Mesures de Liposome unique pour l’étude des Enzymes membranaires Proton-pompage, à l’aide de l’électrochimie et microscopie fluorescente

Cette méthode permet l’étude de l’activité de transport des protons des enzymes de la membrane respiratoire comme le cytochrome BO3 dans un environnement naturel de bicposition lipidique. Les principaux avantages de cette technique enzymatique unique est la possibilité de commencer et d’arrêter les réactions enzymatiques à tout moment en utilisant l’électrochimie. À l’aide d’une seringue en verre transférer 200 microlitres de stock chloroforme d’extrait polaire lipidique d’Escherichia coli en flacons de verre pour faire cinq milligrammes aliquots.

Ajouter 50 microlitres d’un milligramme par millilitre ubiquinone 10 aux lipides pour faire le rapport final de un à 100 ubiquinone 10 aux lipides. Au mélange ajouter 20 microlitres d’un milligramme par millilitre longue longueur d’onde colorant fluorescent étiqueté lipide abrégé FDLL. Homogénéiser la solution chloroforme par vortex court et évaporer la majeure partie du chloroforme sous un flux doux d’azote ou d’argon.

Retirer complètement les traces de chloroforme par évaporation sous vide pendant au moins une heure. Ajouter 312,5 microlitres de 40 millimolaires MOPS pH 7.4 tampon à un aliquot de lipides ubiquinone 10 FDLL mélange sec. Mélanger le vortex jusqu’à ce que le film lipidique soit entièrement re-suspendu suivi de deux minutes de traitement dans un bain ultrasonique.

Ajoutez ensuite 125 microlitres de HPTS de 25 millimolaires, un colorant fluorescent sensible au pH qui sera encapsulé à l’intérieur des liposomes. Maintenant ajouter 137,5 microlitres de 250 millimolar OGP surfactant. Après mélange à l’aide de vortex, sonicate le mélange dans un bain d’eau ultrasonique pendant 10 minutes pour s’assurer que tous les lipides sont solubilisés en micelles surfactants.

Transférer ensuite la dispersion dans un tube en plastique de 1,5 millilitre. Ajouter la quantité requise de cytochrome BO3 et ajouter de l’eau ultra pure pour faire un volume total de 50 microlitres. Incuber le mélange de reconstitution à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes sur un mélangeur à rouleaux.

Ensuite, pesez 50 milligrammes de microbilles de polystyrène dans chacune des deux capsules de tube de 1,5 millilitre. Pesez ensuite 100 milligrammes de microbilles de polystyrène dans deux autres capsules de tube de 1,5 millilitre. Fermer les bouchons avec du film de paraffine pour éviter le séchage.

Ajouter les 50 premiers milligrammes de microbilles de polystyrène dans le mélange de reconstitution en mettant le bouchon avec des microbilles de polystyrène sur le tube en plastique de 1,5 millilitre avec la dispersion préparée. Ensuite, effectuez un court tour pendant quelques secondes pour amener des microbilles au fond du tube. Incuber la suspension à quatre degrés Celsius sur un mélangeur à rouleaux pour permettre aux microbilles de polystyrène d’absorber le surfactant pendant 30 minutes.

Répétez les ajouts de microbilles de polystyrène et d’incubations comme suit. Ajouter 50 milligrammes de microbilles pendant 60 minutes d’incubation. Ajouter ensuite 100 milligrammes de microbilles pendant 60 minutes d’incubation.

Et enfin, ajouter 100 milligrammes de microbilles pour 120 minutes d’incubation. Séparez la solution protéoliposome des microbilles de polystyrène à l’aide d’une micropipette avec une pointe fine. Diluer la dispersion en 90 millilitres de tampon MOPS dans le tube d’ultracentrifugeuse TI 45.

Ultracentrifugeuse la dispersion à l’aide d’un rotor TI de type 45 à 125 000 fois G pendant une heure pour pelleter les protéoliposomes. Après l’ultracentrifugation, jetez le supernatant et rincez les granulés avec le tampon MOPS sans dépenser à nouveau la pastille. Après avoir jeté le tampon de rinçage, suspendez les protéoliposomes dans 500 microlitres de tampon MOPS en le pipetting d’avant en arrière avec une micropipette à pointe mince avant de transférer la suspension dans un tube en plastique de 1,5 millilitre.

Après centrifugation pendant cinq minutes à 12 000 fois G pour enlever les débris, transférer le supernatant qui est le protéoliposome reconstitué dans un nouveau flacon. Collez jusqu’à neuf feuillets de couvercle en verre sur une surface dorée évaporée à l’aide d’époxy à faible fluorescence bi-composants. Guérir la colle à 80 degrés Celsius pendant quatre heures.

Juste avant la modification à l’aide d’une monocposition auto-assemblée, détachez les feuillets de couvercle en verre des plaquettes de silicone à l’aide d’une lame. En raison de la minceur des glissements de couverture, prenez soin de détacher les glissements de couvercle pour ne pas casser ou casser les glissières en verre. Trempez le couvercle fraîchement détaché enduit d’or glisse dans une solution 6-marcaptohexanol et laisser à 20 à 25 degrés Celsius pendant la nuit pour former la mono-couche auto-assemblé.

Le lendemain, retirez les feuillets de couvercle recouverts d’or de la solution et lavez-les brièvement avec de l’eau ou du méthanol, puis avec de l’isopropanol. Séchez le couvercle recouvert d’or glisse sous un flux de gaz doux. Assembler le bordereau de couverture recouvert d’or dans une cellule spectro-électrochimique telle qu’elle est schématisé dans le protocole textuel.

Entrez en contact avec l’or avec un fil plat à l’extérieur d’une zone définie par un anneau O en caoutchouc et vissez fermement la cellule électrochimique sur le dessus de celui-ci. Ajouter deux millilitres de la solution tampon d’électrolyte et placer les électrodes de référence et auxiliaires dans la cellule. Procédez à la vérification de la qualité de la monocposition auto-assemblée et exécutez des blancs tels que décrits dans le protocole de texte.

Ajouter des protéoliposomes à la cellule électrochimique à 0,5 milligramme par millilitre de concentration finale de lipides et mélanger légèrement avec une pipette. Attendez 30 à 60 minutes à température ambiante jusqu’à ce que l’absorption des protéoliposomes sur la surface de l’électrode soit terminée. Lavez la cellule en changeant la solution tampon au moins 10 fois, mais évitez de laisser la surface de l’électrode complètement sèche.

Maintenant, exécutez la spectroscopie électrochimique d’impedance au potentiel ouvert de cellules pour confirmer la mono-couche auto-assemblée sur l’électrode d’or reste inchangée. Exécutez des voltammographies cycliques avec des taux de balayage de 10 et 100 millivolts par seconde pour observer l’oxydation catalatique d’ubiquinol et la réduction d’oxygène par BO3 cytochrome aux potentiels de début de la réduction électrochimique de quinone. Modifier l’électrode d’or comme avant, mais en utilisant cinq microgrammes par millilitre protéoliposomes.

Pour les études enzymatiques simples réduire le rapport cytochrome BO3 à lipide entre 0,1 et 0,2%Placez une goutte d’huile d’immersion, puis la cellule électrochimique sur l’objectif 60 fois huile d’un microscope à fluorescence inversée. À l’aide de filtres appropriés pour la fluorescence FDLL, concentrez-vous sur la surface de l’électrode. Les liposomes simples doivent apparaître comme des points lumineux à la limite de diffraction de l’objectif du microscope.

Prenez une image de la florescence FDLL. Passez à celui du filtre de florescence HPTS sur le microscope pour vérifier que la florescence HTPS est clairement visible et distinguable de l’arrière-plan. Augmentez l’intensité lumineuse si ce n’est pas le cas.

Programmez le logiciel microscope pour effectuer une acquisition d’image timed en alternant deux ensembles de filtreS HTPS. Pour ce faire, définissez une seconde d’exposition puis naviguez vers les applications de menu. Définissez/exécutez ensuite l’acquisition de ND et sélectionnez deux canaux HTPS.

Définissez le délai entre les acquisitions d’images au minimum. Dans cette expérience, utilisez 0,3 seconde de retard et une durée totale de cinq minutes. Ajustez les paramètres du potentiostat pour modifier le potentiel lors de l’acquisition de l’image comme indiqué dans le protocole texte.

Maintenant, exécutez simultanément l’acquisition d’image expirée sur le microscope et la séquence potentielle sur le potentiostat en commençant manuellement les deux mesures en même temps. On y voit des images de fluorescence de liposomes absorbées sur les électrodes à trois couvertures différentes. Le colorant contenant des liposomes sont visibles sur les images comme des taches lumineuses.

La partie centrale de l’image a été blanchie à la photo pour révéler le niveau de florescence de fond. Les images sur deux canaux HTPS sont super imposables où le rapport entre les deux canaux correspond à un pH de 7,4 utilisé dans cette expérience. Un plus grand nombre de liposomes sont visibles avec le canal FDLL, ce qui indique la présence de liposomes qui n’ont pas de HPTS encapsulé.

La différence entre les canaux HPTS et FDLL est plus prononcée à des couvertures plus élevées. Peut-être parce qu’à haute couverture liposome, liposomes sont plus susceptibles d’éclater ou de fusionner sur la surface. Ici, le changement d’une florescence liposome sur deux canaux HTPS est montré comme une parcelle de surface 3D de la zone correspondante pendant 300 secondes de l’expérience.

Le potentiel réducteur a été appliqué entre 60 secondes et 180 secondes. La parcelle correspondante du rapport d’intensité métrique du volume de deux canaux HPTS par rapport au temps est indiquée. Voici les médianes de tous les changements de pH vésicule dans une seule image lorsque le contenu bo3 cytochrome est de 1,3%Une augmentation du pH est clairement visible quand un potentiel entre 0,1 et 0,3 volts est appliqué.

Lorsque la teneur en BO3 cytochrome est une valeur beaucoup plus faible de 0,1%, les courbes médianes deviennent presque indiscernables de celles des liposomes vides. Il est important d’assurer l’élimination complète du surfactant des dispensations liposome puisque les résidus peuvent augmenter la perméabilité des liposomes aux protons. Ces méthodes nous permettent de poser des questions spécifiques sur le substrat naturel de quinone lipophile, contrairement aux analogues du quinone solubles dans l’eau souvent utilisés.

De plus, les expériences enzymatique unique ont identifié un état de fuite jusqu’alors inconnu où la protéine agit comme un canal de protons où les protons circulent librement vers l’arrière.