Name: Méso-échelle Particle Image Velocimetry études de neurovasculaire Flows In Vitro (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Découvrez la fabrication de fantômes neurovasculaires transparents et la caractérisation des flux par vélocimétrie d'images de particules. Cette méthode accessible améliore la précision des expériences en bio-ingénierie.

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Les auteurs reconnaissent un soutien partiel pour ce projet fourni par une subvention de démarrage Collaborative de l’Office de la recherche et le développement économique à UC Riverside.

1. Fabrication de moule sacrificiel ABS-base
<ol><li>Concevoir un modèle inverse du fantôme tissu désiré à l’aide de logiciels de CAO.</li>
	<li>Imprimer le modèle en utilisant une imprimante 3D avec ABS comme le matériau de construction.</li>
</ol>2. base PDMS vasculaire Fabrication fantôme
<ol><li>
Mélange
	<ol>
<li>Mélanger la base prépolymère de PDMS et de salaison dans un rapport de 10:1 (en poids) ; un mélange de 66 g fournit suffisamment de matière pour la fabrication de fantômes avec des volumes jusqu'à 50 cm3.</li>
		<li>Placer le mélange dans un dessiccateur à vide pendant 60 min pour dégazer et minimiser le piégeage de bulles. Pressurisation cyclique/dépressurisation permet de faciliter la rupture de la bulle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Casting
	<ol>
<li>Monter le moule ABS imprimé sur une lame de verre à l’aide de mastic de moulage pour sceller l’interface.</li>
		<li>Verser délicatement le mélange PDMS dans le moule tout en essayant de minimiser le piégeage de bulles. Des bulles persistantes peuvent se rompre manuellement à l’aide d’une aiguille.</li>
		<li>Guérir le fantôme de cast à température ambiante (25 ° C) pendant au moins 24 h. Remarque : À des températures plus élevées, ce processus peut être accéléré22.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Démoulage de
	<ol>
<li>Dissoudre l’ABS en submergeant le fantôme dans l’acétone et la sonification pendant au moins 15 min, à l’aide de puissances jusqu'à 70 w. ATTENTION : L’acétone est une haute pression de vapeur à température ambiante et un point d’éclair bas. Par conséquent, toujours travailler sous une hotte aspirante et loin des sources d’inflammation potentielles. Porter un équipement de protection personnels (bouclierpar exemple, des lunettes ou du visage, blouse, des gants résistant à l’acétone).</li>
		<li>Rincer abondamment le fantôme avec l’alcool isopropylique et, ensuite, l’eau distillée pour enlever les résidus de solvants. Remarque : Le PDMS se gonfle au contact de l’acétone ; Cependant, l’enflure disparaît une fois que le fantôme est rincé et séché suffisamment23.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Confirmation de fidélité fantôme à l’aide de la microscopie optique
	<ol>
<li>À l’aide d’un microscope optique avec une caméra attachée et le logiciel de capture d’image, capture d’une image d’une fonction critique dans le fantôme sous un grossissement qui maximise la fonction dans le champ de vision.</li>
		<li>Capturer une image d’un réticule d’étalonnage appropriés au même grossissement.</li>
		<li>Charger les deux images dans ImageJ en les faisant glisser sur la barre d’outils.</li>
		<li>Cliquez sur l’image du réticule de calibrage pour le rendre actif et, ensuite, sélectionnez l’outil en ligne . À l’aide de la souris, tracez une ligne le long d’une caractéristique d’une distance connue et sélectionnez Analyze > échelle de la valeur dans le menu ImageJ. Remarque : Dans la fenêtre de l’Échelle définie , le champ intitulé la Distance en pixels devrait être prérempli avec la longueur de la ligne tracée en unités de pixels.</li>
		<li>Entrez la longueur de la fonctionnalité dans le champ intitulé Distance connueet son unité dans le champ Unité de longueur. Cochez la case intitulée Global pour appliquer ce facteur d’étalonnage à toutes les images ouvertes.</li>
		<li>Activer l’image de la fonction critique fantôme et utiliser l’outil de ligne de tracer une ligne le long d’une caractéristique d’intérêt. Dans le menu ImageJ, sélectionnez Analyze > mesure (ou appuyez sur Ctrl + M) pour mesurer la longueur de la ligne.</li>
		<li>Comparer la valeur attendue contre la valeur dans la colonne intitulée longueur dans la fenêtre résultats pour confirmer la fidélité fantôme.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. se moquer de sang Solution Formulation
<ol><li>Mélanger DI glycérol dans une proportion de 60/40 et l’eau (en volume). Remarque : Un volume de 100 mL est suffisant pour le système circulatoire en vitro décrit ci-après.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de solution de bille de polystyrène fluorescent 2,5 % p/v (c.-à-d., les particules de traceur) à la solution du faux sang.</li>
	<li>Homogénéiser le mélange sur une plaque d’agitation magnétique à 400 tr/min pendant 10 min.</li>
</ol>4. in Vitro paramétrage du système circulatoire
<ol><li>
Mise en place de la pompe
	<ol>
<li>Utiliser un outil de décapant à fil pour couper la fiche DC-fin de la source d’alimentation adaptateur alternatif-continu.</li>
		<li>Enlever le revêtement de l’appareil hors tension et au sol fils et les raccorder à la borne d’entrée du régulateur de tension pulse width modulation (PWM).</li>
		<li>Connecter les fils d’alimentation et de masse du moteur à courant continu de la pompe à la borne de sortie du régulateur PWM tension. NOTE : L’afficheur 7 segments de la PWM sorties le rapport cyclique (0 % - 100 %) utilisé pour atteindre une tension variable pour le moteur à courant continu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Étalonnage de la pompe
	<ol>
<li>Préparez 200 mL de solution de faux sang (voir section 3).</li>
		<li>Déposer le tube à partir de l’entrée de la pompe dans le bécher de tenir la solution du faux sang.</li>
		<li>Déposer le tube de refoulement de la pompe à un récipient vide.</li>
		<li>Sélectionnez un point de consigne du cycle voulu devoir (0 % - 100 %). Appuyez sur le bouton On et démarrer un minuteur.</li>
		<li>Arrêter la minuterie une fois que la pompe a transféré la totalité du volume de solution de faux sang. Ce temps permet de calculer le débit volumétrique.</li>
		<li>Répétez les étapes 4.2.1 - 4.2.5 au moins cinq points de réglage de cycle droits différents établir une courbe de régression des moindres carrés. NOTE : Un minimum de trois points répétées par duty cycle consigne est recommandé. Cette relation peut être utilisée pour corréler le débit souhaité pour le cycle PWM requis.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. video Collection
<ol><li>
Calibration de l’image
	<ol>
<li>Déterminer le rapport d’étalonnage pour l’imagerie vidéo (voir chapitre 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Installation de l’appareil
	<ol>
<li>Placez le fantôme PDMS sur la scène de la microscopie à fluorescence.</li>
		<li>Connectez le fantôme à la pompe à engrenages et introduire la solution de faux sang. Remarque : Vous pouvez également inscrire le modèle avec de l’éthanol pour faciliter la pleine mouillage ; Ensuite, rincer et remplir avec la solution de faux sang. Cela peut être particulièrement bénéfique pour les modèles avec des bateaux plus petits et/ou fonctionnalités aveugles.</li>
		<li>Définissez le contrôleur de moteur de pompe pour le débit désiré basé sur la courbe d’étalonnage de pompe.</li>
		<li>Faire fonctionner la pompe pendant 1-5 min avant l’expérience pour garantir des conditions stationnaires.</li>
		<li>Allumez la lampe externe pour éclairer le champ de vision. Sélectionnez un filtre approprié basé sur la longueur d’onde d’excitation des perles fluorescentes.</li>
		<li>Ajuster le plan focal d’imagerie pour le plan médian de navire. Remarque : Ceci peut être réalisé en utilisant une focale qui maximise la section transversale du navire imagés (par exemple, lorsque vous utilisez des fantômes avec récipient circulaire sections efficaces) ; et/ou d’indexation hors d’une fonctionnalité fantôme conçue pour faciliter l’identification du plan médian du navire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Enregistrement vidéo
	<ol>
<li>Sélectionnez les paramètres d’enregistrement vidéo pour optimiser le rapport signal sur bruit (SNR). Principaux paramètres incluent le temps d’exposition, taux d’armature et gagner. Remarque : Dans ce protocole, nous utilisons une cadence de 2 000 images par seconde et un gain de 1.0. Cependant, ces paramètres peuvent varier selon le l’application (voir la section « discussion » pour plus de détails).</li>
		<li>Recueillir la vidéo et l’enregistrer au format AVI.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Nettoyage fantôme
	<ol>
<li>Si la perle-collage est observé après une expérience, laisser agir le fantôme dans une solution détergente aqueuse à l’aide de puissances jusqu'à 70 w.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. traitement et analyse des données de l’image
<ol><li>
Prétraitement d’image
	<ol>
<li>Faites glisser le fichier AVI enregistré sur la fenêtre ImageJ pour l’importer. Sélectionnez la case convertir en niveaux de gris.</li>
		<li>Dans le menu ImageJ , sélectionnez Analyze > histogramme génère (ou appuyez sur Ctrl + H) pour générer un histogramme des intensités de pixels d’image. Prenez note de la moyenne et l’écart-type de l’image non transformé. Remarque : À des cadences élevées, il n’est pas inhabituel pour la distribution à être fortement biaisé vers zéro (c.-à-d., aucun signal).</li>
		<li>Dans le menu ImageJ , sélectionnez Image > réglage > luminosité et contraste (ou appuyez sur Maj + Ctrl + H) pour appliquer un filtre de luminosité/contraste.</li>
		<li>Dans le menu de la luminosité et du contraste , appuyez sur la touche Set pour définir les limites de l’image. La valeur minimale pour la valeur moyenne et un écart-type et la valeur maximale à l’intensité maximale de l’image (tous deux basés sur les statistiques obtenues à l’étape 6.1.2). Remarque : Ceci élimine généralement tous, mais les 10 % de l’intensité du pixel. Le nombre d’écarts peut-être être modifié selon la répartition souhaitée des intensités du pixel. Un script de macro personnalisée permettant d’effectuer l’intensité opération de bouchage est fourni dans les Matériaux supplémentaires.</li>
		<li>Dans le menu ImageJ , sélectionnez processus > bruit > anti-parasites pour réduire le nombre de pixels saturés. Remarque : Cette opération est rendue nécessaire par le risque accru de saturation de pixel qui se pose au cours de l’optimisation de la luminosité et le contraste, ce qui peut produire des vecteurs de parasites au cours de la corrélation croisée ultérieure.</li>
		<li>Dans le menu ImageJ , sélectionnez processus > Filtres > Flou gaussien avec un rayon de 1,5 à réduire les artefacts résultant de la suppression occasionnelle de pixels lumineux dans un quartier de 3 x 3 par l’avant l’opération de nettoyage.</li>
		<li>Cliquez sur l’outil polygone et, ensuite, cliquez sur l’image pour décrire la région d’intérêt (ROI).</li>
		<li>Dans le menu ImageJ , sélectionnez Edit > clair à l’extérieur du pour enlever le bruit du capteur dans des endroits où aucun signal n’est prévu (p. ex., zones situées au-delà de la limite de mur de navire), qui peuvent diminuer la SNR global.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Calcul de PIV Remarque : Cette partie du protocole emploie un tiers PIV plug-in pour ImageJ, qui s’appuie sur des PIC gaussien-ajustage de précision pour permettre une estimation de déplacement avec une précision sous-pixel.<ol>
<li>Dans le menu ImageJ , sélectionnez Plugins > Macros > exécuter... et accédez à la macro enregistrée Code supplémentaire 2. ijjm à Croix-corrélat couples d’images successives. Remarque : La macro se déroule comme suit. 1) une corrélation croisée du champ intensité dans les images consécutives est tout d’abord effectuée afin de déterminer le déplacement local de particules d’advection traceur (c'est-à-dire, la première image paire se compose des première et deuxième images, la deuxième paire d’image se compose des deuxième et troisième images, etc.). 2) une évaluation de plusieurs passages en deux étapes est ensuite exécutée avec des tailles de fenêtre interrogatoire initial et final de 256 x 256 pixels et 128 x 128 pixels, respectivement. Enfin, 3) la macro effectue une moyenne temporelle pour réduire l’apparence des vecteurs de parasites.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Test de la médiane normalisée (NMT)
	<ol>
<li>Dans le menu ImageJ , sélectionnez Plugins > Macros > exécuter... et accédez à la macro enregistrée Code supplémentaire 3. ijjm pour valider les champs de vitesse le via le test médian normalisé. Remarque : La macro se déroule comme suit. 1) chaque vecteur dans un champ de vecteur instantané est tout d’abord par rapport à ses plus proches huit voisins pour calculer la valeur médiane. 2) le tableau d’erreurs résiduelles est ensuite calculé comme la différence entre chaque vecteur voisine et la médiane calculée. 3) la différence entre le vecteur incriminés et la valeur médiane de vecteur voisine est alors normalisée par la médiane des valeurs résiduelles. 4) Ceci est ensuite comparée à une valeur seuil (en général, les pixels de 0,2), qui peut varier selon priori connaissance du bruit lors de l’acquisition de l’image. Enfin, 5) une moyenne temporelle tous validés instantanée des champs de vecteurs est effectuée afin de produire un champ composite, comme cela a été montré pour augmenter le vecteur champ qualité24.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à déclarer.

Le protocole décrit ci-après décrit une méthode simplifiée pour la réalisation d’études de la PIV pour visualiser neurovasculaire coule aux dimensions physiologiquement pertinentes et flux des conditions in vitro. Ce faisant, elle sert à compléter les protocoles rapportés par d’autres qui ont aussi porté sur la simplification de la quantification des champs de vecteurs, mais dans des contextes très différents qui nécessitent que l’examen de longueur beaucoup plus grande échelles25 ou bas ...

PIV est largement utilisé en mécanique des fluides expérimentale pour la visualisation de l’écoulement et des enquêtes quantitatives de mouvements fluides qui varient à l’échelle de longueur d’atmosphérique à flux microcirculatoire1,2,3. Bien que les détails de sa mise en œuvre peuvent varier aussi largement que ses applications, un aspect commun à presque toutes les études PIV est l’utilisation de l’imagerie vidéo de traceur particules ensemencées dans le fluide de travail, suivi d’une analyse par paires des trames d’images consécutives pour extraire les caractéristiques du débit souhaité. En général, ceci est accompli en premier subdiviser chaque trame d’image dans des régions plus petites appelées windows de l’interrogatoire. En raison de la position aléatoire des particules dispersées, chaque fenêtre d’interrogation contienne une distribution unique des intensités de pixels. Si la fréquence d’acquisition des données et la taille fenêtre est choisi de manière appropriée, la corrélation croisée de l’intensité de signal dans chaque fenêtre peut être utilisée pour estimer le déplacement moyen dans cette région. Enfin, étant donné que le grossissement et la cadence sont connus des paramètres expérimentaux, un champ de vecteurs Vitesse instantanée peut être facilement calculé.
Un avantage majeur de PIV sur des techniques de mesure de point unique est sa capacité à mapper les champs de vecteurs sur un domaine de deux ou trois dimensions. Les applications hémodynamiques, en particulier, ont bénéficié de cette capacité, puisqu’elle permet une étude approfondie des flux les, qui sont connus pour jouer un rôle important dans la maladie vasculaire ou la retouche (p. ex., l’athérosclérose, l’angiogenèse) 4 , 5 , 6. c’est également pour l’évaluation des flux neurovasculaire, et leurs interactions avec les dispositifs endovasculaires (p. ex., inverseurs de courant, stents, bobines intrasaccular), depuis les longueur-échelles pertinentes dans de telles applications peuvent souvent couvrent un ou plus ordres de grandeur (par exemple, du micromètre au millimètre) et la géométrie de l’appareil et placement peut un impact significatif sur la mécanique des fluides local7.
La plupart des groupes effectuant des études hémodynamiques PIV ont compté sur des montages expérimentaux qui imitent certaines des premières enquêtes de stent influence sur le flux vasculaire7,8. En général, il s’agit un) pulsé lasers et des caméras à haute vitesse, pour capturer les flux haute vitesse ; b) synchroniseurs, afin d’éviter le crénelage entre la fréquence d’impulsion du laser et de la fréquence d’images de caméra acquisition ; c) cylindrique optique, pour former une nappe de lumière et, ainsi, réduire au minimum la fluorescence de fond de particules traceur au-dessus et au-dessous du plan de l’interrogatoire ; d) dans le cas des systèmes commerciaux de clés en main, paquets de logiciels propriétaires, pour effectuer les analyses de corrélation croisée. Cependant, bien que certaines applications nécessitent la performances et une polyvalence collectivement offertes par ces composants, beaucoup d’autres le font pas. En outre, le coût élevé du tissu sur le marché de produits locaux fantômes qui récapitulent les structures vasculaires désirées peuvent également s’avérer limitant pour les études nombreuses in vitro , en particulier pour les fantômes avec dispose ce pont le régime de méso-échelle (> 500 USD / alimentation fantôme). Ici, nous présentons l’élaboration d’un protocole simplifié pour l’exécution de PIV pour la visualisation in vitro des flux neurovasculaire, qui généralement se trouvent tous deux dans l’espace et dans le temps au sein du régime de méso-échelle (c.-à-d., des échelles de longueur allant de Planck au millimètre et les vitesses jusqu'à plusieurs dizaines de millimètres/seconde). Le protocole vise à exploiter les ressources déjà à la disposition de nombreux chercheurs de bio-ingénierie, abaissant ainsi la barrière à l’entrée pour les profanes.
Le premier élément de ce protocole implique l’utilisation d’une technique de coulée d’investissement pour permettre la fabrication interne du transparent, polydiméthylsiloxane (PDMS)-base de fantômes de tissu de 3-D-imprimé sacrificiels moules. En misant sur la disponibilité croissante des imprimantes 3-d au cours des dernières années, notamment ceux de partagé/multi-user installations (p. ex., installations institutionnelles ou makerspaces public), cette méthode réduit les coûts considérablement (par exemple, < 100 USD/phantom dans le cas présenté ici), tout en permettant un revirement rapid pour la fabrication d’une grande variété de conceptions et de géométries. Dans le protocole actuel, une déposition fusionnée système de modélisation est utilisée avec l’acrylonitrile butadiène styrène (ABS) comme le matériau de construction, et la partie imprimée sert un moule sacrificiels pour le casting de fantôme ultérieur. Notre expérience a montré que l’ABS est bien adapté pour un tel usage car il est soluble dans les solvants courants (p. ex., acétone), et il a suffisamment de solidité et de rigidité pour maintenir l’intégrité de la moule après le retrait du soutien matériel (par exemple, à empêcher la déformation ou fracture des fonctionnalités diminutif de moule). Dans le protocole actuel, moule intégrité est assurée plus loin en utilisant des modèles imprimés solides, bien que cela se fait aux dépens des temps de dissolution accrue. L’utilisation de modèles creux est également possible dans certains cas, à promouvoir l’accès du solvant et ainsi, réduire le temps de dissolution. Cependant, attention il faudrait à l’effet cela peut avoir sur l’intégrité de la moule. Enfin, tandis que les fantômes fabriqués dans les présentes sont basées sur les représentations idéalisées des structures neurovasculaires générées à l’aide d’un progiciel de conception assistée par ordinateur (CAO) commun, le protocole devrait être prête à la fabrication des plus complexes , aussi bien des géométries spécifiques à un patient (par exemple, via l’utilisation des fichiers de modèle générés par la conversion des données d’imagerie cliniques à la. STL format de fichier utilisé par la plupart des imprimantes 3-d). Plus de détails concernant le processus de fabrication fantôme figurent à l’article 2 du protocole.
Le deuxième élément du protocole implique l’utilisation d’une plug-in pour ImageJ mener les analyses de corrélation croisée9open-source. Cela va de pair avec la mise en œuvre d’un régime de simple seuillage statistique (c.-à-d., intensité bouchage)10 pour améliorer le signal de l’image avant de corrélation croisée, ainsi qu’un système de validation postcorrelation vector, le normalisée test médian (NMT), pour éliminer les parasites vecteurs via une comparaison de chacune de ses plus proches voisins11. Collectivement, cela permet d’imagerie être accompli en utilisant le matériel couramment trouvé dans de nombreux laboratoires de bio-ingénierie, éliminant ainsi le besoin pour l’acquisition d’un grand nombre des composants coûteux de systèmes typiques de PIV (p. ex., laser pulsé, synchroniseur, optique cylindrique et un logiciel propriétaire). Plus de détails sur la collection de vidéos, traitement d’images et analyse de données sont fournis dans les sections 5 et 6 du protocole.
La figure 1 illustre la mise en place PIV utilisé dans le présent protocole, qui s’appuie sur un microscope à fluorescence équipé d’une caméra haute vitesse pour l’imagerie, ainsi que de l’externe, source de lumière blanche continue (c.-à-d., lampe aux halogénures métalliques) pour par objectif éclairage volumétrique. Une pompe à vitesse variable est utilisée pour imposer le débit de recirculation d’une solution transparente sang simulé par les fantômes de tissu neurovasculaire. La solution est composée d’un mélange 60/40 (DI) de l’eau désionisée et du glycérol, qui est un substitut commun pour sang dans hémodynamiques études12,13,14, due à un) sa densité et sa viscosité (c.-à-d., similaire 1 080 kg/m3 et 3,5 cP vs 1 050 kg/m3 et 3-5 cP pour le sang)15,16; b) sa transparence dans le domaine du visible ; c) son indice de réfraction similaire au PDMS (1,38 vs 1,42 pour PDMS)17,18,19,20, minimisant la distorsion optique ; d) la facilité avec laquelle les comportement non-newtonien peut être introduit, le cas échéant, par l’ajout de xanthane21. Enfin, les billes de polystyrène fluorescents sont utilisés sous forme de particules de traceur (10,3 µm de diamètre ; 480 nm/501 nm excitation/émission). Alors que les perles de façon neutre flottants sont souhaitées, sourcing de particules traceur avec d’excellentes propriétés mécaniques fluides (p. ex., densité, taille, composition) et de la longueur d’onde d’émission peut s’avérer difficile. Par exemple, les perles utilisées dans les présentes sont légèrement moins denses que la solution de glycérol (1 050 kg/m3 vs 1 080 kg/m3). Cependant, les effets hydrodynamiques, ceux-ci, sont négligeables, étant donné que la durée d’une expérience typique est beaucoup plus courte que l’échelle de temps associée aux effets de flottabilité (c.-à-d., 5 min et 20 min, respectivement). Autres détails concernant l’installation de faux sang solution formulation et in vitro du système circulatoire sont fournis dans les sections 3 et 4 du protocole.

<table><tbody><tr><td>Solidworks 2015</td><td>Dassault Systems</td><td>N/A</td><td>CAD Software&nbsp ;</td></tr><tr><td>Dow Corning Sylgard 184 Kit</td><td>Ellsworth Adhésif</td><td>184 SIL ELAST KIT 3.9KG</td><td>PDMS</td></tr><tr><td>Kit Stratasys Dimension Elite</td><td>Stratasys</td><td>9180-00105</td><td>Imprimante 3D</td></tr><tr><td>P430 Matériau du modèle Cartouche</td><td>Stratasys</td><td>340-21202</td><td>Matériau de construction ABS&nbsp ;</td></tr><tr><td>P400 SR Matériau de support soluble Cartouche</td><td>Stratasys</td><td>340-30200</td><td>Matériau de support</td></tr><tr><td>CleanStation DT3</td><td>PM3 Technologies</td><td>00-00300R</td><td>Bain de base</td></tr><tr><td>Lindberg Blue M LGO Box Furnace&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>LB305745M</td><td>Oven</td></tr><tr><td>21G BD PrecisionGlide Needle</td><td>Betcon Dickenson</td><td>BD 305167</td><td>Perforateur ramifié segment de moule</td></tr><tr><td>Dessiccateur (Vide)</td><td>Polylab</td><td>55205</td><td>Dessiccateur</td></tr><tr><td>Branson 1800 Utrasonic Cleaning</td><td>Branson</td><td>CPX-952-116R</td><td>Sonicator</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Chemical</td><td>A9494</td><td>Acétone</td></tr><tr><td>Alcool isopropol</td><td>Fisher Chemical</td><td>A4514</td><td>Alcool isopropol</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Fisher Chemical</td><td>GW33500</td><td>Glycérol</td></tr><tr><td>10um Polystyrène Jaune-Vert Particules fluorescentes</td><td>Magsphere</td><td>PSF-010UM</td><td>Perles fluorescentes</td></tr><tr><td>Phantom Miró&nbsp ;</td><td>Vision Research</td><td>Miro M310</td><td>Caméra haute vitesse</td></tr><tr><td>Micropompe</td><td>Cole-Parmer</td><td>81101</td><td>Pompe de recirculation</td></tr><tr><td>Leica DM2000 Leica</td><td>Microsystems</td><td>DM2000</td><td>Microscope fluorescent</td></tr><tr><td>Leica 10X Objectif Leica</td><td>Microsystems</td><td>506259</td><td>pour perforateur</td></tr><tr><td>Leica 2.5X Objectif</td><td>Leica Microsystems</td><td>11506083</td><td>Objectif sac d’anévrisme</td></tr><tr><td>Leica Blue Filter Cube L5</td><td>Leica Microsystems</td><td>513840</td><td>Cube de filtre bleu</td></tr><tr><td>Leica EL6000</td><td>Leica Microsystems</td><td>11504115</td><td>Source lumineuse</td></tr><tr><td>Alconox</td><td>Alconox Inc</td><td>1104-1</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>N/A</td><td>Logiciel d’analyse d’images open source https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Particle Image Velocimetry Plugin PIV</td><td>Qingson Tseng</td><td>N/A</td><td>https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv</td></tr></tbody></table>

méso-échelle particle image velocimetry études de neurovasculaire flows in vitro

Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro

Vélocimétrie par image de particules (PIV) est utilisé dans un large éventail de domaines, en raison de l’occasion, qu'il prévoit précisément, visualiser et quantifier les flux à travers une large gamme de spatio-temporelle. Cependant, son application nécessite généralement l’utilisation de l’instrumentation coûteuse et spécialisée, ce qui limite son utilité plus large. En outre, dans le domaine de la bio-ingénierie, des études in vitro flux visualisation sont aussi souvent plus limitée par le coût élevé des fantômes de tissu sur le marché de produits locaux que récapituler les structures anatomiques désirés, particulièrement pour ceux qui étendre le régime de méso-échelle (c.-à-d., Planck à des échelles de longueur millimètre). Ici, nous présentons un plan expérimental simplifié mis au point pour pallier ces lacunes, dont les éléments clés comprennent 1) une méthode relativement faible coût de fabrication des fantômes de tissu de méso-échelle utilisant l’impression 3D et le moulage de silicone et 2) une cadre de l’analyse et le traitement d’Open source image qui réduit la demande sur l’instrumentation pour la mesure des flux de méso-échelle (c.-à-d., des vitesses jusqu'à plusieurs dizaines de millimètres/seconde). Collectivement, il permet d’abaisser la barrière à l’entrée pour les profanes, en s’appuyant sur des ressources déjà à la disposition de nombreux chercheurs de bio-ingénierie. Nous demonstratethe application du présent protocole dans le cadre de la caractérisation des flux neurovasculaires ; Toutefois, il devrait intéresser un plus large éventail d’applications de méso-échelle en bio-ingénierie et au-delà.

La figure 2 illustre le processus de fabrication fantôme PDMS tissulaire. Les fantômes conçus dans la présente sont destinés à l’étude des écoulements dans idéalisé à col large, sacciforme intracrânien avec collet large, ainsi que les artères perforant ramification proximale. Dessin ou modèle supplémentaire important caractéristiques comprennent 1) un réservoir commun que tous les navires déversent dans, afin d’assurer une évacuation fluide inutilisée depuis ...

Nous présentons des méthodes simplifiées de fabrication neurovasculaire transparent fantômes et caractérisant l’écoulement qui y sont. Nous mettre en évidence plusieurs paramètres importants et démontrer leur relation à la précision du champ.

Méso-échelle Particle Image Velocimetry études de neurovasculaire Flows In Vitro

Particle image velocimetry (PIV) is used in a wide variety of fields, due to the opportunity it provides for precisely visualizing and quantifying flows ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la bioingénierie, en particulier celles relatives à l’hémodynamique et leurs interactions avec les dispositifs intervasculaires. Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise des équipements déjà trouvés dans la plupart des laboratoires de bioingénierie, ce qui peut aider à réduire la barrière d’entrée pour les non-experts. Mélanger la base de prépolymer PDMS dans l’agent de séchage dans un rapport de 10 pour un par poids.Un mélange de 66 grammes fournit suffisamment de matériaux pour la fabrication de fantômes avec des volumes jusqu’à 50 centimètres cubes. Placez le mélange dans un dessiccateur sous vide pendant 60 minutes pour déso gasoil et minimiser le piégeage de la bulle. Utilisez la dépressurisation de la pressurisation cyclique pour faciliter la rupture des bulles.Pour effectuer le montage de coulée le moule imprimé d’ABS sur une glissière en verre utilisant le mastic de moulage pour sceller l’interface. Versez soigneusement le mélange PDMS dans le moule tout en essayant de minimiser le piégeage des bulles. Les bulles persistantes peuvent être rompues manuellement à l’aide d’une aiguille.Guérir le fantôme moulé à température ambiante pendant au moins 24 heures. Un récipient peut être utilisé pour s’assurer que la poussière ne se dépose pas sur le fantôme pendant le séchage. Pour effectuer la démodage, dissoudre l’ABS en submerging le fantôme dans l’acétone.Sonicate pendant au moins 15 minutes en utilisant des puissances jusqu’à 70 watts. Rincer soigneusement le fantôme avec de l’alcool isopropyle, puis de l’eau déionisée pour éliminer les résidus de solvants. À l’aide d’un microscope optique doté d’une caméra jointe dans un logiciel de capture d’image, capturez une image d’une entité critique dans le fantôme sous un grossissement qui maximise la fonctionnalité dans le champ de vision.Capturez une image d’un reticle d’étalonnage approprié au même grossissement. Chargez les deux images dans ImageJ en les faisant glisser sur la barre d’outils. Cliquez sur l’image de reticle d’étalonnage pour la rendre active, puis sélectionnez l’outil de ligne.À l’aide de la souris, tracez une ligne le long d’une entité d’une distance connue et sélectionnez analyser. Définissez l’échelle à partir du menu ImageJ. Entrez la longueur de la fonctionnalité dans le champ étiqueté distance connue et son unité dans le champ étiqueté unité de longueur.Cochez la case étiquetée globale pour appliquer ce facteur d’étalonnage à toutes les images ouvertes. Activez l’image de la fonction critique fantôme et utilisez l’outil de ligne pour tracer une ligne le long d’une entité d’intérêt. À partir du menu ImageJ sélectionnez analyser, mesurer pour mesurer la longueur de la ligne.Comparez la valeur attendue à la valeur de la colonne marquée longueur dans la fenêtre de résultats pour confirmer la fidélité fantôme. Pour faire la solution de sang simulé mélanger l’eau déionisée et le glycérol dans un rapport de 60 à 40 par volume. Ajouter un millilitre de solution de perle de polystyrène fluorescent à 2,5 % à la solution de sang simulé, puis homogénéiser le mélange sur une plaque magnétique à 400 rpm pendant 10 minutes.Effectuez la configuration du système circulatoire in vitro tel que décrit dans le protocole texte. Déterminez le ratio d’étalonnage de l’imagerie vidéo comme auparavant. Une feuille acrylique peut être placée au-dessus de l’étape du microscope avant de placer le fantôme PDMS pour protéger le microscope contre les déversements involontaires.Pour configurer l’appareil, placez le fantôme PDMS sur la scène du microscope à fluorescence. Connectez le fantôme à la pompe de vitesse et introduisez la solution de sang simulée. Réglez le contrôleur moteur de la pompe pour le débit désiré en fonction de la courbe d’étalonnage de la pompe.Faire fonctionner la pompe pendant une à cinq minutes avant l’expérience afin d’assurer des conditions d’état stables. Si le collage de perles est observé après une expérience, sonicate le fantôme dans une solution de détergent aqueux en utilisant des pouvoirs jusqu’à 70 watts. La propreté du modèle est également essentielle pour la fidélité des champs vectoriels, car les perles collées à la surface du fantôme entraîneront des fenêtres d’interrogatoire sans déplacement.Pour effectuer le traitement d’image, faites glisser le fichier AVI d’enregistrer sur la fenêtre ImageJ pour l’importer. Sélectionnez la boîte marquée convertir en échelle grise. À partir du menu ImageJ sélectionnez analyser, générer l’histogramme pour générer un histogramme d’intensités pixel image.Prenez note de l’écart moyen et type pour l’image non traitée. À partir du menu ImageJ sélectionnez l’image, ajustez la luminosité et le contraste pour appliquer un filtre de contraste de luminosité. Sur le menu luminosité et contraste, cliquez sur le bouton défini pour définir les limites d’image.Définissez la valeur minimale pour être la valeur moyenne plus un écart type et la valeur maximale pour être l’intensité maximale de l’image. À partir du menu ImageJ sélectionnez processus, bruit, despeckle pour réduire le nombre de pixels saturés. Sélectionnez ensuite le processus, les filtres, le flou gaussien avec un rayon de 1,5.Cela permettra de réduire les artefacts résultant de la suppression occasionnelle de pixels illuminés dans un quartier 3x3 par l’opération de despeckling précédente. Cliquez sur l’outil polygone, puis cliquez sur l’image pour décrire la région d’intérêt. À partir du menu ImageJ sélectionnez modifier, effacer à l’extérieur pour supprimer le bruit du capteur dans les endroits où aucun signal n’est prévu qui peut diminuer le rapport signal/bruit global.Procédez à l’analyse des données telle que décrit dans le protocole textuel. On y voit le fantôme terminé mis en évidence avec des dimensions ainsi que la velocimétrie de l’image des particules ou la région piv d’intérêt. Cette figure montre des parcelles de contour d’intensité d’image et des parcelles de surface résultant de perles fluorescentes dans l’artère perforatoire pendant la capture vidéo.Cela démontre l’amélioration du rapport signal/bruit après le plafonnement de l’intensité. Voici les champs vectoriels qui en résultent obtenus sur vidéo brute, après le plafonnement de l’intensité, puis à nouveau après la validation du champ vectoriel plafonné d’intensité à l’aide du test médian normalisé. Au fur et à mesure que les techniques de post-traitement et de validation vectorielle sont utilisées, le champ vectoriel devient plus uniforme et ressemble plus étroitement au profil attendu pour le flux dans un canal circulaire.Tout en essayant cette procédure, il est important de se concentrer sur la minimisation du bruit dans le signal acquis lui-même. Bien que ce protocole décrit les techniques basées sur les logiciels pour atténuer ces aberrations, il faut prendre soin à chaque étape de réduire leur occurrence. N’oubliez pas que travailler avec de l’acétone peut être extrêmement dangereux et vous devez toujours porter de l’équipement de protection individuelle ainsi que de travailler sous un capot de fumée loin de toutes les sources d’inflammation tout en effectuant cette procédure.

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