micro ; l pipette avec pointes</td><td>-</td><td>-</td><td>L’équipement, toute marque à portée sera adéquate</td></tr><tr><td>Pistolet à air comprimé gobelet de peinture jetable avec adaptateur de connexion&nbsp ;</td><td>Harbor Freight</td><td>97098</td><td>Eau de pluie aux myrtilles (rw-)Collecte FE</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Amsco</td><td>3011</td><td>Équipement, préparation</td></tr><tr><td>des supports Tapis en treillis de bar (feuille de maille en plastique)</td><td>Winco</td><td>BL-240</td><td>Passive (pass)-FE collection</td></tr><tr><td>Minuterie de paillasse</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-662-47</td><td>Équipement, préparation EF</td></tr><tr><td>Tuyau à pression/vide noir</td><td>VWR</td><td>62994-795</td><td>Composant de filtre à vide</td></tr><tr><td>Entonnoir Buchner</td><td>Coors USA</td><td>60240</td><td>Composant de filtre à vide, accepte les disques en papier filtre de 55 mm</td></tr><tr><td>Bec Bunsen&nbsp ; &nbsp ;</td><td>-</td><td>-</td><td>Equipement</td></tr><tr><td>Carbonate de calcium</td><td>Fisher Scientific</td><td>C64-500</td><td>Composant de média</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Sorvall&nbsp ;</td><td>RC 5B Plus</td><td>Équipement</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger (15 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-527-90</td><td>Équipement</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger (50 ml)</td><td>VWR</td><td>10025-694</td><td>Équipement, collecte rw-FE</td></tr><tr><td>Étamine (grade 50)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS240</td><td>Équipement, préparation EF</td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>VWR</td><td>JT9175-3</td><td>Produit chimique, trichlorométhane : qualité d’essai, &ge ; Gélose à la semoule de maïs (CMA) pure à 99 %, pour la biologie moléculaire, sans peroxydeFisher</td></tr> <tr><td></td><td>Scientific</td><td>B11132</td><td>&nbsp ; Média prémélangé, stockage isolé sur des pentes</td></tr><tr><td>Coloration bleu de coton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61335</td><td>Lactophénol colorant bleu de coton</td></tr><tr><td>Difco Agar</td><td>VWR</td><td>90004-032</td><td>Composant de média</td></tr><tr><td>Perceuse à colonne</td><td></td> <td>Delta-Equipment</td><td>, collection rw-FE</td></tr><tr><td>EASYpure LF Eau ultrapure</td><td>Barnstead</td><td>D738</td><td>Équipement, source d’eau désionisée</td></tr><tr><td>Éthanol (95 %)</td><td>-</td><td>-</td><td>Flacon filtrant chimique</td></tr><tr><td>(500 ml)</td><td>Pyrex</td><td>n° 5340</td><td>Composant du filtre</td></tr><tr><td>à vide Hotte</td><td>Hamilton-Equipment</td><td></td><td>, utilisation du chloroforme</td></tr><tr><td>Entonnoir (7 X 7 cm)&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>60820-110</td><td>Cranberry rw-FE collection, préparation EF</td></tr><tr><td>Générique lame de verre&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-101</td><td>Bioassay</td></tr><tr><td>conductance Flacon pulvérisateur générique en plastique</td><td>VWR</td><td>16126-454</td><td>pass-FE collection, capacité d’au moins 250 ml</td></tr><tr><td>Tubes de culture cellulaire en verre</td><td></td><td>--</td><td>Stockage des lamelles en verre ch-FE</td></tr><tr><td>(22 x 22 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542B</td><td>Bioessaiy</td></tr><tr><td>conductance Cellules de Van Tieghem (tubes en verre taillés à la main)</td><td>- </td><td>-</td><td>Essai biologique au chloroforme (ch)-FE, (8 mm OD 6 mm ID)</td></tr> <tr><td>Pipette en verre (1-100 & micro ; l)</td><td>Hamilton Co. Inc.</td><td>#710</td><td>Essai biologique ch-FE</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>Lactophénol coton-bleu tache</td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td>Bright-Line</td><td>5971R10</td><td>Équipement</td></tr><tr><td>Acide lactique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W261106</td><td>Lactophénol coton-bleu Capot</td></tr> à <tr><td>flux laminaire</td><td>Labconco</td><td>3730400</td><td>Équipement, environnement de travail stérile</td></tr><tr><td>Sonde métallique (générique)&nbsp ;</td><td>-</td><td>-</td><td>Équipement&nbsp ;</td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation (2 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td>Stockage et préparation des mélanges de traitement aqueux</td></tr><tr><td>Microscope, Leica DMLB</td><td>Leica</td><td>020-519.010</td><td>Équipement</td></tr><tr><td>Mortier (céramique)</td><td>Coors USA</td><td>60313</td><td>Composant de filtre</td></tr><tr><td>à vide Gants en nitrile&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-130-1597D</td><td>Collection de fleurs</td></tr><tr><td>Disques en papier (essuie-tout coupés)</td><td>Notions de base</td><td>KCC01510</td><td>le contrôle de l’humidité dans les essais biologiques</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>Film de paraffine en plastique&nbsp ;</td></tr><tr><td>Pilon (céramique)</td><td>Coors USA</td><td>60314</td><td>Composant du filtre sous vide</td></tr><tr><td>Cristaux de phénol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A92-100</td><td>Lactophénol coton-bleu</td></tr><tr><td>Sacs en plastique (~100 mm X 152 mm)</td><td>Uline</td><td>S1294</td><td>Équipement, réfrigération des fleurs</td></tr><tr><td>Plats de culture cellulaire en plastique (9 cm de diamètre)&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>(boîte de Pétri),</td></tr><tr><td>capsules doublées de polytétrafluoroéthylène (PTFE) à conductance biologique&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>60927-228</td> Stockage des béchers en Pyrex <td>ch-FE</td></tr><tr><td>(100 ml)</td><td>Pyrex</td><td>n° 1000</td><td>Préparation du moule à pain en</td></tr><tr><td>Pyrex</td><td></td> <td>ch-FE--</td><td>pass-FE collection</td></tr><tr><td>Cylindre gradué en Pyrex</td><td>-</td><td>-</td><td>Équipement, préparation EF</td></tr><tr><td>Récipient en plastique scellé (30 mm X 13 mm X 7 mm)&nbsp ;</td><td>-</td><td>-</td><td>Conductance de bioessai</td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection pointus Fisher</td><td>Scientific</td><td>8940</td><td>Équipement, pour couper des disques d’étamine et de papier</td></tr><tr><td>Passoire à mailles en acier inoxydable</td><td>VWR</td><td>470149-756</td><td>Préparation du foret étagé ch-FE</td></tr><tr><td>(foret étagé)</td><td>Dewalt-Equipment</td><td></td><td>, collecte rw-FE</td></tr><tr><td>Boucle stérile (boucle combinée)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-602&nbsp ;</td><td>Préparation de la culture</td></tr><tr><td>Fil téléphonique (fils internes)</td><td>-</td><td>-</td><td>Myrtille rw-FE collection</td></tr><tr><td>Panier en tube à essai&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>470137-792</td><td>Substitution facilement disponible pour le panier en maille plastique [fraise]&nbsp ;</td></tr><tr><td>V8 Juice</td><td>Campbell’s Soup</td> <td>Company-Composant</td> <td>de média fongique</td></tr><tr><td>Paniers en maille de plastique vintage [fraises] Collection</td><td>Donation-pass-FE</td><td></td>, <td>peut remplacer le panier en éprouvette (470137-792)</td></tr><tr><td>Vortex Genie (Vortex)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td>Préparation de la suspension de spores</td></tr><tr><td>Whatman No. 1 Qualitatif Cercles de 55 mm</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td>Composant de filtre à vide Colliers</td></tr> de <tr><td>serrage en plastique blanc (100 mm)</td><td>Uline</td><td>S-566W</td><td>Cranberry rw-FE collection</td></tr></tbody></table>

colletotrichum fioriniae développement dans l’eau et des extraits floraux axée sur le chloroforme aux bleuets et aux canneberges

Colletotrichum fioriniae Development in Water and Chloroform-based Blueberry and Cranberry Floral Extracts

Pour surveiller avec précision la phénologie de la période de floraison et de la dynamique temporelle des signaux chimiques florales sur champignons fruits pourris des agents pathogènes, ont élaboré des méthodes d’extraction floral et lamelle bioessais utilisant Colletotrichum fioriniae. Bleuet et la canneberge, cet agent pathogène est parfaitement contrôlé par application de fongicides au cours de la période de floraison en raison du rôle de fleurs dans les premiers stades de l’infection. Le protocole détaillé ici décrit comment florales extraits (FE) ont été obtenues à l’aide de l’eau - chloroforme- et méthodes de terrain axée sur l’eau de pluie pour un usage ultérieur dans les essais biologiques lamelle de verre correspondant. Chaque FE a servi à fournir un ensemble différent d’informations : réponse de c. fioriniae à mobilisé chimique floral cues dans l’eau (à base d’eau), réponse de pathogène à fleur et fruit surface cires (axée sur le chloroforme) et sur le terrain suivi de recueillies floral eau de pluie, se déplaçant en vitro observations au milieu agricole. Le FE est largement décrite comme soit - ou chloroforme-à base d’eau, avec un bioessai appropriée décrite pour compenser les différences inhérentes entre ces deux matériaux. Eau de pluie qui avait couler de fleurs a été capturé dans les dispositifs uniques pour chaque culture, faisant allusion à la souplesse et l’application de cette approche pour d’autres systèmes de culture. Les tests biologiques sont rapides, peu coûteux et simple et offrent la possibilité de générer des informations spatio-temporelles et in sites sur la présence de stimulateurs florales composés provenant de diverses sources. Cette information en fin de compte mieux éclaireront des stratégies de gestion de la maladie, que FE réduire le temps nécessaire pour l’infection de se produire, donnant ainsi un aperçu en changeant les risques d’infection par des pathogènes pendant la saison de croissance.

Les résultats présentés ici sont quelques exemples des nombreux essais qui peuvent être effectuées à l’aide de cette méthodologie. La figure 1 est un guide illustré de l’essai biologique de FE à base d’eau et est complétée par la Figure 2 , qui fait suite à l’essai biologique du FE axée sur le chloroforme. La figure 3 fournit un guide visuel de ce qui peut être attendu lors de l’évaluation microscopique de c. fioriniae à 24 h, dans les deux essais biologiques sur aqueux et à base de chloroforme (comparativement SDW contrôles). Figure 4 détaille une étude temporelle de 24h avec c. fioriniae en présence de la variété canneberge « Stevens » ch-FE et donne des repères visuels à un résultat de l’importation de cette recherche : FE a réduit le temps nécessaire pour former des structures de l’infection par rapport à SDW. Figure 5 donne un exemple de données recueillies auprès d’un bioessai lamelle couvre-objet à l’aide de ruissellement de pluie floral cranberry (CB « Fleur » rw-FE). La figure 6 représente un autre résultat important : ovaire floral ch-FE est beaucoup plus stimulant que les fruits FE-ch, ce qui indique l’importance de la floraison du cycle de vie de c. fioriniae. Les photos supplémentaires et les films fournissent visuels importants des fleurs utilisées dans les extractions et les eaux pluviales floral collection appareils/déploiement, en plus des films que de visualiser la (extraction active et passive- procédés à base d’eau).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig1.jpg"> Figure 1 : Aperçu général de la base d’eau florale extrait biologique (FE). Ce test a été utilisé pour les extraits floraux aqueux avec des fleurs de bleuet et de canneberge : active -floral extraits (active-FE), passive -floral extraits (pass-FE) et le ruissellement de l’eau de pluie floral (rw-FE). Le - FE partie constitue généralement le facteur expérimental/variable. A l’inverse la - FE partie peut rester constant et temps points/heures après l’inoculation peut être évaluée. Préférence a été déposée vers 4 analyse de champ à un grossissement de 200 X. Abréviations : Eau désionisée stérile, SDW ; Surface / champ de vision, A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig1large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig2.jpg"> Figure 2 : Aperçu général des axée sur le chloroforme floral extrait biologique (ch-FE). Ce test a été utilisé pour les bleuets et les canneberges (fleurs, fruits et ovaires). Qu’un seul type de mélange aqueux de traitement a été utilisé dans cet essai, la suspension de spores partie 1 à 2 parties SDW (pour garder la concentration conidienne cohérente en raison de l’évaporation de ch-FE). Ce test permet de comparer plusieurs ch-FE (cires de diverses surfaces végétales), ou plusieurs temps points/heures après l’inoculation à l’aide d’un seul ch-FE. Abréviations : Eau désionisée stérile, SDW ; Cellules Van Tieghem [verre] VanT. cellule. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig3.jpg"> Figure 3 : Comparaison visuelle des Colletotrichum fioriniae en présence de FE à base d’eau et ch-FE. Dans ce bleuet dosage « Bluecrop » (active-FE, à base d’eau) (isolat fongique : BB #10) et canneberge « Stevens » axée sur le chloroforme (ch-FE) (isolat fongique : CB-PMAP182) extraits floraux ont été comparés aux contrôles SDW. Une augmentation spectaculaire de la conidiation secondaire (anneaux) et formation de l’appressorium (pointes de flèche) ont été observés lors de la comparaison des conidies en présence de SDW (control) (A) d’actif-FE (B) à l’inoculation après 24h. Toutefois, la conidiation secondaire n’était pas aussi apparente lorsque l'on compare le chloroforme bioessai SDW contrôle (C) ch-FE (D); au contraire, c. fioriniae de croissance s’est déplacée vers la formation de l’appressorium. Montré est une réponse commune à chaque type d’extraction, à base d’eau et base chloroforme, peu importe l’espèce hôte/floral décrit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig4.jpg"> Figure 4 : Étude de l’évolution temporelle (24h) avec Colletotrichum fioriniae en présence de FE-ch. Dans ce test, un contrôle de SDW (A-D) et de la canneberge « Stevens » ch-FE (E-F) ont été inspectés visuellement à 0, 6, 12 et 24 heures après l’inoculation (un exemple de points dans le temps variable au lieu de comparer plusieurs FE). Formation de l’appressorium (pointes de flèches) a commencé à 6 h dans la ch-FE et régulièrement augmenté au cours de périodes ultérieures. Ce résultats échappe à un facteur important de la biologie de l’agent pathogène pendant la période de floraison : fleurs réduisent le temps nécessaire pour former des structures de l’infection. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig5.jpg"> Figure 5 : Affichage graphique des données recueillies à l’aide de rw-FE dans un essai biologique. L’eau de pluie exécuter hors de canneberges fleurs (CB « Fleur » rw-FE) et des eaux de pluie vierge qui n’avait pas touché tout les tissus végétaux canneberge (« Ground » rw-FE) un événement unique en mouillant plus un standard active, canneberge floral extrait aqueux (CB active -FE) (contrôle positif) et SDW (témoin négatif) ont été soumis à un essai biologique à base d’eau lamelle et évaluées pour la croissance de c. fioriniae . CB « Fleur » rw-FE avait le même niveau de formation conidiation et appressorium secondaire comme le standard CB actif-FE à post-inoculation 24h, ce qui indique que les dispositifs de collecte ont été efficaces dans la capture des stimulants florales libérées pendant une mouillage-événement. Conidies totales est composé de primaire (dépôt), les conidies et les conidies secondaires nouvellement formés. Lettres indiquent des différences significatives à p &lt; 0,05 selon différence significative moins de Fischer d’essai (LSD) ; conidies en majuscules, totales ; minuscule, appressoria. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig6.jpg"> Figure 6 : Canneberge phénologie basée ch-FE bioessai, inspection visuelle à. Gestion de la maladie pour les fruits pourris des champignons souvent agit de floraison temps fongicide demandes. Ici, canneberges extraits axée sur le chloroforme (ch-FE) de plusieurs stades de croissance de la canneberge (« Stevens ») ont été visuellement évalués pour l’effet de surfaces cires sur c. fioriniae à l’inoculation après 24h. Ovaires prélevés en juin (A), les fruits non mûrs récoltés en juillet et août (B, C), récoltes de fruits récoltés en octobre (D)et un contrôle SDW (E) ont été inspectés pour la formation de l’appressorium (pointes de flèche). Ovaire ch-FE avait la plus grande magnitude de formation de l’appressorium, indiquant que la phénologie de cette plante (fleur) est essentiel pour le cycle de vie de c. fioriniae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig6large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig1.jpg"> Supplémentaire Figure 1 : inflorescence : Blueberry. Fleurs de bleuet ont été recueillies pour les extractions en pleine floraison (avril-mai dans le New Jersey, USA) (montrées « Bluecrop »). Notez le chevauchement des corolles/ovaires de fleurs adjacents et l’architecture globale de l’inflorescence, par rapport à la Figure 2 (canneberge verticale). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig2.jpg"> Supplémentaire Figure 2 : canneberge dressées. Canneberges fleurs ont été recueillies pour les extractions en pleine floraison (juin-juillet dans le New Jersey, USA) (montrées « Stevens »). Remarque les étapes de fleurs variées sur une seule inflorescence canneberge (verticale) et le crochet, goutte d’eau conservant la forme de la corolle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Supplemental Figure 3" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig3.jpg"> Supplémentaire Figure 3 : déploiement de l’eau de pluie de bleuets (fleur). Terminé-bleuet pluie floral collection dispositif, placé directement sous un cluster des inflorescences. Notez le fil plastifié à orienter verticalement l’appareil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Supplemental Figure 4" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig4.jpg"> Supplémentaire Figure 4 : déploiement de l’eau de pluie de bleuets (tige). Dispositif de prélèvement de l’eau de pluie floral bleuet remplie, placé à mi-chemin vers le bas de la tige entre une inflorescence et la couronne de la brousse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Supplemental Figure 5" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig5.jpg"> Supplémentaire Figure 5 : déploiement de l’eau de pluie de bleuets (couronne). Complété le dispositif de collecte des eaux florales bleuet, placé à la base de la brousse (couronne). Remarque les fils enrobés en plastique peuvent être retirés si pas nécessaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Supplemental Figure 6" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig6.jpg"> Supplémentaire Figure 6 : déploiement de l’eau de pluie de bleuets (sol). Complété le dispositif de collecte des eaux pluviales vierge, placée à côté de bleuetiers. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig6large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Supplemental Figure 7" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig7.jpg"> Supplémentaire Figure 7 : déploiement de l’eau de pluie aux canneberges (close-up). Terminé-dispositif de canneberge pluie floral de collection, avec deux échelles repliées sous les attaches croisées soigneusement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig7large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Supplemental Figure 8" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig8.jpg"> Supplémentaire Figure 8 : déploiement de l’eau de pluie canneberge. Multiple complété appareils canneberge pluie floral déployés dans une tourbière. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig8large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Supplemental Movie 1" src="/files/ftp_upload/58880/58880supmovie1.jpg"> Supplémentaire 1 film : actifs, à base d’eau florales extracts (active -FE). Prise en charge vidéo supplémentaire suivant étapes 2.3-2.5.1. Myrtille « Bluecrop » fleurs étaient utilisées. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/active-FEextraction.mp4" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)</a>
<img alt="Supplemental Movie 2" src="/files/ftp_upload/58880/58880supmovie2.jpg"> 2 film supplémentaire : Passive, extraits floraux aqueux (pass-FE). Support complémentaire de la vidéo qui suit les étapes 3.3-3.4. Myrtille « Bluecrop » fleurs étaient utilisées. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/pass-FEextraction.mp4" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)</a>
<img alt="Supplemental Movie 3" src="/files/ftp_upload/58880/58880supmovie3.jpg"> Supplémentaire Movie 3 : déploiement des dispositifs de prélèvement de canneberge floral eau de pluie. Support complémentaire de la vidéo qui suit étape 6.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/rw-FEdeployment.mp4" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)</a>

Ici, les essais biologiques conçus pour suivre l’évolution d’un pathogène fongique, Colletotrichum fioriniae, en présence de bleuet ou canneberges extraits floraux sur couvre-objet en verre sont décrites. Eau - chloroforme- et l’eau de pluie de champ - basent florale extraction techniques sont détaillées ainsi que de mieux comprendre comment cette information peut être appliquée.

COLLETOTRICHUM fioriniae Développement dans l’eau et des extraits floraux axée sur le chloroforme aux bleuets et aux canneberges

To accurately monitor the phenology of the bloom period and the temporal dynamics of floral chemical cues on fungal fruit rotting pathogens, floral ...

Ce protocole fournit un système peu coûteux et adaptable pour évaluer la dynamique temporelle des indices fluorochimiques sur Colletotrichum fiorniae et d’autres pathogènes végétaux qui infectent la floraison à terme. De nouveaux dispositifs de collecte de l’eau de pluie au sol permettent à l’utilisateur de surveiller les stimulants naturels et les conditions affectant le développement d’agents pathogènes d’une manière presque en temps réel propre au site. Commencez cette procédure avec une culture de Colletotrichum fiorniae à partir d’un hôte naturellement infecté tel que décrit dans le protocole de texte.Lorsque les colonies commencent à sporulate, conidia strie sur un autre V 8 Juice agar contenant plat de culture cellulaire pour produire une culture de sporulation à haute densité. Après sept jours de croissance, utilisez une boucle stérile standard pour recueillir une petite quantité de conidie de la culture à haute densité en touchant légèrement la boucle à la masse conidiale. Remuez-le dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres contenant 10 millilitres d’eau déionisée stérile.Vortex cet échantillon pendant 10 secondes. À l’aide d’une pipette standard, plongez de haut en bas à de nombreuses reprises pour mélanger davantage l’échantillon. Placez ensuite une goutte de l’échantillon vortexé sur l’hémocytomètre et estimez les concentrations de spores.Ajuster la concentration à 0,1 million de conidies par millilitre d’eau distillée stérile avec un volume final de cinq millilitres. C’est ce qu’on appelle la suspension des spores et n’est effectuée que immédiatement avant l’utilisation dans l’un ou l’autre bioassay. Pour effectuer l’extraction florale à base de chloroforme, nettoyez tous les composants avec 95 % d’éthanol deux fois.Nettoyez ensuite les composants deux fois avec du chloroforme pour éviter la contamination pour chaque extraction. Ne nettoyez pas les bouchons doublés PTFE de chloroforme car cela les endommagera. Après le nettoyage, mettre les composants de côté pour sécher à l’envers.Dans un bécher, mélanger une partie des fleurs transformées en neuf parties de chloroforme en ajoutant des fleurs, puis du chloroforme. Faites pivoter doucement pendant 30 secondes et filtrez à travers un écran en acier inoxydable dans le deuxième bécher. Verser l’extrait à base de chloroforme du deuxième bécher dans le tube de culture du verre et apposer le bouchon PTFE.Envelopper le bouchon avec du parafilm pour éviter l’évaporation. Conservez l’extrait floral à base de chloroforme qui en résulte dans l’obscurité pour réduire la dégradation de la lumière à quatre degrés Celsius jusqu’à une utilisation expérimentale. Répétez les extractions avec plusieurs échantillons pour fournir des répliques.Pour créer un dispositif de collecte pour chaque emplacement sélectionné, utilisez un peu d’étape attaché à une presse de forage pour percer un trou au fond d’une tasse de pulvérisation. Ensuite, couper une ligne droite du haut du trou à la bouche de la tasse de pulvérisation. Percez maintenant quatre trous équidistants assez grands pour enfiler le fil enduit de plastique à l’embouchure de la tasse de pulvérisation.Fixez une extrémité des fils enduits de plastique en laissant une extrémité libre. Percer un trou suffisamment grand pour enfiler le spray de peinture ou l’adaptateur de tasse dans un couvercle de bouchon de centrifugeuse de 50 millilitres. Sceller les fils de l’adaptateur avec du parafilm pour éviter les fuites.Attachez-le à la fois au bouchon de centrifugeuse et à la partie filetée de la tasse du pulvérisateur. Attachez ensuite le tube de centrifugeuse de 50 millimètres. Créez quatre appareils de collecte par lieu d’échantillonnage.Déployer des dispositifs à certains endroits en fléchissant des gobelets de pulvérisateur pour s’adapter aux tiges. Orientez le côté coupé de la tasse de pulvérisateur vers le haut à l’aide des fils enduits en plastique attachés à d’autres tiges. Cela garantit que l’eau qui passe au-dessus des fleurs est capturée.Pour recueillir l’eau de pluie des fleurs de canneberges, la première perforation de chaleur huit trous équidistants autour de la bouche de l’entonnoir à l’aide d’une sonde métallique. Insérez des attaches de torsion dans quatre des trous. Fixez les autres extrémités à l’emplacement opposé de ce trou formant un modèle de croisement soigné.Envelopper l’entonnoir à la vapeur avec du parafilm et réserver. Percer un trou assez grand pour insérer l’entonnoir vers le bas de la tige dans un bouchon de centrifugeuse de 50 millilitres avec un peu d’étape. Insérez l’entonnoir préparé dans le bouchon de centrifugeuse.Après les précipitations ou l’irrigation aérienne, retirez et remplacez la partie inférieure du tube de centrifugeuse. Les tubes de collecte de l’eau de pluie doivent être rapidement changés après les événements de mouillage car ils sont sujets à la dégradation des contaminants naturels mobilisés dans le ruissellement comme les bactéries et autres champignons. Placer deux couches de disques de papier dans les plats de culture et tremper avec deux millilitres d’eau distillée stérile.Ensuite, mélangez des volumes égaux d’eau distillée stérile et d’extrait floral à base d’eau dans deux tubes de microcentrifugeuse millilimétriques. Ajoutez ensuite un volume égal de la suspension de spores aux tubes de microcentrifugeuse préparés de deux millilitres. La préparation qui en résulte est appelée mélange de traitement aqueux.Pour le contrôle, omettre la partie extrait florale et remplacer par de l’eau distillée stérile pour garder les concentrations conidiales cohérentes. Placez maintenant des couvre-toits en verre pré-nettoyés sur les serviettes en papier trempées dans le plat de culture cellulaire. Placer une gouttelette de 40 microlitres de mélange de traitement aqueux sur le centre d’un coverslip.Répétez cette demande pour les traitements désirés, y compris le contrôle. Ensuite, fermez le plat de culture cellulaire. Une fois que tous les traitements et répliques ont été distribués, placez tous les plats de culture cellulaire répliqués dans un contenant en plastique scellé et incubez à 25 degrés Celsius dans l’obscurité.Aux points de temps prédéterminés, ajouter 10 microlitres d’un fixateur aux gouttelettes arrêtant la croissance et semi-préservant la monture. Une fois qu’un fixatif a été ajouté, inversez soigneusement les coverslips plaçant chacun d’eux côté gouttelette vers le bas sur une glissière de microscope en verre pour faciliter l’examen microscopique. Lorsque tous les coverslips sont sur les glissières de microscope en verre, laissez-les s’installer et sécher partiellement dans le capot d’écoulement pendant 20 minutes.Comptez toutes les conidies présentes sur le coverslip, y compris les conidies primaires, les conidies germées et les conidies secondaires nouvellement formées, ainsi que l’appressoria. Travaillez à 400 fois grossissement ou 200 fois totalisant une superficie de 3.808 millimètres carrés. Dans un capot d’écoulement laminaire, ajouter deux volumes égaux d’eau distillée stérile et un volume de suspension de spores à un tube de microcentrifugeuse de deux millilitres.Réserver ce mélange de traitement aqueux aux bioassays à base d’extrait floral à base de chloroforme. Dans une hotte de fumée, placez une cellule Van T sur un couvercle en verre dans le plat préparé de culture cellulaire en plastique. Distribuez 33 microlitres d’extrait floral à base de chloroforme désiré au centre de la cellule et laissez sécher.Ne touchez pas aux parois de la cellule. Pour le traitement de contrôle, ajouter le chloroforme vierge. Une fois l’extrait floral à base de chloroforme séché, distribuez 99 microlitres du mélange de traitement aqueux préparé avec une pipette standard au centre de la cellule Van T.Fermez ensuite tous les plats de culture cellulaire et incubez. Aux points de temps prédéterminés, ajouter 15 microlitres d’un fixatif à la cellule Van T et laisser reposer pendant au moins cinq minutes pour assurer une coloration fongique adéquate. Après ce délai, retirez soigneusement la cellule Van T.Effectuez des étapes d’inversion de coverslip et d’acquisition de données comme auparavant. Sur l’évaluation microscopique de C.fiorniae à 24 heures après inoculation, la comparaison de conidia en présence de l’eau distillée stérile par rapport à l’extrait floral à base d’eau indique une augmentation dramatique de la conidiation secondaire et de la formation d’appressorium. Cependant, la conidiation secondaire n’était pas aussi évidente en comparant le contrôle stérile de l’eau distillée de bioassay de chloroforme aux extraits chloroformes-basés.Au contraire, la croissance de C.fiorniae s’est déplacée vers la formation appressorial. Dans cet essai, un contrôle stérile de l’eau distillée et des extractions florales à base de chloroforme de canneberge ont été inspectés visuellement à zéro, six, 12 et 24 heures après l’inoculation. La formation d’appressorium a commencé à six heures dans l’extrait floral chloroforme-basé et a augmenté régulièrement tout au long des points suivants de temps.Ce résultat appuie la conclusion que les fleurs réduisent le temps nécessaire pour former des structures d’infection. La gestion de la maladie pour les champignons pourris de fruits implique souvent des applications fongicides en période de floraison. Ici, des extraits chloroformes de canneberge-basés des étapes multiples de croissance de canneberge ont été visuellement évalués pour les cires efficaces de surface sur C.fiorniae à 24 heures après inoculation.Les ovaires récoltés en juin, les fruits immatures récoltés en juillet et en août, les fruits récoltés en octobre et un contrôle stérile de l’eau distillée ont été inspectés pour décelé la formation appressoriale. Les extraits à base de chloroformeovaire avaient la plus grande magnitude de formation appressoriale indiquant l’importance de la floraison dans le cycle de vie de C.fiorniae. L’agent pathogène est l’élément le plus important de ce protocole.Les champignons devraient être déplacés vers des médias frais régulièrement pour maintenir la cohérence entre les essais. Tout travail avec du chloroforme doit être effectué dans un capot de fumée pour des raisons de sécurité. Cela comprend la préparation des matériaux et de la verrerie, les procédures d’extraction et la conductance du bioassay à base de chloroforme.Des combinaisons de points de temps, d’agents pathogènes, de collections florales d’eau de pluie ou d’extractions d’hôtes peuvent être utilisées pour évaluer diverses interactions hôte-pathogène. Les dispositifs de collecte de l’eau de pluie et les bioassays associés permettront à d’autres de travailler avec des stimulants hôtes mobilisés lors d’événements pluvieux dans de nombreux systèmes de chemin.

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Mise en place d’un système d’élevage de thrips de piment (Scirtothrips dorsalis Hood) pour le dépistage de la virulence des champignons entomopathogènes

Ce protocole décrit une approche à haut débit pour évaluer la fuite d’ions de la plante, l’activité de la peroxydase et la production de callose dans le même échantillon.

Évaluation des réponses foliaires aux métabolites secondaires microbiens en utilisant un format à haut débit

Découvrez un protocole économique pour étudier le développement de Colletotrichum fioriniae à l'aide d'extraits floraux chloroformiques et aqueux de bleuets et canneberges. Cette méthode permet de surveiller en temps réel les interactions hôte-pathogène.

COLLETOTRICHUM fioriniae Développement dans l’eau et des extraits floraux axée sur le chloroforme aux bleuets et aux canneberges (Vidéo) | JoVE Journal

COLLETOTRICHUM fioriniae Développement dans l’eau et des extraits floraux axée sur le chloroforme aux bleuets et aux canneberges

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