Name: Haut-débit Nitrobenzoxadiazole marqué cholestérol Efflux Assay (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Apprenez un test d'efflux de cholestérol NBD haut-débit pour l'évaluation du risque cardiovasculaire en utilisant des modèles de macrophages. Cette méthode cellulaire offre une alternative sûre aux techniques radioactives.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été partiellement soutenu par la subventions de recherche FIS (PS12/00866) d’Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Espagne ; El de Fondo Europeo para Desarrollo régional (FEDER) ; Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) et Programme de CERCA / Generalitat de Catalunya. Les auteurs remercient la rétrovirologie et laboratoire d’immunopathologie virale de l’Institut d'Investigacions Biomèdiques août Pi I Sunyer (IDIBAPS). Nous remercions Escribà T., c. Rovira et C. Hurtado pour leur aide et S. Cufí de la connaissance et le bureau de transfert de technologie pour son orientation dans la protection de l’invention.

Pour cette étude, l’approbation du comité de l’éthique (Comitè Ètic d' recherche clinique, clinique de l’hôpital, Barcelone ; numéro d’homologation HCB/2014/0756) et le consentement écrit et informé de tous les sujets ont été obtenus.
1. NBD-cholestérol préparation
<ol><li>Dissoudre le NBD-cholestérol (MW 494.63 ; voir Table des matières) dans l’éthanol pur pour obtenir le stock (2 mM). Pour un flacon de 10 mg, dissoudre le contenu de la fiole entière dans un volume de 10,1 mL d’éthanol pour obtenir un stock de 2 mM.</li>
	<li>Diluer le NBD-cholestérol du stock en RPMI 1640 additionné de 10 % fœtale bovine sérique et 5 % la pénicilline/streptomycine (R10 moyen) pour atteindre une concentration finale de 5 μM (p. ex., obtenir 10 mL de NBD-cholestérol à concentration finale de 5 μM) par diluer 25 μL de stock NBD-cholestérol (2 mM) dans un milieu R10. Ce volume est suffisant pour une plaque à 96 puits.</li>
</ol>2. cell Culture and Seeding (jour 2)
<ol><li>Cellules THP-1 de culture dans un milieu R10 à 37 ° C, 5 % de CO2. Ajuster à 0,3 x 106 cellules/mL tous les 3 jours.</li>
	<li>Graine de cellules dans une plaque à 96 puits blanche avec un fond plat, verni à 0,2 x 106 cellules/puits dans le milieu R10 (100 μL / puits).</li>
	<li>Traiter les cellules avec 100 nM phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA, d’un stock de 10 μM) pour 48 à 72 h, en incubation à 37 ° C, 5 % de CO2 pour différencier les THP-1 cellules en dmTHP-1. Remarque : Il est recommandé d’utiliser 5 μL de stock PMA (10 μM) dans 500 μl de milieu de R10. Avant cela, préparer un 10 μM stock PMA en dissolvant un flacon lyophilisé 1 g dans 10 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO), aliquot et stock à-20 ° C.</li>
	<li>Sinon (suggestion) combine les étapes 2.2 et 2.3 pour meilleure homogénéisation. Préparer 10 mL de cellules THP-1 dans un tube de 15 mL, ajouter 200 μl de stock PMA (10 μM), mélanger doucement et amorcer immédiatement 100 μL / puits, sur la plaque. Incuber les cellules comme indiqué au point 2.3.</li>
</ol>3. apolipoprotéine B appauvri sérum (constructeurs-distributeurs autorisés) préparation (jour 2 ou 3)
<ol><li>Pour préparer une solution de polyéthylène glycol (PEG), diluer la glycine dans du PBS de 10 % (avec stérile H2O) à une concentration de 200 mM à pH 7,4. Ajouter 40 mL de glycine de 200 mM pour 10 g de PEG 8000 pour obtenir PEG 20 % (p/v). Mélanger la solution vigoureusement pour homogénéiser.</li>
	<li>Appliquer 4 pièces 20 % PEG par 10 parties de sérum/plasma sur chaque échantillon dans un tube de 1,5 mL de sérum/plasma et laisser le mélange sur la glace pour 25 min17 (p. ex., 40 μL de 20 %, ajouter 100 μL de sérum, le plasma ou le PEG solution).</li>
	<li>Centrifuger le précipité PEG-apolipoprotéine B à 13 000 x g pendant 15 min à 4 ° C.</li>
	<li>Éliminer le précipité. Transférer le surnageant dans un nouveau tube. Remarque : Nous vous suggérons de préparer les constructeurs-distributeurs autorisés le jour 3 (frais). S’il n’est pas possible, préparer les constructeurs-distributeurs autorisés au jour 2 et gardez-le toute la nuit à 4 ° C.</li>
</ol>4. NBD-cholestérol cellulaire chargement (jour 2)
<ol><li>Jeter le milieu de culture du dmTHP-1 et laver les cellules deux fois avec 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).</li>
	<li>Charger les cellules avec 5 μM NBD-cholestérol (100 μL / puits) dans un milieu R10 et incuber une nuit à 37 ° C, 5 % de CO2.</li>
</ol>5. l’incubation avec cholestérol accepteurs (jour 3)
<ol><li>Jeter le milieu et laver les cellules deux fois avec du PBS.</li>
	<li>Incuber les cellules avec des constructeurs-distributeurs autorisés de 2 à 5 % ou la concentration désirée d’accepteur de lipides purifiés (HDL, ApoA, ApoE, etc) en dilution dans un milieu RPMI 1640 incolore (100 μL / puits) 4 – 6 h à 37 ° C. NOTE : Inclure un contrôle négatif (C-) consistant en incolore milieu RPMI 1640 sans accepteurs et un témoin positif (C +) (p. ex., constructeurs-distributeurs autorisés d’un bassin de donneurs sains) ou HDL purifiée. Note que le contrôle positif s’applique en particulier lorsque les échantillons de patients (pathologiques) sont analysés (supplémentaire Figure 1).</li>
	<li>Préparation d’un stock de 200 mL de la solution de lyse cellulaire 1 (tampon Tris de 50 mM, 150 mM NaCl, H2O). Le ratio de solution 1 à 1:1 (v : v) de lyse cellulaire se mêlent l’éthanol pur pour obtenir la solution de lyse 2.</li>
</ol>6. Capture de Signal fluorescent (jour 3)
<ol><li>
Détection de média NBD-cholestérol
	<ol>
<li>Retirer le milieu cellulaire des plaques et il récupérer dans une nouvelle plaque 96 puits blanche avec un fond plat opaque.</li>
		<li>Pour une détection de signal de fluorescence optimale dans les échantillons de médias, ajouter 100 μL d’éthanol pur à 100 μL de chaque échantillon moyen pour obtenir un ratio de 1:1 dans la plaque 96 puits blanc.</li>
		<li>Maintenir la plaque avec les médias traités d’autre mesure l’intensité de fluorescence (FI), à une longueur d’onde de 463⁄536 nm (excitation/émission) sur le luminomètre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Détection de NBD-cholestérol intracellulaire
	<ol>
<li>Laver les cellules deux fois avec du PBS.</li>
		<li>Pour obtenir le taux de cholestérol intracellulaire, lyser les cellules en incubant eux avec 100 μL de solution de lyse 2 / puits et secouer la plaque à température ambiante (RT) pendant 25 min.</li>
		<li>Pour une détection de signal de fluorescence optimale dans les échantillons de lysat cellulaire, capturer l’intensité de la fluorescence des lysats cellulaires dans le même blanc plaque à 96 puits avec fond clair plat (la même plaque dans laquelle les cellules ont été ensemencés à l’étape 2.2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>6.3 mesurer l’intensité de fluorescence (FI) dans le luminomètre tout en ajustant le paramètre de sensibilité à 50 dans le logiciel (voir Table des matières).</li>
</ol>7. analyse des résultats
<ol><li>Exprimer le taux d’efflux de cholestérol d’un échantillon en pourcentage calculé par la formule suivante : <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58891/58891eq1.jpg">
</li>
	<li>Obtenir la dernière mesure d’efflux de cholestérol (EC) en soustrayant de la CE du contrôle négatif (échantillon chargé avec NBD-cholestérol mais incubés avec incolore milieu RPMI 1640, sans accepteurs de cholestérol) de la CE du a donné des échantillons : <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58891/58891eq2.jpg">
</li>
</ol>

<ol><li>The top 10 causes of death. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death">http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death</a> (2018).</li>
<li>Hansson, G. K., Hermansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+system+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The immune system in atherosclerosis.</a> Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).</li>
<li>Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+challenges+in+translating+the+biology+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis.</a> Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).</li>
<li>Ilhan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis+and+the+role+of+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Clinical+Cases%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis and the role of immune cells.</a> World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345(2015).</li>
<li>Greaves, D. R., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity%2C+atherosclerosis+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease.</a> Trends Immunol. 22, (2001).</li>
<li>Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+and+its+related+cholesterol+efflux+as+a+HDL+function+index+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis.</a> Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).</li>
<li>Escolà-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+macrophage-specific+RCT+and+antioxidant+and+antiinflammatory+HDL+activity+measurements%3A+New+tools+for+predicting+HDL+atheroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection.</a> Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).</li>
<li>Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL-cholesterol%3A+Is+it+really+good%3F+Differences+between+apoA-I+and+HDL%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL.</a> Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).</li>
<li>Rothblat, G. H., Phillips, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+lipoprotein+heterogeneity+and+function+in+reverse+cholesterol+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Lipidology%22%5BJournal%5D)">High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport.</a> Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).</li>
<li>Hafiane, A., Genest, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL-mediated+cellular+cholesterol+efflux+assay+method%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+and+Laboratory+Science%22%5BJournal%5D)">HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method.</a> Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).</li>
<li>Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+Drug+Metabolizing+Enzymes+in+Roma+Population+Samples%3A+Systematic+Review+of+the+Literature%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature.</a> Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).</li>
<li>Mcintosh, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Sterols+for+the+Study+of+Cholesterol+Trafficking+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Probes+and+Tags+to+Study+Biomolecular+Function%3A+for+Proteins%2C+RNA%2C+and+Membranes%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells.</a> Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).</li>
<li>Ostašov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLIM+studies+of+22-+and+25-NBD-cholesterol+in+living+HEK293+cells%3A+Plasma+membrane+change+induced+by+cholesterol+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Physics+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).</li>
<li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+fluorescent+NBD-cholesterol+efflux+in+THP-1-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).</li>
<li>Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sesamin+enhances+cholesterol+efflux+in+RAW264.7+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages.</a> Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).</li>
<li>Qin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+THP-1+cells+as+a+model+for+mimicking+the+function+and+regulation+of+monocytes+and+macrophages+in+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature.</a> Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).</li>
<li>Low, H., Hoang, A., Sviridov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+Efflux+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cholesterol Efflux Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), 5-9 (2012).</li>
<li>Gimpl, G., Gehrig-Burger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+reporter+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Cholesterol reporter molecules.</a> Bioscience Reports. 27 (6), 335-358 (2007).</li>
<li>Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vanden+Development+of+a+Cell-Based%2C+High-Throughput+Screening+Assay+for+Cholesterol+Efflux+Using+a+Fluorescent+Mimic+of+Cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22ASSAY+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).</li>
<li>Rader, D. D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+HDL+metabolism+and+function%3A+implications+for+novel+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).</li>
<li>Davidson, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+apolipoprotein+B+depletion+on+HDL+subspecies+composition+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function.</a> Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).</li>
<li>Park, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sage+weed+%28Salvia+plebeia%29+extract+antagonizes+foam+cell+formation+and+promotes+cholesterol+efflux+in+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages.</a> International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).</li>
<li>Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+Efflux+and+Reverse+Cholesterol+Transport%3A+Experimental+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches.</a> Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).</li>
<li>Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+efflux+capacity%2C+high-density+lipoprotein+function%2C+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis.</a> N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).</li>
<li>Rohatgi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL+Cholesterol+Efflux+Capacity+and+Incident+Cardiovascular+Events%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events.</a> New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs souhaitent déclarer qu’ils sont les inventeurs de la demande de brevet (EPO, 18382337.6-1118 ; 17 mai 2018) intitulé « Méthode pour déterminer l’efflux de cholestérol » basée sur cette méthode.

Cholestérol marqué fluorescent est une stratégie prometteuse pour analyser et étudier les propriétés et le métabolisme du cholestérol naturel in vitro. Ses principaux avantages sont qu’il peut être absorbé par les cellules, permettant l’intracellulaire et étude de membrane de diffusion et peut être appliqué à des épreuves de l’efflux de cholestérol comme dans ce protocole (Figure 7). Certains stérols fluorescentes marqués permettent de cholestérol suivi in vitro y compris BODIPY-cholestérol,...

Selon l’organisation mondiale de la santé, les cours principales causes de décès dans le monde sont les cardiopathies ischémiques et les accidents vasculaires cérébraux (représentant un total de 15,2 millions de décès)1. Les deux sont des maladies cardiovasculaires (MCV) qui peuvent être précédées de l’athérosclérose et la rupture des plaques d’athérome dans les vaisseaux sanguins2,3.
L’athérosclérose est une maladie inflammatoire de mur du navire dans laquelle macrophages, lymphocytes T, cellules de mât et les cellules dendritiques infiltrent l’endothélium et s’accumulent dans le sang, formant éventuellement les plaques d’athérome. Les plaques d’athérosclérose présentent un lipide cristaux cœur et cholestérol, attestées par des mesures de l’échographie mode B haute résolution de la carotide intima média épaisseur4,5. Dans les macrophages, efflux de cholestérol vers des particules lipidiques accepteur est effectué par des moyens des récepteurs ATP binding cassette (ABC) ABCA1, ATP binding cassette membre du subfamily G 1 (ABCG1) et le récepteur éboueur SR-BI. Le déséquilibre des influx de cholestérol et l’efflux dans les macrophages est considéré comme un processus clé de l’athérosclérose initiation6. Efflux de cholestérol est considéré comme une étape clé dans l’élimination du cholestérol des tissus périphériques au plasma et le foie dans un processus appelé transport du cholestérol inverse (RCT). Cholestérol est transférée de macrophages principalement d’apolipoprotéine A1 (ApoA1) dans la surface des particules de lipoprotéines de haute densité (HDL). Puis le transport HDL cholestérol vers le foie pour l’excrétion et réutilisation7,8,9.
Traditionnellement, cholestérol radiomarqué de tritium (3H) a été utilisé dans l’efflux de cholestérol10. Le signal d’émission de radioisotopes est hautement sensible10; Cependant, cholestérol radiomarqué présente des handicaps évidents tels que les protocoles longs, risque d’exposition aux rayonnements ionisants et la nécessité de radioactivité spécial installations et le matériel assurer une manipulation sûre des émissions radioactives. Au contraire, la fluorescence a été avec succès incorporé dans des techniques de diagnostic en raison de sa simplicité dans la détection de signal fluorescent, la grande variété des fluorophores disponibles et sa sécurité11. Plusieurs des stérols fluorescentes marquées ont été utilisés pour étudier le métabolisme du cholestérol notamment dehydroergosterol (avec fluorescence intrinsèque), cholestérol dansyl, 4,4-difluoro-3 a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) - cholestérol et 22-(N-(7- Nitrobenz-2-oxa-1,3-Diazol-4-YL)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-OL (NBD-cholestérol). En particulier, NBD-cholestérol présente une absorption efficace dans les cellules humaines12. Deux différentes NBD étiquetés-cholestérol n’est actuellement disponible : 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) et 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-jour ouvrable suivant ; La figure 1). Cholestérol marqué avec portion de 22-NBD peut mieux à des études de l’efflux de cholestérol, tandis que 25-NBD-cholestérol est principalement utilisé dans la membrane cellulaire dynamique recherche13,14.
Lignées cellulaires généralement utilisées dans les essais de l’efflux de cholestérol in vitro sont des cellules de type monocyte comme des cellules THP-1 leucémie-dérivé humaines, murines Raw 264.7 cellules15ou J774.1. Toutes ces cellules se différencient en macrophages in vitro à l’aide de phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA), mais les macrophages dérivés du THP-1 (dmTHP-1) mieux reflètent et imitent les macrophages humains16.
Dans la présente étude, nous avons optimiser et uniformiser une méthode fluorescente de haut débit afin de déterminer la capacité de l’efflux de cholestérol du sérum sur dmTHP-1, à l’aide de 22-NBD-cholestérol comme une alternative à la [3H]-cholestérol. En outre, nous comparons la technique fluorescente optimisée avec l’analogue radioactif standard.

<table><tbody><tr><td>Plaque collectrice à 96 puits</td><td>Corning Inc</td><td>Costar 3912</td><td>Plaque blanche à 96 puits avec fond transparent opaque</td></tr><tr><td>Plaque de culture à 96 puits</td><td>Corning Inc</td><td>Costar 3610</td><td>Plaque blanche à 96 puits avec fond plat et transparent</td></tr><tr><td>Trousse de dosage de l’efflux de cholestérol (à base de cellules)</td><td></td><td>Abcamab196985</td> <td>commercial à haut débit à base de cellules visant à déterminer le efflux de cholestérol</td></tr><tr><td>incolore RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7509</td><td>RPMI 1640 sans pehnol-red</td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse de données Gen5</td><td>BioTek</td><td></td><td>Version 2.0</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8790-100G</td><td>Glycine, utilisation non animale</td></tr><tr><td>Luminomètre</td><td>Biotek</td><td>SYNERGY HT</td><td>Lecteur de microplaques multi-détection</td></tr><tr><td>Solution de lyse 1</td><td></td><td></td> tampon <td>Tris 50 mM, 150 mM de NaCl et H2O</td></tr><tr><td>Solution de lyse 2</td> solution <td>interne</td><td></td><td>d’éthanol pur et de lyse cellulaire 1:1 (v :v)</td></tr><tr><td>NBD-cholestérol</td><td>Thermo-Fisher</td><td>N1148</td><td>22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3&beta ;-ol</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td>tamponné au phosphate&nbsp ; solution saline</td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>202452-250G</td><td>polyéthylène glycol</td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79346</td><td>Phorbol 12-mérystate B-acétate.</td></tr><tr><td>R10</td><td>RPMI</td><td>1640 interne complété par 10 % de sérum fœtal bovin et 5 % de pénicilline/streptomycine.</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td>RPMI 1640 avec 2 mM de L-glutamine contenant 1,5 g/L de bicarbonate de sodium et 4,5 g/L de glucose</td></tr><tr><td>THP-1</td><td>cellules Sigma-Aldrich</td><td>ATCC, #TIB-202</td><td>Monocyte dérivé d’une leucémie d’un bébé d’un an</td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr></tbody></table>

haut-débit nitrobenzoxadiazole marqué cholestérol efflux assay

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

L’athérosclérose entraîne des maladies cardiovasculaires (MCV). On ignore encore si la concentration de cholestérol-HDL (cHDL) joue un rôle causal dans le développement de l’athérosclérose. Cependant, un facteur important dans les premiers stades de la formation de plaques d’athérome est capacité de l’efflux de cholestérol HDL (la capacité des particules HDL à accepter le cholestérol des macrophages) afin d’éviter la formation de cellules de mousse. Il s’agit d’une étape clé en évitant l’accumulation de cholestérol dans l’endothélium et une partie du transport du cholestérol inverse (RCT) à éliminer le cholestérol par le foie. Capacité de l’efflux de cholestérol de sérum ou de plasma dans les modèles de cellules macrophages est un outil prometteur qui peut être utilisé comme biomarqueur d’athérosclérose. Traditionnellement, [3H]-cholestérol a été utilisé lors d’essais de l’efflux de cholestérol. Dans cette étude, notre objectif est d’élaborer une stratégie plus sûre et plus rapide à l’aide de fluorescent étiquetés-cholestérol (NBD) lors d’un test cellulaire de retracer le processus de captation et l’efflux de cholestérol dans les macrophages dérivés du THP-1. Enfin, optimiser et uniformiser la méthode de l’efflux de cholestérol NBD et développer une analyse de haut-débit à l’aide de plaques de 96 puits.

Le but de l’essai de l’efflux de cholestérol est de déterminer in vitro la capacité de l’efflux de cholestérol d’une donnée de sérum, le plasma ou surnageant contenant des particules HDL. La méthode consiste à charger cholestérol marqué dans une culture d’une lignée de cellules macrophages standard et induisant des contact avec l’échantillon dilué dans des milieux sans FBS avec les cellules. Enfin, les niveaux fluorescents de la NBD sont mesurés dans les médias et le lysat cellulaire. Pour optimiser les mesures, le chole...

Mesure de la capacité de l’efflux de cholestérol in vitro de sérum ou de plasma dans les modèles de cellules macrophages est un outil prometteur comme biomarqueur d’athérosclérose. Dans la présente étude, nous optimiser et uniformiser une méthode d’efflux de cholestérol NBD fluorescente et développer une analyse de haut-débit à l’aide de plaques de 96 puits.

Haut-débit Nitrobenzoxadiazole marqué cholestérol Efflux Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

Ce protocole est notre méthode basée sur la cellule pour l’arrêt de cholestérol du reflux de cholestérol dans le plasma céramal. En particulier dans les projections. Ceci peut être appliqué pour diagnostiquer le risque cardio-vasculaire, et pour identifier ou évaluer l’entretien inférieur de cholestérol.Cette technique évite le risque et les fardeaux que la sécurité à la manipulation des matériaux rayonné en fournissant des résultats avec des niveaux de qualité comparables, à ceux de reflux de cholestérol a été signalé à associer avec Ainsi, le reflux plasmatique ou céramien de cholestérol de accepté peut être comparé, à notre contrôle de référence et peut fournir le risque de souffrir de cette méthode sera également appliquée aux lignées cellulaires , comme d’autres lignées cellulaires humaines ou même des phases macro primaires. Macro phases ou et cellules souches de bouton de pulvérisation induites par l’homme. Pour commencer cette procédure, dissoudre le cholestérol NPD dans de l’éthanol pur pour obtenir une solution de stock avec une concentration finale de deux micromolaires.Diluer 25 microlitres du stock de cholestérol NBD dans ar 10 moyen pour atteindre une concentration finale de cinq micromolaires. Culture thp-1 cellules dans notre milieu 10 à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Tous les trois jours, réglez la densité cellulaire à 300 000 cellules par millilitre.Ensuite, obtenez une plaque de 96 puits avec un fond clair plat. Pour une meilleure homogénéisation, préparer un 10 millilitres de cellules thp-1 dans un tube de 15 millilitres, et ajouter 200 microlitres de stock PMA. Mélanger délicatement et ensemencer 100 microlitres du mélange dans les puits de la plaque à 200 000 cellules par puits.Et incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 48 à 72 heures pour différencier les cellules thp-1 en cellules DM thp-1. Diluer d’abord la glycine dans 10%PBS avec de l’eau stérile, à une concentration de 200 micromolaires au pH 7,4. Ajouter 40 millilitres de glycine diluée à 10 grammes de peg 8000 pour préparer une solution de cheville de 20%, et mélanger vigoureusement pour homogénéiser.Appliquer ensuite quatre parties de 20 % par 10 parties d’échantillon à chaque échantillon de sérum ou de plasma dans un tube de 1,5 ml. Laisser le mélange sur la glace pendant 25 minutes. Centrifugeuse la cheville apolipoprotéine B précipité à 13000 fois G, et à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes.Jetez le précipité et transférez le supernatant dans un nouveau tube. Récupérer la plaque contenant les cellules thp-1 différenciées. Retirer et jeter le milieu de culture, puis laver les cellules deux fois avec 1X PBS.Ajouter 100 microlitres de 5 micromolaires de cholestérol MVD dans ar-10 moyen à chaque puits. Incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain jeter, jeter le milieu.Lavez les cellules deux fois avec PBS, puis ajoutez 100 microlitres ABDS, ou accepteur purifié de lipide dilué dans rpmi 1630 moyen à la concentration désirée à chaque puits. Inclure un contrôle négatif qui ne contiennent pas d’accepteurs de cholestérol dans un contrôle positif, tel que décrit dans le protocole de texte, et incuber à 37 degrés Celsius pendant quatre à six heures. Pendant ce temps, préparer un stock de 200 millilitres de solution de lyse cellulaire un tel que décrit dans le texte.Mélangez cette solution avec de l’éthanol, à un rapport volumétrique un pour un pour obtenir une solution de lyse aussi. Pour la détection du cholestérol média et BD, retirez le milieu cellulaire des plaques recueillies dans une nouvelle plaque blanche de 96 puits avec un fond plat opaque. Ajouter 100 microlitres d’éthanol pur à 100 microlitres de chaque échantillon moyen pour obtenir un rapport un pour un dans la nouvelle plaque.À l’aide d’un illuminomètre, mesurer l’intensité du fluorescent à une excitation de 463 nanomètres, et une émission de 536 nanomètres. Pour la détection intracellulaire du cholestérol NBD, lavez les cellules deux fois avec PBS. Ajouter 100 microlitres de solution de lyse aussi à chaque puits, et incuber à température ambiante, tout en secouant pendant 25 minutes.Après cela, mesurez l’intensité du fluorescent tout en ajustant le paramètre de sensibilité à 50 dans le logiciel. Déterminez ensuite le taux d’efflux de cholestérol dans la mesure finale de l’efflux de cholestérol tel que décrit dans le protocole de texte. La dilution du cholestérol NBD dans l’éthanol pur produit les valeurs d’intensité fluorescentes les plus élevées, tandis qu’une teneur élevée en solution aqueuse réduit l’intensité.Ceci suggère que l’émission fluorescente de cette molécule dépend fortement du milieu, dans lequel elle est contenue. Lors de l’utilisation d’un mélange de médias et d’éthanol à un rapport un pour un, l’intensité du fluorescent semble augmenter proportionnellement, avec une concentration de l’analogue du cholestérol, ce qui suggère que la sonde se comporte approprié dans ces conditions. Pour déterminer le temps nécessaire à l’incubation des cellules chargées avec des accepteurs de cholestérol, les médias cellulaires sont récoltés à différents moments.L’efflux de cholestérol a évolué linéairement de zéro à six heures, avec le signal maximum étant capturé six heures après ABDS est ajouté aux cellules. Le seuil de saturation et la plage dynamique sont testés en mesurant l’efflux de cholestérol à différents pourcentages de HDL contenant des supports. Dans l’actif à haut débit, l’efflux évolue linéairement de un à 7%ABDS, atteignant le pic de la capacité d’efflux de cholestérol à 7%À des concentrations supérieures à 7%, l’intensité fluroescente diminue dans une relation inverse avec le pourcentage d’ABDS.La performance de la méthode basée sur la fluorescence est ensuite évaluée en la comparant à la technique standard étiquetée radio. Les deux techniques sont fortement corrélées lors de l’utilisation de différentes concentrations d’ABDS. La méthode décrite est sensible à une augmentation des concentrations d’accepteurs dans les valeurs d’efflux de cholestérol entre cinq et 15%Il est important de s’assurer que le celluarisateur ne contient pas d’agrégats.Le point critique est de grader un éthanol agrégé contenant de l’environnement, de mesurer la fluorescence dans un poids homogène et optimal. Après cette procédure, le cholestérol technique de nom peut être mesuré, et l’effet des drogues dans la voie d’efflux de cholestérol peut être déterminé. Aussi l’école éventuellement être utilisé comme un diagnostic pour asses risque cardiovasculaire.Nous croyons que cette méthode est beaucoup plus facile et plus sûre que la méthode standard radioactive. Toutefois, il est encore dépendant des cellules. N’oubliez pas que l’éthanol est inflammable et qu’il doit être stocké et manipulé en conséquence.

high-throughput-nitrobenzoxadiazole-labeled-cholesterol-efflux-assay

Research

Recherche

JoVE Journal

Medicine

Médecine

Le dosage du cholestérol est conçu pour quantifier le taux de cholestérol efflux partir de cellules cultivées et la capacité de plasma accepteurs d'accepter le cholestérol libéré par les cellules. Le test se compose de marquage des cellules avec le cholestérol, l'équilibration du cholestérol entre les pools intracellulaires et la libération de cholestérol à un accepteur extracellulaire.

Essai efflux de cholestérol

Les protéoliposomes sont utilisés pour étudier les canaux purifiés et les transporteurs reconstitués dans un environnement biochimique bien défini. Une procédure expérimentale pour mesurer l’efflux médié par ces protéines est illustrée. Les étapes de préparation des protéoliposomes, d’enregistrement et d’analyse des données pour déterminer quantitativement les propriétés fonctionnelles de la protéine reconstituée sont décrites.

Un protéoliposome-Based Assay Efflux pour déterminer les propriétés unique molécule de Cl<sup&gt; -</sup&gt; Chaînes et transporteurs

L'étude des interactions entre les bactéries pathogènes et leurs hôtes est un domaine important de la recherche biologique. Ici, nous décrivons les techniques nécessaires pour mesurer la translocation effecteur par Coxiella burnetii lors de l' inactivation de gène siRNA en utilisant un substrat BlaM.

Application Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) pour examiner effecteur translocation efficacité par<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Pendant siRNA Silencing

Nous décrivons ici un dosage fluorimétrique acellulaire biochimique pour dosage du HDL-la peroxydation lipidique. Ce test rapid et reproductible peut servir à déterminer la fonction de HDL dans les études à grande échelle et peut contribuer à notre compréhension de la fonction de HDL dans la maladie humaine.

Acellulaire biochimique dosage fluorimétrique pour haut débit mesure de peroxydation des lipides dans les lipoprotéines de haute densité

L’objectif de cette étude était d’évaluer in vitro les effets des médicaments hypolipidémiants dans la modulation de la morphologie des particules de cholestérol. Comparaison des médicaments hypolipidémiants ont révélé des variations dans leurs effets en modulant les caractéristiques morphologiques des particules de cholestérol.

Effets différentiels des médicaments hypolipidémiants dans la modulation de la morphologie des particules de cholestérol

Ce protocole prévoit une approche efficace pour mesurer l’absorption de cholestérol LDL avec des taux de flux en temps réel à l’aide d’un système dans divers types de cellules d’imagerie de cellules vivantes. Cette technique fournit une plate-forme pour l’activité pharmacologique de composés affectant les afflux de LDL tout en surveillant pour la morphologie cellulaire et cytotoxicité donc potentielle de l’écran.

Test d’absorption LDL cholestérol analyse avec cellule d’imagerie de cellules vivantes surveillance sanitaire

Présenté ici est un test de fluorescence sensible pour surveiller l’activité de l’apolipoprotéine N-acyltransférase en utilisant le peptide diacylglycéryle et les alcyne-phospholipides comme substrats avec la chimie click.

Dosage fluorométrique basé sur la chimie Clic pour l’apolipoprotéine N-acyltransférase de la caractérisation enzymatique au criblage à haut débit

Ce protocole détaille un test in vitro permettant de mesurer l’absorption cellulaire des lipides dans les cellules endothéliales lors d’une stimulation avec des analogues fluorescents BODIPY-C12 et BODIPY-C16 d’acides gras saturés à longue et très longue chaîne. Cette méthode est efficace et adaptable à d’autres types de cellules, offrant une approche utile pour étudier le métabolisme des lipides.

Quantification de l’absorption des acides gras endothéliales à l’aide d’analogues d’acides gras fluorescents

Nous décrivons ici les protocoles permettant de mesurer la quantité de phospholipides fluorescents spécifiquement éliminée des particules donneuses de lipides par les lipoprotéines de haute densité (HDL) présentes dans le plasma humain entier ou le sérum. Nous avons montré que cette métrique de la fonctionnalité HDL prédit les maladies cardiovasculaires incidentes.

Dosage de l’efflux de phospholipides spécifiques aux lipoprotéines de haute densité

Un haut-débit, plate-forme automatisée de développement des cellules de fabrication pour produire des protéines thérapeutiques est décrite. La mise en œuvre de la BD FACS Aria trieur de cellules, CloneSelect Imager et TECAN Freedom EVO système de manipulation de liquides a démontré la capacité de traitement significativement augmenté dans le développement de la lignée cellulaire avec une qualité améliorée de lignée cellulaire et la reproductibilité élevée.

Une plate-forme à haut débit automatisé pour le développement de lignées cellulaires de fabrication des protéines thérapeutiques

Apprenez un test d'efflux de cholestérol NBD haut-débit pour l'évaluation du risque cardiovasculaire en utilisant des modèles de macrophages. Cette méthode cellulaire offre une alternative sûre aux techniques radioactives.

Haut-débit Nitrobenzoxadiazole marqué cholestérol Efflux Assay

Explorer plus de vidéos