Name: Isolement de cellules endothéliales microvasculaires primaires murines Muscle squelettique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Découvrez l'isolement de cellules endothéliales microvasculaires primaires du muscle squelettique murin. Cette méthode à haute pureté permet d'étudier les interactions muscle-endothélium et la barrière sang-muscle.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par la « Else Kröner-Fresenius-Stiftung » (2018_A03 tr), « Novateur Medizinische Forschung (FMI) Münster » (I-RU211811 à TR) et fondation de recherche allemande (DFG, INST 2105/27-1, ME 3283/5-1 et ME 3283/6-1 à SGM). Illustré d’images fournies par Heike Blum.

<ol><li>Rodrigues, S. F., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+cells+and+endothelial+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Blood cells and endothelial barrier function.</a> Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720(2015).</li>
<li>Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell functions.</a> Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).</li>
<li>Pierce, R. W., Giuliano, J. S. Jr, Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+function+and+dysfunction+in+critically+ill+children%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children.</a> Pediatrics. 140 (1), Epub 2017 Jun 1 (2017).</li>
<li>Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transmembrane+tight+junction+protein+selectively+expressed+on+endothelial+cells+and+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).</li>
<li>Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+new+conditionally+immortalized+human+skeletal+muscle+microvascular+endothelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line.</a> Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).</li>
<li>Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natalizumab+treatment+for+multiple+sclerosis%3A+Updated+recommendations+for+patient+selection+and+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring.</a> Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).</li>
<li>Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+pericyte+subtypes+differ+in+their+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential.</a> Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).</li>
<li>Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+murine+brain+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52204(2014).</li>
<li>Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+expression+of+occludin%2C+zona+occludens-1%2C+and+junction+adhesion+molecule+A+in+the+duodenum%2C+ileum%2C+colon%2C+kidney%2C+liver%2C+lung%2C+brain%2C+and+skeletal+muscle+of+C57BL+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific expression of occludin, zona occludens-1, and junction adhesion molecule A in the duodenum, ileum, colon, kidney, liver, lung, brain, and skeletal muscle of C57BL mice.</a> Journal of Physiology and Pharmacology. 64 (1), 11-18 (2013).</li>
<li>Frye, C. A., Patrick, C. W. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology+-+Animal%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 38 (4), 208-212 (2002).</li>
<li>Le, G. Y., Essackjee, H. C., Ballard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+adenosine+formation+and+release+by+freshly-isolated+vascular+endothelial+cells+from+rat+skeletal+muscle%3A+Effects+of+hypoxia+and%2For+acidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).</li>
<li>Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Isolation of microvascular endothelial cells.</a> Bio-protocol. 8 (12), (2018).</li>
<li>Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+isolation%2C+culture+and+transplant+of+mouse+skeletal+muscle+derived+endothelial+cells+with+angiogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential.</a> PLoS One. 3 (3), e0001753(2008).</li>
<li>Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+vascularized+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Generation of human vascularized brain organoids.</a> Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.

Les cellules endothéliales microvasculaires fournissent des fonctions de barrière dans tous les tissus et leurs résultats de dysfonctionnement dans les maladies des organes connexes 3. En outre, des études spécifiques d’organes de EC microvasculaire pourraient ouvrir la voie pour de nouvelles stratégies thérapeutiques. Par conséquent, une meilleure compréhension de la fonction d’EC microvasculaire dans des conditions physiologiques et physiopathologiques est d’un grand intérêt scientifique. Modula...

Via la circulation sanguine, les cellules et les organes sont fournis avec l’oxygène, de substrats et d’autres molécules nécessaires. Cet échange se déroule dans les capillaires, les vaisseaux plus petits. Capillaires forment une couche intérieure de cellules endothéliales (EC) dont l’intégrité est une condition préalable au règlement réussi d’homéostasie musculaire entre l’espace intravasculaire et interstitiel. Afin d’assurer une transition sélective des cellules et des facteurs solubles, EC constituent une monocouche reliés entre eux par serrés et de jonctions adherens 1. Outre son rôle de barrière pour les nutriments ou les produits métaboliques, EC régissent le recrutement des leucocytes dans le processus inflammatoire. Dommages d’inflammation ou d’un tissu conduit à une régulation des molécules d’adhérence sur la surface de l’EC et la production des chimiokines facilitant l’attachement de leucocytes et de la transmigration dans les tissus de cible 2. Par conséquent, EC sont gravement impliqués dans la régulation des processus inflammatoires telles que la défense contre les agents pathogènes ou de la réparation des tissus.
Un dysfonctionnement de l’EC est directement associée à des maladies vasculaires, insuffisance rénale chronique, les infections graves pathogène thrombose veineuse. En outre, EC sont pratiquement toujours impliqués dans certains organes auto-immunité telles que diabète ou une sclérose en plaques 3. La fonction de barrière entre la circulation sanguine et les organes est donc contrôlée par une interaction concertée des différents types de cellules. Dans les muscle squelettique cellules endothéliales microvasculaires (CEMG) ainsi que de cellules musculaires, fibroblastes et péricytes forment une unité fonctionnelle, l’unité « myovascular » (MVU). Par conséquent, un dysfonctionnement de la MVU pourrait jouer un rôle essentiel dans la physiopathologie des myopathies. Toutefois, une meilleure compréhension de ces mécanismes de régulation est toujours porté disparue et s’oppose actuellement à l’identification d’objectifs nouveaux, urgentes, thérapeutiques dans les myopathies.
Afin d’étudier les mécanismes physiologiques et physiopathologiques complexes, des modèles animaux sont couramment utilisés. Cependant, en vitro modèles offrent l’avantage de se concentrer sur le sujet d’intérêt en excluant une variété de facteurs de confusion. Pour étudier les processus in vitro, il est nécessaire d’isoler les cellules primaires pures et viables. Contrairement aux lignées cellulaires, piles isolées d’animaux transgéniques permettent d’enquêter sur les conséquences des modifications génétiques in vitro.
Ici, une méthode pour isoler le CEMG murine primaire est décrite à l’aide de dissociation mécanique et enzymatique suivie magnétique cellulaire activé techniques (MCS) pour la purification de tri. À cette fin, des billes magnétiques contre des marqueurs de surface spécifiques sont utilisés. Plaquettes cellules endothéliales molécule d’adhésion-1 (PECAM1, CD31) est principalement exprimée sur le EC et peut être utilisé pour enrichir ce type de cellule. Pour justifier une pureté élevée de cellules, les cellules d’origine hématopoïétique sont exclues par une sélection négative pour la protéine tyrosine phosphatase du récepteur de type C (PTPRC, CD45). En outre, les contrôles de qualité, culture du primaire CEMG murine, applications potentielles et limitations ainsi que des considérations particulières sont présentés.

<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsine-EDTA</td><td>Thermo Fisher</td><td>25200-056</td><td>prêt à l’emploi</td></tr><tr><td>Tampon</td><td></td><td></td> ACK <td>150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA dans l’eau à un pH de 7,3</td></tr><tr><td>Anti-souris CD31-FITC (clone MEC13.3)</td><td>Biolegend</td><td>102506</td><td>Contrôle des isotypes : FITC Rat IgG2a, &kappa ; Isotype Ctrl</td></tr><tr><td>Anti-souris CD45-PE (clone 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103106</td><td>Contrôle des isotypes : PE Rat IgG2b, &kappa ; Isotype Ctrl</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Facteur de croissance des fibroblastes de base</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>CD31 Souris MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-418</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Souris MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase-Dispase</td><td>Roche</td><td>10269638001</td><td>Collagénase de V. alginolyticus, Dispase de B. polymyxa</td></tr><tr><td>Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-conjuguée anti-rat IgG</td><td>antibody dianova</td><td>712-166-153</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (Réactif anti-décoloration ProLong Gold avec DAPI)</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Desoxyribonuclease</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4513</td><td>Désoxyribonucléase I du pancréas bovin</td></tr><tr><td>Eau traitée au diéthylpyrocarbonat</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9916</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, contenant un supplément de glutamine et du pyruvate</td><td>Thermo Fisher</td><td>31966-021</td><td>se réchauffer jusqu’à 37 &deg ; C avant utilisation</td></tr><tr><td>dNTP Mix (10 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0192</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Tubes FACS</td><td>Sarstedt</td><td>551,579</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 &mu ; m Filtre cellulaire</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Tampon</td><td></td><td></td> FC <td>0,1 % BSA, 0,2 % NaN3, 2 mM EDTA</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>Sérum de veau fœtal</td></tr><tr><td>Fixable Viability Dye eFluor780</td><td>Thermo Fisher</td><td>65-0865-14</td><td></td></tr><tr><td>Pince (dentelée, droite, 12 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>Pince (dentelée, droite, 12 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11009-13</td><td></td></tr><tr><td>Seringue à insuline 100 Solo 1 mL (Omnifix)</td><td>Braun</td><td>9161708V</td><td></td></tr><tr><td>grandes colonnes magnétiques (colonnes LS)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>pour tampon</td></tr><tr><td></td><td></td><td>MCS</td> CD45-step <td>0,5 % BSA, 2 mM EDTA dans PBS à un pH de 7,2</td></tr><tr><td>Colonne magnétique moyenne (colonne MS)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>pour CD31-MACS-step</td></tr><tr><td>Eau sans nucléases</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0581</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Saline tamponnée au phosphate, prête à l’emploi</td></tr><tr><td>Tampon PCR (5x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>EP0742</td><td>en kit avec la transcriptase inverse</td></tr><tr><td>Pecam1 rat &alpha ;-souris</td><td>SantaCruz</td><td>Sc-52713</td><td>100 &micro ; g/mL</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Cellules musculaires primaires murines</td><td>celprogen</td><td>66066-01</td><td></td></tr><tr><td>Primer Cdh15 (M-Cadhérin)Thermo</td> <td>Fisher</td><td>Mm00483191_m1</td><td>FAM labellisé</td></tr><tr><td>Primer Cldn5 (claudin-5)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Mm00727012_s1</td><td>FAM labellisé</td></tr><tr><td>Primer Ocln (occludin)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Mm00500912_m1</td><td></td></tr><tr><td>Amorce Pax-7</td><td>Thermo Fisher</td><td>Mm01354484_m1</td><td>Amorce</td></tr><tr><td>Tjp-1 (Zonula occludens 1)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Mm00493699_m1</td><td>FAM étiqueté</td></tr><tr><td>Primer 18s rRNA (contrôle endogène eucaryote)</td><td>Thermo Fisher</td><td>4310893E</td><td></td></tr><tr><td>Tampon qPCR marqué VIC (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>K0231</td><td>2 x 1,25 mL ; pour 200 réactions chacune</td></tr><tr><td>Mélange aléatoire d’amorce monocaténaire</td><td>Thermo Fisher</td><td>SO142</td><td>Amorce hexamère aléatoire</td></tr><tr><td>Transcriptase inverse (200 U/&mu ; L) + tampon PCR (5x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>EP0742</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de la RNASE (40 U/&mu ; L)</td><td>Thermo Fisher</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux (tranchant 23 mm, tranchant/tranchant)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14088-10</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux (tranchant 42 mm, tranchant/émoussé)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-13</td><td></td></tr><tr><td>Speed Coating solution</td><td>PeloBiotech</td><td>PB-LU-000-0002-00</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement de cellules endothéliales microvasculaires primaires murines muscle squelettique

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

Les cellules endothéliales des capillaires du muscle squelettique (cellules endothéliales microvasculaires musculaires, CEMG) mettre en place la barrière entre la circulation sanguine et les muscles squelettiques régissant l’échange de fluides et de nutriments ainsi que la réponse immunitaire contre infectieuses agents en contrôlant la migration des cellules immunitaires. Pour ces fonctions, le CEMG forment une fonctionnelle « myovascular unit » (MVU), avec d’autres types de cellules, telles que les fibroblastes, les péricytes et les cellules musculaires squelettiques. Par conséquent, un dysfonctionnement du CEMG et, par conséquent, le MVU contribue à une grande variété de myopathies. Cependant, les mécanismes régulateurs du CEMG en santé et la maladie restent insuffisamment compris et leur élucidation précède des traitements plus spécifiques pour les myopathies. L’isolement et une enquête approfondie des principales fonctions de CEMG dans le contexte de la MVU pourraient permettre une meilleure compréhension de ces processus.
Cet article fournit un protocole visant à isoler les primaire CEMG murin du muscle squelettique par dissociation mécanique et enzymatique, y compris la purification et les mesures de maintien de la culture.

Un jour après l’isolement, primaire CEMG murin et résiduelle autres cellules forment des conglomérats et adhèrent au fond des récipients de culture (jour 1 dela Figure 1 a ). Du jour 7, cellules plates et allongées peuvent être observés. Toutefois, la contamination des autres, pour la plupart des cellules de sphéroïde, est encore visible (Figure 1 a jour 7). Ainsi, un nouveau cycle de CD31 positive sélection via MCS est ...

Les cellules endothéliales microvasculaires des muscles squelettiques (CEMG) forme la paroi des capillaires musculaires et réglementer les deux, échange de fluides/molécules et la migration des cellules (système immunitaires) entre le sang et les tissus musculaires. Isolement des primaire murine CEMG, comme décrit ici, permet des études in vitro complètes de l’unité « myovascular ».

Isolement de cellules endothéliales microvasculaires primaires murines Muscle squelettique

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Ce protocole décrit une technique de plate-forme pour isoler les cellules endothéliales microvasculaires des muscles squelettiques. Ces cellules peuvent être utilisées, par exemple, pour obtenir d’autres informations sur les fonctions de la barrière musculaire du sang. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu’il est possible d’isoler les cellules endothéliales microvasculaires primaires d’une grande pureté.Cette technique peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des maladies musculaires à base immunitaire telles que l’interaction entre les cellules musculaires et endothéliales dans la santé et la maladie. Tout d’abord, préparez toutes les solutions nécessaires et les plaques de six puits décrites dans le protocole. Pour commencer la procédure pratique, obtenez une paire de ciseaux pointus/émoussés chirurgicaux, une paire de ciseaux pointus/pointus chirurgicaux, et des forceps droits et incurvés.Désinfecter tous les instruments chirurgicaux avec 70% d’éthanol. Placez une souris mâle adulte euthanasié sur le dos et humidifiez les jambes avec 70% d’éthanol. À l’aide des ciseaux chirurgicaux pointus/contondants, couper chaque jambe entière en coupant à l’articulation de la hanche.Placer les extrémités dans un plat de culture cellulaire fermée. Transférer le plat dans une hotte stérile d’écoulement laminaire. Utilisez des ciseaux pointus et des forceps incurvés pour couper la peau ouverte de la hanche à l’extrémité de l’orteil.Utilisez les forceps droits pour tenir l’orteil ou la garniture de pied tout en utilisant les forceps incurvés pour peler la peau de l’orteil à la hanche. Pour isoler le musculus quadriceps femoris, couper le tendon du genou, et couper le muscle le long du fémur à la hanche. Couper le tendon d’Achille pour isoler le musculus triceps surae.Ensuite, couper le long du tibia à la fossa popliteal et enlever le muscle. Pour enlever les tendons qui ne peuvent pas être dissociés, maintenez les muscles avec les forceps incurvés et coupez chaque tendon approprié. Ajouter 2 445 microlitres de solution de digestion préparée à un plat frais et étiqueté de culture cellulaire et déterminer le poids.Transférez tous les morceaux musculaires dans ce plat. Ensuite, déterminez le poids. La différence des deux valeurs mesurées fournit le poids sec du tissu musculaire qui ne doit pas dépasser un gramme.À l’aide des ciseaux pointus chirurgicaux, couper tout le tissu musculaire en petits morceaux. Incuber la suspension tissulaire à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 1,5 heure, en s’assurant de mélanger soigneusement la suspension avec une seringue à insuline d’un millilitre toutes les 20 minutes pendant environ cinq minutes. Après l’incubation, transférer la suspension dans une passoire en nylon de 70 micromètres placée sur un tube étiqueté de 50 millilitres et recueillir le débit à travers.Lavez la passoire cellulaire avec huit millilitres de DMEM et recueillez le flux à travers. Si les pièces branchent la passoire, réutilisez la solution dissociée. Jetez la passoire cellulaire et centrifugeuse la suspension à 300 fois la gravité et à 20 degrés Celsius pendant 10 minutes.Retirez soigneusement le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire dans un millilitre d’un tampon de lysage de potassium de chlorure d’ammonium pour la lyse des globules rouges. Incuber à température ambiante pendant 30 secondes. Ensuite, ajoutez neuf millilitres de DMEM contenant 10%FCS pour arrêter la réaction.Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, utilisez une chambre de comptage des cellules Neubauer pour déterminer les numéros de cellule. Pour commencer à épuiser les cellules CD45 positives, centrifugez la suspension à 300 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.Retirez complètement le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire dans 90 microlitres de tampon MCS. Ajouter 10 microlitres de microbilles DE CD45 et mélanger la suspension. Incuber au réfrigérateur à 4 à 8 degrés Celsius pendant 15 minutes.Après cela, ajouter un millilitre de tampon MCS. Centrifugeuse à 300 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Retirez complètement le supernatant et résuspendez les cellules dans 500 microlitres de tampon MCS.Placez une grande colonne magnétique dans le champ magnétique du séparateur. Rincez le réservoir de la colonne avec trois millilitres de tampon MCS. Ensuite, placez un tube conique de 15 millilitres sous la colonne pour recueillir le flux à travers.Appliquez la suspension cellulaire entière sur la colonne et laissez-la couler complètement. Lavez la colonne trois fois en ajoutant trois millilitres de tampon MCS dans le réservoir pour chaque étape de lavage et en attendant que le réservoir de la colonne soit vide avant de commencer la prochaine étape de lavage. Recueillir les cellules non étiquetées en passant par la colonne pour une utilisation dans d’autres étapes de séparation.Pour commencer à accumuler des cellules CD31 positives, utilisez une chambre de comptage cellulaire Neubauer pour déterminer les numéros de cellules. Ensuite, centrifuger les cellules non étiquetées à 300 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Retirez complètement le supernatant et resuspendez la pastille dans 90 microlitres de tampon MCS.Ajouter 10 microlitres de microbilles DE CD31 et mélanger toute la suspension. Incuber au réfrigérateur à 4 à 8 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après cela, ajouter un millilitre de tampon MCS et centrifugeuse à 300 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.Enlevez le supernatant et réutilisez les cellules dans 500 microlitres de tampon MCS. Placez la colonne magnétique moyenne dans le champ magnétique du séparateur. Rincez la colonne avec 500 microlitres de tampon MCS.Ensuite, placez un tube conique de 15 millilitres sous la colonne pour recueillir le flux à travers. Appliquez toute la suspension cellulaire sur la colonne et laissez-la couler complètement à travers. Lavez la colonne trois fois en ajoutant 500 microlitres de tampon MCS dans le réservoir pour chaque étape de lavage, et attendez que le réservoir de la colonne soit vide avant de commencer la prochaine étape de lavage.Les cellules non étiquetées passant la colonne représentent la fraction CD45-négative, CD31-négative. Conservez-les pour d’autres contrôles de qualité. Ensuite, retirez la colonne du séparateur et placez-la sur un tube de collecte approprié.Pipette deux millilitres de tampon MCS sur la colonne. Poussez immédiatement le piston dans la colonne pour rincer les cellules étiquetées magnétiquement. Cette fraction CD45-négative, CD31-positive représente les CE murines primaires enrichies.Centrifuger la suspension cellulaire à 350 fois la gravité et à 20 degrés Celsius pendant cinq minutes. Retirez complètement le supernatant et résuspendez les cellules en un millilitre de milieu cellulaire endothélial. Transférer les cellules dans un seul puits d’une plaque de culture enduite de six puits contenant un millilitre de milieu cellulaire endothélial.Pour la culture, incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone dans un incubateur stérile, en s’assurant de rafraîchir le milieu tous les deux à trois jours. Lorsque les cellules sont à 80 à 90% confluent, rincer chaque puits contenant des cellules deux fois avec deux millilitres de PBS en deux étapes consécutives de lavage. Ensuite, ajoutez 800 microlitres de trypsine EDTA solution à chaque puits et couvez à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone dans un incubateur stérile pendant trois à cinq minutes.Après cela, ajouter 1200 microlitres de DMEM contenant au moins 10% FCS pour arrêter l’activité enzymatique. Centrifugeuse à 350 fois la gravité et à 20 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, accumulez les cellules CD31 comme décrit précédemment pour augmenter la pureté.Utilisez un champ lumineux ou un microscope à contrat de phase standard avec grossissement de 20 % et ouverture numérique de l’objectif de 0,35 pour observer la confluence cellulaire. Dans cette étude, les cellules endothéliales microvasculaires microvasculaires primaires de muscle squelettique de murine sont isolées. Un jour après l’isolement, les MOC murines primaires et les autres cellules résiduelles forment des conglomérats et adhèrent au fond des plats de culture.À partir du septième jour, on peut observer des cellules plates et allongées, mais la contamination d’autres cellules, principalement sphéroïdes, est encore visible. Ainsi, un autre cycle de sélection CD31-positif via MCS est nécessaire. Par la suite, les MOC murines primaires prolifèrent à une densité d’environ 80 à 90 % à la confluence, elles forment généralement un monocouche non superposé de cellules alignées longitudilement.La prolifération s’arrête à la confluence en raison de l’inhibition du contact. Le contrôle de la qualité par cytométrie de débit montre des valeurs à la fois pour la viabilité et la pureté allant d’environ 70% chacune pour les cellules immédiatement après l’isolement. Les cellules cultivées après une autre sélection CD31-positive via MCS montrent des valeurs satisfaisantes pour la pureté ainsi que pour la viabilité, allant jusqu’à 95% chacune.Les cellules obtenues sont ensuite étudiées pour l’expression génétique des gènes marqueurs cellulaires satellites musculaires jumelés protéine boîte 7 et M-cadhérine au niveau de l’ARNm par PCR quantitatif. Comme prévu, seules la fraction CD45-négative, CD31-négative ainsi que les cellules musculaires murines primaires différenciées ont exprimé la protéine de boîte 7 et M-cadhérine, tandis que CD45-négatif, CD31-positif et les MMC murines primaires sont négatifs pour ces marqueurs. Après la deuxième étape cd31 MCS, qPCR est utilisé pour évaluer l’expression des protéines de jonction serrées dans les MOC murines primaires confluentes.On voit des MMECs murines primaires exprimer des niveaux élevés de claudin-5, d’occludin, et d’occludens-1 de zonula, tandis que pmMC montrent seulement une faible expression de zonula occludens-1. Cette technique peut être effectuée en cinq à six heures. Suivant ce protocole, d’autres méthodes telles que des analyses de migration ou des expériences de stress à bas cisaillement peuvent être effectuées pour répondre à d’autres questions.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez être en mesure d’isoler les cellules endothéliales microvasculaires primaires des muscles squelettiques par la mécanique et la dissociation enzymatique et le tri des cellules magnétiques.

isolation-primary-murine-skeletal-muscle-microvascular-endothelial

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Ici, nous décrivons un protocole pour l'isolement et la culture de cellules endothéliales murines pulmonaires. Cette méthode comprend mécanicien et dissociation enzymatique du tissu pulmonaire ainsi que d'un processus de purification en 2 étapes utilisant des anticorps anti-PECAM-1 et anti-ICAM-2 anticorps conjugués à des billes magnétiques, ce qui produit une population de cellules endothéliales pures d'origine essentiellement microvasculaires.

Isolement et culture de cellules endothéliales pulmonaires des souris néonatales

Nous présentons une préparation pour la visualisation et la manipulation de la signalisation calcique dans indigène, intact endothélium microvasculaire. Tubes endothéliales fraîchement isolées des artères de résistance de souris fournissant le muscle squelettique de conserver la morphologie in vivo et la signalisation dynamique au sein et entre les cellules voisines. Tubes endotheliales peuvent être préparés à partir de micro-vaisseaux d'autres tissus et organes.

Isolation de microvasculaire endothéliale des artères de résistance Tubes souris

L'isolement et la culture d'une population pure de cellules satellites quiescentes, une population de cellules souches musculaires, est essentielle à la compréhension de muscle tige de la biologie cellulaire et la régénération, ainsi que la transplantation de cellules souches pour des thérapies dans la dystrophie musculaire et d'autres maladies dégénératives.

L&#39;isolement, la culture, et la transplantation de cellules satellites du muscle

Les vaisseaux sanguins à l'intérieur du squelette port musculaire plusieurs populations de précurseurs multi-lignée humaine qui sont idéales pour les applications de régénération. Cette méthode permet l'isolement de purification simultanée de trois populations de cellules précurseurs pluripotentes respectivement à partir de trois couches de structure des vaisseaux sanguins: les cellules myogéniques endotheliales de l'intima, média de péricytes et les cellules de l'adventice de l'adventice.

Isolement des vaisseaux sanguins dérivés multipotentes précurseurs du muscle squelettique humain

La capacité d’isoler les cellules endothéliales valvulaires cardiaques (VEC) est essentielle pour comprendre les mécanismes de développement, de maintenance et de maladie des valves.  Nous décrivons ici l’isolement des VEC à partir de souris Tie2-GFP embryonnaires et adultes à l’aide de FACS qui permettra de réaliser des études déterminant la contribution des VEC dans les processus de développement et de maladie.

Isolement des cellules endothéliales murines Valve

Les cellules endothéliales microvasculaires cérébrales (BMEC) sont interconnectées par des protéines jonctionnelles spécifiques formant une barrière hautement régulée séparant le sang et le système nerveux central (SNC), ce que l’on appelle la barrière hémato-encéphalique (BHE). L’isolement des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales primaires murines, comme nous l’avons vu dans ce protocole, permet des études in vitro détaillées de la BHE.

Isolement de cellules primaires murins cerveau endothéliales microvasculaires

Les cellules endothéliales vasculaires jouent un rôle important dans de nombreux troubles cardiovasculaires importants. Cet article décrit une méthode simple pour isoler et étendre les cellules endothéliales de l’aorte de souris sans utiliser d’équipement spécial. Notre protocole fournit un moyen efficace d’identifier les mécanismes de la physiopathologie des cellules endothéliales.

L&#39;isolement et la culture primaire de cellules endothéliales aortiques de souris

Le but de ce protocole est de démontrer les techniques d'isolement et de culture de cellules murines primaires musculaires lisses vasculaires (CMLV) de la circulation coronaire. Une fois que les CMLV ont été isolés, ils peuvent être utilisés pour de nombreuses techniques de culture standard.

Isolement de murin coronaire vasculaires cellules de muscle lisse

Ce travail décrit un protocole basé sur FACS qui permet un isolement facile et simultané des pericètes de type I et de type II provenant des muscles squelettiques.

Isolation des Pericytes de Type I et de Type II des Muscles Squelets de la Souris

Dans cet article, des cellules endothéliales pulmonaires primaires ont été isolées et cultivées à partir de souris néonatales.

Isolement de cellules endothéliales pulmonaires primaires de souris

Ce protocole fournit une méthode standardisée pour isoler et enrichir les myoblastes primaires du muscle squelettique de la souris adulte et néonatale via la dissociation tissulaire, la filtration séquentielle, le préplaque et des conditions de culture définies, permettant l’établissement et le maintien de cultures de myoblast dérivées des cellules satellites pour des applications expérimentales en aval.

Isolement des cellules satellites du muscle squelettique pour les études de myogenèse in vitro

Découvrez l'isolement de cellules endothéliales microvasculaires primaires du muscle squelettique murin. Cette méthode à haute pureté permet d'étudier les interactions muscle-endothélium et la barrière sang-muscle.

Isolement de cellules endothéliales microvasculaires primaires murines Muscle squelettique

Explorer plus de vidéos