Name: Dans modèle de différenciation in Vitro des cellules de la mémoire humaine normale B à longue durée de vie des cellules de Plasma (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Découvrez un modèle in vitro de différenciation des cellules B mémoire en plasmocytes utilisant des outils bioinformatiques open-access. Cette méthode reproduit fidèlement les étapes de maturation observées in vivo.

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Ce travail a été soutenu par des subventions de Français INCA (Institut National du Cancer) Institut (PLBIO15-256), ANR (Tie-Skip) et ITMO Cancer (MM & TT).

Le protocole suit les directives conformément à la déclaration d’Helsinki et l’accord du Centre hospitalier de l’Université de Montpellier pour les ressources biologiques.
1. dans le modèle de différenciation pour le plasmocyte Vitro normale
Remarque : SCP est générés par une culture de quatre étapes11,12,13.
<ol><li>
Différenciation et l’amplification de lymphocytes b
	<ol>
<li>Utiliser des cellules du sang périphérique chez des volontaires sains pour mémoire purification de cellules B.</li>
		<li>Diluer 7,5 mL de sang par 24,5 mL du milieu RPMI 1640.</li>
		<li>Ajouter 12,5 mL de gradient de densité de température ambiante (par exemple, gradient de Ficoll) dans un tube conique stérile de 50 mL. Doucement, superposer le gradient de densité avec les 32 mL de sang dilué. Réduire au minimum le mélange des deux phases.</li>
		<li>Centrifuger 20 min à 500 x g avec le frein au large. Recueillir les PBMC de l’interface gradient de densité du plasma dilué/et placer les cellules dans un tube stérile de 50 mL et compléter jusqu'à 45 mL avec la solution saline équilibrée de Hank.</li>
		<li>Centrifuger les cellules pendant 5 min à 500 x g. Avec précaution, retirez le surnageant et garder le diabolo.</li>
		<li>Ajouter 45 mL de sérum de veau foetal RPMI1640/10% (FCS) et centrifuger 5 min à 500 x g. Avec précaution, retirez le surnageant et garder le diabolo. Ajouter 30 mL de FCS PBS/2%.</li>
		<li>
Supprimer CD2 + des cellules à l’aide de billes magnétiques anti-CD2. Ajouter 4 perles pour cellule une seule cible. Incuber 30 min à 4 ° C.
		<ol>
<li>Cellules séparées de perle-bondissent des cellules non liés à l’aide d’un aimant pour la demande de séparation de cellules. Prélever des cellules non liés et laisser incuber le culot cellulaire avec anti CD19 APC et anti anticorps CD27 PE 15 minutes à 4 ° C (2 µL d’anticorps de 106 cellules).</li>
			<li>Laver deux fois dans le sérum de chèvre PBS/10%.</li>
			<li>Supprimer les événements contaminantes sur les parcelles les FSC et SSC. Tracer les maillots sur FSC-A vs FSC-H et SSC-A vs QUE SSC-H parcelles pour enlever les débris et de sélectionner la population totale de leucocytes. Sélectionnez les cellules mémoire B CD19/CD27 et CD19+CD27+.</li>
			<li>Purifier MBCs à l’aide d’un trieur de cellules avec une pureté de 95 %.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Effectuez toutes les étapes de la culture à l’aide de FCS IMDM et 10 %, additionné de 50 mg/mL 5 mg/mL et transferrine humaine l’insuline humaine.</li>
		<li>
Plaque purifiée MBCs en plaques 6 puits culture (1,5 x 105 MBCs/mL à 5 mL/puits), pendant 4 jours, avec IL-2 (20 U/mL), IL-10 (50 ng/mL) et IL-15 (10 ng/mL).
		<ol>
<li>Ajouter Phosphorothioate CpG ODN 2006, histidine-étiquetée recombinante humaine CD40L solubles (sCD40L ; 50 ng/mL) et anti-polyhistidine mAb (5 mg/mL) pour l’activation de MBCs (Figure 1). Activation par sCD40L ou ODN seulement avec la même cocktail de cytokine cède à plus faible amplification12. La combinaison des signaux d’activation décrite ici au plomb pour le nombre maximal d’activé les cellules B et PrePBs11,12 (Figure 1).</li>
			<li>Pour le profil d’expression génique, purifier CD38 /CD20–– PrePBs, au jour 4, à l’aide d’un trieur de cellules (Figure 2).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Génération de cellules plasmablastique
	<ol>
<li>Au jour 4, compter les cellules.</li>
		<li>Cellules de plaques en plaques de culture de 12 puits à 2,5 x 105/ml à 2 mL/puits.</li>
		<li>Induire la différenciation par l’enlèvement des oligonucléotides CpG et sCD40L et ajout d’un nouveau milieu de culture avec une cytokine nouveau cocktail dont IL-2 (20 U/mL), IL-6 (50 ng/mL), IL-10 (50 ng/mL) et IL-15 (10 ng/mL) (Figure 1). Cellules en culture pendant 3 jours (du 4 au jour 7) à 37 ° C.</li>
		<li>Pour le profil d’expression génique, purifier CD38+/CD20– PBs, au jour 7, à l’aide d’un trieur de cellules (Figure 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Première génération de cellules de plasma
	<ol>
<li>Au 7e jour, compter les cellules.</li>
		<li>Assiette de cellules dans des boîtes de culture 12-puit à 5 x 105/ml à 2 mL/bien.</li>
		<li>Différencier les PB dans les premiers PC à l’aide de milieu de culture fraîche à l’IL-6 (50 ng/mL), IL-15 (10 ng/mL) et IFN-α (500 U/mL) pendant 3 jours à 37 ° C. Pour le profil d’expression génique, purifier CD20–/CD38+/CD138+ PC précoce, au jour 10, à l’aide d’un trieur de cellules (Figure 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Génération de longue durée de vie des cellules de plasma
	<ol>
<li>Se différencient PCs précoce en PCs a longtemps vécus en changeant les conditions de culture.</li>
		<li>Culture de cellules dans des boîtes de culture 12-puit à 5 x 105/ml à 2 mL/bien ou en plaques 24 puits culture dans 1 mL/bien à 37 ° C, à l’aide d’IL-6 et des cellules stromales conditionné medium et avril (200 ng/mL).</li>
		<li>Obtenir stromal milieu conditionné par cellule en cultivant des cellules stromales pendant 5 jours avec milieu de culture. Filtrer le surnageant de culture de cellules stromales (0,2 µm) et congeler.</li>
		<li>Ajouter 50 % des médias de conditionnées en cellules stromales aux cultures de PC avec renouvellement chaque semaine. Généré PCs de longue durée de vie pourraient être maintenus pour mois13. La survie à long terme de PC pourrait être obtenue avec l’IL-6 et avril uniquement comme signalé13.</li>
		<li>Sécrétion d’Ig mesure de cytométrie tri PCs.</li>
		<li>La culture de PCs à 106 cellules/mL pendant 24 h et récolter le surnageant de culture. Mesurer les IgG et IgA, à l’aide humaine enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) trousses11,12,13. La sécrétion d’IgG médiane, varie de 10 pg/cellule/jour à 10 à 17 pg/cellule/jour à jour 6013.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. moléculaire Atlas de B à la différenciation de PC
Remarque : Nous avons construit un accès commode et outils bioinformatiques pour extraire et visualiser les informations principales de données Affymetrix GEP associées à PC différenciation (GenomicScape)15. GEP sont accessibles au public de base de données ArrayExpress (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) y compris purifiée MBCs, PrePBs, PBs et EPCs : E-MTAB-1771, E-MEXP-2360 et E-MEXP-3034 et BMPC E-MEXP-236014,15. Genomicscape est un outil Internet disponible gratuitement.
<ol><li>
Sélection de B au dataset de PC
	<ol>
<li>Sélectionnez B au dataset de PC dans le menu de Parcourir les données dans l’outil de bioinformatique de libre accès GenomicScape (http://www.genomicscape.com) appelé les cellules B humaines de plasma. Visualisation du profil d’expression génique de gènes unique ou une liste de gènes est disponible à l’aide de l’outil d’Expression-Coexpression rapport dans les Outils d’analyse disponibles dans la page d’accueil.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analyse sous surveillance et analyse en composantes principales (PCA)
	<ol>
<li>Sélectionnez Analysis Tools | webSAM pour charger l’outil SAM.</li>
		<li>Choisir le dataset les cellules B humaines de plasma , puis sélectionnez les groupes d’échantillons à comparer.</li>
		<li>Utiliser les différents filtres disponibles pour appliquer les options de filtrage d’intérêt.</li>
		<li>Pour comparer les profils d’expression génique avec outil de SAM, modifier les options de filtrage y compris changement de pli, nombre de permutations, taux de fausse découverte et le type de comparaison. GenomicScape va calculer l’analyse et de fournir des gènes différentiellement exprimés entre groupes sélectionnés.</li>
		<li>Exécuter l’analyse en composantes principales en sélectionnant Analyse en composantes principales dans le menu Outils de l’analyse .</li>
		<li>Choisir le dataset les cellules B humaines de plasma , puis sélectionnez les groupes d’intérêt.</li>
		<li>Coller une liste de gènes d’intérêt ou de certains gènes selon la variance. Pour coller une liste de gènes, sélectionnez analyser une liste de gènes/Ncrna, cliquez ici... Genomicscape calculera PCA qui pourrait être visualisé et téléchargé.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Shapiro-Shelef, M., Calame, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+plasma-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of plasma-cell development.</a> Nature Reviews Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).</li>
<li>Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+antibody-secreting+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The generation of antibody-secreting plasma cells.</a> Nature Reviews Immunology. 15 (3), 160-171 (2015).</li>
<li>Shaffer, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blimp-1+orchestrates+plasma+cell+differentiation+by+extinguishing+the+mature+B+cell+gene+expression+program%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Blimp-1 orchestrates plasma cell differentiation by extinguishing the mature B cell gene expression program.</a> Immunity. 17 (1), 51-62 (2002).</li>
<li>Minnich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+role+of+the+transcription+factor+Blimp-1+in+coordinating+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Multifunctional role of the transcription factor Blimp-1 in coordinating plasma cell differentiation.</a> Nature Immunology. 17 (3), 331-343 (2016).</li>
<li>Klein, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+IRF4+controls+plasma+cell+differentiation+and+class-switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transcription factor IRF4 controls plasma cell differentiation and class-switch recombination.</a> Nature Immunology. 7 (7), 773-782 (2006).</li>
<li>Gass, J. N., Gunn, K. E., Sriburi, R., Brewer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stressed-out+B+cells%3F+Plasma-cell+differentiation+and+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Stressed-out B cells? Plasma-cell differentiation and the unfolded protein response.</a> Trends in Immunology. 25 (1), 17-24 (2004).</li>
<li>Goldfinger, M., Shmuel, M., Benhamron, S., Tirosh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+in+plasma+cells+is+regulated+by+crosstalk+between+endoplasmic+reticulum+stress+and+mTOR+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis in plasma cells is regulated by crosstalk between endoplasmic reticulum stress and mTOR signaling.</a> European Journal of Immunology. 41 (2), 491-502 (2011).</li>
<li>Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XBP1+mRNA+is+induced+by+ATF6+and+spliced+by+IRE1+in+response+to+ER+stress+to+produce+a+highly+active+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor.</a> Cell. 107 (7), 881-891 (2001).</li>
<li>Shaffer, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XBP1%2C+downstream+of+Blimp-1%2C+expands+the+secretory+apparatus+and+other+organelles%2C+and+increases+protein+synthesis+in+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">XBP1, downstream of Blimp-1, expands the secretory apparatus and other organelles, and increases protein synthesis in plasma cell differentiation.</a> Immunity. 21 (1), 81-93 (2004).</li>
<li>Reimold, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+cell+differentiation+requires+the+transcription+factor+XBP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Plasma cell differentiation requires the transcription factor XBP-1.</a> Nature. 412 (6844), 300-307 (2001).</li>
<li>Jourdan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+transitional+preplasmablast+population+in+the+process+of+human+B+cell+to+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a transitional preplasmablast population in the process of human B cell to plasma cell differentiation.</a> Journal of Immunology. 187 (8), 3931-3941 (2011).</li>
<li>Jourdan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+differentiation+of+memory+B+cells+into+plasmablasts+and+plasma+cells+including+detailed+phenotypic+and+molecular+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of differentiation of memory B cells into plasmablasts and plasma cells including detailed phenotypic and molecular characterization.</a> Blood. 114 (25), 5173-5181 (2009).</li>
<li>Jourdan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-6+supports+the+generation+of+human+long-lived+plasma+cells+in+combination+with+either+APRIL+or+stromal+cell-soluble+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">IL-6 supports the generation of human long-lived plasma cells in combination with either APRIL or stromal cell-soluble factors.</a> Leukemia. , (2014).</li>
<li>Kassambara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+miRNA+expression+analysis+identifies+novel+key+regulators+of+plasma+cell+differentiation+and+malignant+plasma+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Global miRNA expression analysis identifies novel key regulators of plasma cell differentiation and malignant plasma cell.</a> Nucleic Acids Research. 45 (10), 5639-5652 (2017).</li>
<li>Kassambara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GenomicScape%3A+an+easy-to-use+web+tool+for+gene+expression+data+analysis.+Application+to+investigate+the+molecular+events+in+the+differentiation+of+B+cells+into+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">GenomicScape: an easy-to-use web tool for gene expression data analysis. Application to investigate the molecular events in the differentiation of B cells into plasma cells.</a> PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004077(2015).</li>
<li>Miremadi, A., Oestergaard, M. Z., Pharoah, P. D., Caldas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+genetics+of+epigenetic+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cancer genetics of epigenetic genes.</a> Human Molecular Genetics. 16, Spec No 1 28-49 (2007).</li>
<li>Pei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+methyltransferase+MMSET+regulates+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The histone methyltransferase MMSET regulates class switch recombination.</a> Journal of Immunology. 190 (2), 756-763 (2013).</li>
<li>Le Gallou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-2+requirement+for+human+plasma+cell+generation%3A+coupling+differentiation+and+proliferation+by+enhancing+MAPK-ERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-2 requirement for human plasma cell generation: coupling differentiation and proliferation by enhancing MAPK-ERK signaling.</a> Journal of Immunology. 189 (1), 161-173 (2012).</li>
<li>Cocco, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+long-lived+human+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of long-lived human plasma cells.</a> Journal of Immunology. 189 (12), 5773-5785 (2012).</li>
<li>Leung-Hagesteijn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xbp1s-negative+tumor+B+cells+and+pre-plasmablasts+mediate+therapeutic+proteasome+inhibitor+resistance+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Xbp1s-negative tumor B cells and pre-plasmablasts mediate therapeutic proteasome inhibitor resistance in multiple myeloma.</a> Cancer Cell. 24 (3), 289-304 (2013).</li>
<li>Orlowski, R. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+proteasome+inhibitors+cannot+ERADicate+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Why proteasome inhibitors cannot ERADicate multiple myeloma.</a> Cancer Cell. 24 (3), 275-277 (2013).</li>
<li>Ding, B. B., Bi, E., Chen, H., Yu, J. J., Ye, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-21+and+CD40L+synergistically+promote+plasma+cell+differentiation+through+upregulation+of+Blimp-1+in+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-21 and CD40L synergistically promote plasma cell differentiation through upregulation of Blimp-1 in human B cells.</a> Journal of Immunology. 190 (4), 1827-1836 (2013).</li>
<li>Tsai, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-1+promotes+immunoglobulin+production+during+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Galectin-1 promotes immunoglobulin production during plasma cell differentiation.</a> Journal of Immunology. 181 (7), 4570-4579 (2008).</li>
<li>Tsai, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-1+and+galectin-8+have+redundant+roles+in+promoting+plasma+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Galectin-1 and galectin-8 have redundant roles in promoting plasma cell formation.</a> Journal of Immunology. 187 (4), 1643-1652 (2011).</li>
<li>Anginot, A., Espeli, M., Chasson, L., Mancini, S. J., Schiff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin+1+modulates+plasma+cell+homeostasis+and+regulates+the+humoral+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Galectin 1 modulates plasma cell homeostasis and regulates the humoral immune response.</a> Journal of Immunology. 190 (11), 5526-5533 (2013).</li>
<li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homing+and+adhesion+patterns+determine+the+cellular+composition+of+the+bone+marrow+plasma+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche.</a> Journal of Immunology. 188 (3), 1283-1291 (2012).</li>
<li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APRIL+is+critical+for+plasmablast+survival+in+the+bone+marrow+and+poorly+expressed+by+early-life+bone+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">APRIL is critical for plasmablast survival in the bone marrow and poorly expressed by early-life bone marrow stromal cells.</a> Blood. 111 (5), 2755-2764 (2008).</li>
<li>Huard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APRIL+secreted+by+neutrophils+binds+to+heparan+sulfate+proteoglycans+to+create+plasma+cell+niches+in+human+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">APRIL secreted by neutrophils binds to heparan sulfate proteoglycans to create plasma cell niches in human mucosa.</a> Journal of Clinical Investigation. 118 (8), 2887-2895 (2008).</li>
<li>Ame-Thomas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+isolated+from+bone+marrow+and+lymphoid+organs+support+tumor+B-cell+growth%3A+role+of+stromal+cells+in+follicular+lymphoma+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and lymphoid organs support tumor B-cell growth: role of stromal cells in follicular lymphoma pathogenesis.</a> Blood. 109 (2), 693-702 (2007).</li>
<li>Ramachandrareddy, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCL6+promoter+interacts+with+far+upstream+sequences+with+greatly+enhanced+activating+histone+modifications+in+germinal+center+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">BCL6 promoter interacts with far upstream sequences with greatly enhanced activating histone modifications in germinal center B cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (26), 11930-11935 (2010).</li>
<li>Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+of+the+antibody+response%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Epigenetics of the antibody response.</a> Trends in Immunology. 34 (9), 460-470 (2013).</li>
<li>Miles, R. R., Crockett, D. K., Lim, M. S., Elenitoba-Johnson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+BCL6-interacting+proteins+by+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of BCL6-interacting proteins by tandem mass spectrometry.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 4 (12), 1898-1909 (2005).</li>
<li>McManus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Pax5+regulates+its+target+genes+by+recruiting+chromatin-modifying+proteins+in+committed+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Pax5 regulates its target genes by recruiting chromatin-modifying proteins in committed B cells.</a> The EMBO Journal. 30 (12), 2388-2404 (2011).</li>
<li>Ahmadnejad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+expression+of+DNMT1+is+associated+with+increased+expansion+and+proliferation+of+hematopoietic+stem+cells+co-cultured+with+human+MSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Research%22%5BJournal%5D)">Elevated expression of DNMT1 is associated with increased expansion and proliferation of hematopoietic stem cells co-cultured with human MSCs.</a> Blood Research. 52 (1), 25-30 (2017).</li>
<li>Beguelin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZH2+is+required+for+germinal+center+formation+and+somatic+EZH2+mutations+promote+lymphoid+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">EZH2 is required for germinal center formation and somatic EZH2 mutations promote lymphoid transformation.</a> Cancer Cell. 23 (5), 677-692 (2013).</li>
<li>Herviou, L., Cavalli, G., Cartron, G., Klein, B., Moreaux, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZH2+in+normal+hematopoiesis+and+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">EZH2 in normal hematopoiesis and hematological malignancies.</a> Oncotarget. 7 (3), 2284-2296 (2016).</li>
<li>Beguelin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZH2+enables+germinal+centre+formation+through+epigenetic+silencing+of+CDKN1A+and+an+Rb-E2F1+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">EZH2 enables germinal centre formation through epigenetic silencing of CDKN1A and an Rb-E2F1 feedback loop.</a> Nature Communications. 8 (1), 877(2017).</li>
<li>Herviou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRC2+targeting+is+a+therapeutic+strategy+for+EZ+score+defined+high-risk+multiple+myeloma+patients+and+overcome+resistance+to+IMiDs%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Epigenetics%22%5BJournal%5D)">PRC2 targeting is a therapeutic strategy for EZ score defined high-risk multiple myeloma patients and overcome resistance to IMiDs.</a> Clinical Epigenetics. 10 (1), 121(2018).</li>
<li>Asangani, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+EZH2-MMSET+histone+methyltransferase+regulatory+axis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Characterization of the EZH2-MMSET histone methyltransferase regulatory axis in cancer.</a> Molecular Cell. 49 (1), 80-93 (2013).</li>
<li>Pei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMSET+regulates+histone+H4K20+methylation+and+53BP1+accumulation+at+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MMSET regulates histone H4K20 methylation and 53BP1 accumulation at DNA damage sites.</a> Nature. 470 (7332), 124-128 (2011).</li>
<li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EHMT2+inhibitor+BIX-01294+induces+apoptosis+through+PMAIP1-USP9X-MCL1+axis+in+human+bladder+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">EHMT2 inhibitor BIX-01294 induces apoptosis through PMAIP1-USP9X-MCL1 axis in human bladder cancer cells.</a> Cancer Cell International. 15 (1), 4(2015).</li>
<li>Santo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+activity%2C+pharmacodynamic%2C+and+pharmacokinetic+properties+of+a+selective+HDAC6+inhibitor%2C+ACY-1215%2C+in+combination+with+bortezomib+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Preclinical activity, pharmacodynamic, and pharmacokinetic properties of a selective HDAC6 inhibitor, ACY-1215, in combination with bortezomib in multiple myeloma.</a> Blood. 119 (11), 2579-2589 (2012).</li>
<li>Amengual, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Targeting+of+Protein+Degradation+Pathways+with+the+Selective+HDAC6+Inhibitor+ACY-1215+and+Bortezomib+Is+Synergistic+in+Lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Dual Targeting of Protein Degradation Pathways with the Selective HDAC6 Inhibitor ACY-1215 and Bortezomib Is Synergistic in Lymphoma.</a> Clinical Cancer Research. 21 (20), 4663-4675 (2015).</li>
<li>Schoenhals, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forced+KLF4+expression+increases+the+generation+of+mature+plasma+cells+and+uncovers+a+network+linked+with+plasma+cell+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Forced KLF4 expression increases the generation of mature plasma cells and uncovers a network linked with plasma cell stage.</a> Cell Cycle. 15 (14), 1919-1928 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer

Chez l’homme, PC sont rares cellules avec des stades de différenciation qui ont lieu dans des endroits anatomiques qui entravent la caractérisation biologique complet. Nous avons développé un B in vitro au modèle de différenciation de PC à l’aide de systèmes de culture de plusieurs étapes où les différentes combinaisons de molécules d’activation et de cytokines sont appliquées par la suite afin de reproduire la différenciation des cellules séquentielles qui se produisent dans la différents organes/tissus en vivo<sup clas...

La différenciation des cellules B à plasmocytes (PCs) est essentielle à l’immunité humorale et protéger l’hôte contre l’infection1. B à la différenciation de la PC est associée à des changements majeurs dans la capacité de la transcription et le métabolisme pour accueillir à la sécrétion d’anticorps. Les facteurs de transcription qui contrôlent B à la différenciation de PC ont été largement étudiées et révélées réseaux exclusifs y compris spécifiques PC et B transcription factors (TFs)2. Dans les cellules de B, PAX5, BCL6 et BACH2 TFs sont les gardiens des lymphocytes B identité2,3. Induction IRF4, PRDM1 , codant pour BLIMP1 et XBP1 PC TF va éteindre les gènes de cellules B et induire une coordonnée sécrétant des anticorps cellule programme transcriptionnel3,4,5. Ces changements de transcriptional coordonnés sont associés à Ig gènes transcription activation avec un passage de la forme liée à la membrane à la forme sécrétée des immunoglobulines chaîne lourde2,3, 4. B à la différenciation de la PC est lié à l’induction de gènes impliqués dans le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi fonctionne concomitante avec l’activation de la protéine dépliée réponse (UPR) connue pour jouer un rôle clé dans le PC en accueillant la synthèse de sécrétion d’immunoglobulines6,7. Le TF XBP1 joue un rôle majeur dans cette adaptation cellulaire8,9,10.
Les cellules B et les PC est des acteurs clés de l’immunité humorale. Comprendre le biologique des processus qui contrôlent la production et la survie des cellules de plasma normales est essentiel dans les interventions thérapeutiques qui doivent assurer des réponses immunitaires efficaces et empêcher l’auto-immunité ou un déficit immunitaire. PC sont des cellules rares avec les premiers stades de différenciation se déroulant dans des lieux anatomiques qui entravent la caractérisation biologique complet, en particulier chez l’homme. À l’aide de systèmes de culture de plusieurs étapes, nous avons rapporté un B in vitro au modèle de différenciation de PC. Ce modèle reproduit la différenciation cellulaire séquentielle et la maturation qui se produisent dans les différents organes en vivo11,12,13. Dans un premier temps, les cellules B mémoire sont activés pendant quatre jours par CD40 ligand, oligodeoxynucleotides et cytokines combinaison et se différencient en preplasmablasts (PrePBs). Dans un second temps, preplasmablasts sont amenées à se différencier en plasmablasts (PBs) en supprimant la stimulation CD40L et oligodeoxynucleotides et changer la combinaison de cytokine. Dans une troisième étape, les plasmablasts sont induites à se différencier dans les premiers PC en changeant la cytokine combinaison11,12. Une quatrième étape a été introduite pour obtenir la pleine maturités PCs en cultivant ces premiers PCs avec milieu de la moelle osseuse des cellules stromales conditionnés ou sélectionné des facteurs de croissance,13. Ces PC mature pourrait survivre plusieurs mois in vitro et sécrètent des quantités élevées d’immunoglobuline (Figure 1). Fait intéressant, notre modèle in vitro récapitule les modifications de transcriptional coordonnées et le phénotype du B différent stades de PC qui peuvent être détectées in vivo11,12,13,14 ,,15. PC sont des cellules rares et notre modèle de différenciation in vitro permet d’étudier les humain B à la différenciation de PC.

<table><tbody><tr><td>billes magnétiques anti-CD2</td><td>Invitrogen</td><td>11159D</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD138-APC</td><td>Beckman-Coulter&nbsp ;</td><td>B49219</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD19-APC</td><td>BD</td><td>555415</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD20-PB</td><td>Beckman-Coulter&nbsp ;</td><td>B49208</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD27-PE</td><td>BD</td><td>555441</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD38-PE</td><td>Beckman-Coulter&nbsp ;</td><td>A07779</td><td></td></tr><tr><td>Anti-histidine</td><td>R& D Systems</td><td>MAB050</td><td></td></tr><tr><td>CpG ODN(PT)</td><td>Sigma</td><td></td><td>T*C*G*T*T*C*G*T*T*G*T*C* G*T*T*T*T*T*C*G*T*T</td></tr><tr><td>transfert humainin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3309</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&alpha ;</td><td>Merck</td><td>Intron A</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>31980-022</td><td></td></tr><tr><td>Recombinan Human CD40L-hi</td><td>R& D Systems</td><td>2706-CL</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Humain APRIL</td><td>R& D Systems</td><td>5860-AP-010</td><td></td></tr><tr><td>IL-10 humain recombinant</td><td>R& D Systems</td><td>217-IL-IL-Humain</td><td></td></tr> <tr><td>recombinant IL-15</td><td>Peprotech</td><td>200-15-10ug</td><td></td></tr><tr><td>Protéine IL-2 humaine recombinante</td><td>R& D Systems</td><td>202-IL-IL-IL-6</td><td></td></tr> <tr><td>humain recombinant</td><td>Peprotech</td><td>200-06</td><td></td></tr></tbody></table>

dans modèle de différenciation in vitro des cellules de la mémoire humaine normale b à longue durée de vie des cellules de plasma

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

Plasmocytes (PCs) sécrètent de grandes quantités d’anticorps et se développent à partir des cellules de B qui ont été activés. SCP est rares cellules localisées dans la moelle osseuse ou de la muqueuse et assurent l’immunité humorale. En raison de leur faible fréquence et de l’emplacement, l’étude de la SCP est difficile chez l’homme. Nous avons signalé un B PC modèle de différenciation in vitro à l’aide de certaines combinaisons de cytokines et l’activation des molécules qui permettent de reproduire la différenciation des cellules séquentielles survenant in vivo. Dans ce modèle in vitro, mémoire des cellules B (MBCs) permet de différencier en pre plasmablasts (prePBs), plasmablasts PCs (PBs), au début et enfin, dans la longue durée de vie avec un phénotype PCs, fermer à leurs homologues chez les individus sains. Nous avons construit également un libre accès bioinformatique outils pour analyser les informations principales de données LGE liées à la différenciation de PC. Ces ressources peuvent être utilisées pour étudier les humain B à la différenciation de PC et dans la présente étude, nous avons étudié la régulation de l’expression génique des facteurs épigénétiques pendant B humaine à la différenciation de PC.

La procédure globale de différenciation in vitro de PC normale est représentée dans la Figure 1. En utilisant le protocole présenté ici, nous pourrions produire une quantité suffisante de cellules qui ne peut pas être obtenu avec ex vivo des échantillons humains. Bien que le rôle du réseau complex de facteurs de transcription impliqués dans la différenciation de PC a été étudié, les mécanismes qui régissent les principaux réseaux de transcription de différenc...

À l’aide de systèmes de culture de plusieurs étapes, les auteurs rapportent une in vitro de cellules B au modèle de différenciation de cellules de plasma.

Dans modèle de différenciation in Vitro des cellules de la mémoire humaine normale B à longue durée de vie des cellules de Plasma

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...

Les cellules plasmatiques sont des cellules rares dont les 30 stades de différenciation se déroulent dans des endroits anatomiques qui nuisent à la caractérisation biologique complète, en particulier chez l’homme. Notre modèle in vitro de différenciation des cellules plasmatiques B2 reproduit la différenciation et la maturation séquentielles des cellules dans les différents organes in vivo. Ce modèle in vitro récapitule les changements transcriptionnels coordonnés et le phénotype des différents stades des cellules plasmatiques B2 qui peuvent être détectés in vivo.Nous avons également construit un outil bioinformatique en libre accès pour analyser les informations les plus importantes provenant des données d’exploration liées à la différenciation des cellules plasmatiques. Hugues de Boussac, postdoc de mon laboratoire, démontrera la procédure. Pour commencer, obtenir des cellules sanguines périphériques auprès de volontaires en bonne santé pour la purification des cellules B de la mémoire.Diluer 7,5 millilitres de sang avec 24,5 millilitres de RPMI 1640 moyen. Ensuite, ajoutez 12,5 millilitres de gradient de densité de température ambiante à un tube conique stérile de 50 millilitres. Superposez doucement le gradient de densité avec les 32 millilitres de sang dilué, en vous assurant de minimiser le mélange des deux phases.Centrifugeuse pendant 20 minutes à 500 fois la gravité avec le frein éteint. Recueillir les cellules mononucléaires sanguines périphériques à partir de l’interface plasmatique diluée et gradient de densité. Transférez les cellules dans un tube stérile de 50 millilitres et remplissez le tube jusqu’à 45 millilitres avec la solution de sel équilibré de Hank.Centrifugeuse à 500 fois la gravité pendant cinq minutes. Retirer délicatement le surnatant et garder la pastille. Ensuite, ajouter 45 millilitres de RPMI 1640 moyen, complété par 10%FCS.Centrifugeuse à 500 fois la gravité pendant cinq minutes. Retirer délicatement le surnatant et garder la pastille. Ajouter 30 millilitres de PBS, complétés par 2%FCS.Utilisez des perles magnétiques anti-CD pour éliminer les cellules CD2 positives en ajoutant quatre perles pour une cellule cible. Incuber à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. À l’aide d’un aimant pour l’application de séparation cellulaire, séparez les cellules liées aux perles des cellules non liées.Recueillir les cellules non liées et les incuber avec des anticorps anti-CD19 APC et anti-CD27 PE pendant quinze minutes à quatre degrés Celsius. Lavez les cellules deux fois dans le PBS contenant 10% de sérum de chèvre. Ensuite, utilisez le trieur cellulaire pour purifier les cellules mémoire B à une pureté de 95%.Après cela, ajouter soluble CD40 ligand et anti-polyhistidine anticorps monoclonal pour l’activation des cellules mémoire B. Plaquez les cellules B de mémoire purifiées dans des plaques de culture de six puits pendant quatre jours avec l’interleukine-2, l’interleukine-10 et l’interleukine-15. Pour le profilage de l’expression génétique, utilisez un trieur cellulaire pour purifier les préplasmablastes CD20 négatifs cd38 au quatrième jour.Le quatrième jour, comptez les cellules et plaquez-les dans des plaques de culture de 12 puits à une densité cellulaire de 250 000 cellules par millilitre en ajoutant deux millilitres de suspension cellulaire dans chaque puits. Pour induire la différenciation, retirez les oligonucléotides CPG et le ligand soluble CD40 et ajoutez un nouveau milieu de culture contenant un nouveau cocktail cytokine comprenant l’interleukine-2, l’interleukine-6, l’interleukine-10 et l’interleukine-15. Culture des cellules pendant trois jours à 37 degrés Celsius.Pour le profilage de l’expression génétique, utilisez un trieur cellulaire pour purifier les plasmablastes CD38-positifs, CD20 négatifs au septième jour. Le septième jour, comptez les cellules. Plaquez les cellules dans des plaques de culture de 12 puits à une densité cellulaire de 500 000 cellules par puits, en ajoutant deux millilitres de suspension cellulaire à chaque puits.Différenciez les plasmablastes en cellules plasmatiques précoces à l’aide d’un milieu de culture frais contenant de l’interleukine-6, de l’interleukine-15 et de l’interféron-alpha pendant trois jours à 37 degrés Celsius. Pour le profilage de l’expression génétique, utilisez un trieur cellulaire pour purifier les cellules plasmatiques précoces CD20 négatives, CD38 positives, CD138-positives au jour 10. Tout d’abord, la culture des cellules stromales pendant cinq jours avec le milieu de la culture.Utilisez un filtre de 0,2 microlitre pour filtrer le supernatant de culture cellulaire stromale pour obtenir un milieu conditionné par cellules stromales et congeler jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi. Ensuite, la culture des premières cellules plasmatiques dans les plaques de culture de 12 puits, en utilisant le milieu cellulaire stromal précédemment obtenu avec interleukine-6 et AVRIL à une densité cellulaire de 500.000 cellules par puits, en ajoutant deux millilitres de suspension cellulaire à chaque puits. Incuber à 37 degrés Celsius, le renouvellement de la cellule stromale conditionnée milieu chaque semaine.Ensuite, mesurez la sécrétion d’immunoglobuline à partir de cellules plasmatiques triées par cytométrie d’écoulement. Culture des cellules plasmatiques à une densité d’un million de cellules par millilitre pendant 24 heures et de récolter la culture supernatant. À l’aide d’un kit ELISA, mesurez l’immunoglobuline G et l’immunoglobuline A.First, lancez l’outil Web bioinformatique en libre accès GenomicScape.Dans le menu parcourir les données, sélectionnez l’ensemble de données nommé cellules B humaines aux cellules plasmatiques. La visualisation du profil d’expression génétique d’un gène unique ou d’une liste de gènes est disponible à l’aide de l’outil Expression/Coexpression Report dans les outils d’analyse. Ensuite, sélectionnez Outils d’analyse webSAM pour charger l’outil SAM.Choisissez les cellules B humaines à l’ensemble de données des cellules plasmatiques et sélectionnez le groupe d’échantillons à comparer. Utilisez les différents filtres disponibles pour appliquer les options de filtrage d’intérêt. Pour comparer les profils d’expression génétique avec l’outil SAM, modifiez les options de filtrage, y compris le changement de pli, le nombre de permutations, le taux de fausse découverte et le type de comparaison.Le logiciel calculera l’analyse et fournira des gènes exprimés différemment entre les groupes sélectionnés. Dans cette étude, les changements d’expression des facteurs épigénétiques dans la différenciation normale de cellules de plasma sont étudiés. À l’aide de l’analyse SAM multi-classes, 71 gènes sont considérés comme significativement exprimés différemment entre les cellules B de la mémoire, les préplasmablastes, les plasmablastes, les cellules plasmatiques précoces et les cellules plasmatiques de moelle osseuse avec un taux de fausse découverte de moins de 5%Le stade cellulaire de mémoire B est caractérisé par la surexpression de 23 gènes épigénétiques de joueur, y compris 39,13% des acétyltransferases d’histone, 30,43% des méthyltransferases d’histone , 21,74 % des deméthylases d’histone, 4,35 % des protéines liant le méthyle et 4,35 % des deacetylases histones.14 gènes des joueurs épigénétiques sont surexprimés de manière significative au stade préplasmablastique, dont 50% des méthyltransferases histones, 14,28% des méthyltransferases d’ADN, 21,43% des deacetylases d’histone, 7,14% des déméthylases d’histone, et 17,14% des acétyltransferases d’histone. À la suite de cette procédure, plusieurs analyses visant à identifier et à comprendre les modifications apportées à la structure et à l’architecture de la chromatine au cours de ces différenciations des cellules plasmatiques B2 ont pu être effectuées. Ce modèle de différenciation in vitro permettra de générer suffisamment de cellules pour compléter cette analyse moléculaire afin de révéler à la fois les voies impliquées dans toute cette modélisation et leur impact transcriptionnel en aval lors de la différenciation des cellules plasmatiques B2.Ces connaissances dérivées de cette recherche pourraient éclairer et instruire sur les stratégies diagnostiques et thérapeutiques pour les troubles des cellules plasmatiques, comme dans le cas du myélome multiple, un cancer sans remède définitif, pour lequel un meilleur pronostic et des stratégies thérapeutiques améliorées sont absolument nécessaires. Caractériser et comprendre les changements structurels et architecturaux épigénétiques qui affectent la chromatine pendant la différenciation des cellules plasmatiques B2 sera particulièrement intéressant. Ceci pourrait être fait utilisant le séquençage de gène, ERRBS, séquençage d’ATAC, IC, et séquençage d’ARN.Une hétérogénéité modérée pourrait être observée dans le pourcentage de cellules B activées, de préplasmablastes, de plasmablastes et de cellules plasmatiques, selon le sang sain du donneur, utilisé pour la purification des cellules B de la mémoire.

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