Dans modèle de différenciation in Vitro des cellules de la mémoire humaine normale B à longue durée de vie des cellules de Plasma

Les cellules plasmatiques sont des cellules rares dont les 30 stades de différenciation se déroulent dans des endroits anatomiques qui nuisent à la caractérisation biologique complète, en particulier chez l’homme. Notre modèle in vitro de différenciation des cellules plasmatiques B2 reproduit la différenciation et la maturation séquentielles des cellules dans les différents organes in vivo. Ce modèle in vitro récapitule les changements transcriptionnels coordonnés et le phénotype des différents stades des cellules plasmatiques B2 qui peuvent être détectés in vivo.

Nous avons également construit un outil bioinformatique en libre accès pour analyser les informations les plus importantes provenant des données d’exploration liées à la différenciation des cellules plasmatiques. Hugues de Boussac, postdoc de mon laboratoire, démontrera la procédure. Pour commencer, obtenir des cellules sanguines périphériques auprès de volontaires en bonne santé pour la purification des cellules B de la mémoire.

Diluer 7,5 millilitres de sang avec 24,5 millilitres de RPMI 1640 moyen. Ensuite, ajoutez 12,5 millilitres de gradient de densité de température ambiante à un tube conique stérile de 50 millilitres. Superposez doucement le gradient de densité avec les 32 millilitres de sang dilué, en vous assurant de minimiser le mélange des deux phases.

Centrifugeuse pendant 20 minutes à 500 fois la gravité avec le frein éteint. Recueillir les cellules mononucléaires sanguines périphériques à partir de l’interface plasmatique diluée et gradient de densité. Transférez les cellules dans un tube stérile de 50 millilitres et remplissez le tube jusqu’à 45 millilitres avec la solution de sel équilibré de Hank.

Centrifugeuse à 500 fois la gravité pendant cinq minutes. Retirer délicatement le surnatant et garder la pastille. Ensuite, ajouter 45 millilitres de RPMI 1640 moyen, complété par 10%FCS.

Centrifugeuse à 500 fois la gravité pendant cinq minutes. Retirer délicatement le surnatant et garder la pastille. Ajouter 30 millilitres de PBS, complétés par 2%FCS.

Utilisez des perles magnétiques anti-CD pour éliminer les cellules CD2 positives en ajoutant quatre perles pour une cellule cible. Incuber à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. À l’aide d’un aimant pour l’application de séparation cellulaire, séparez les cellules liées aux perles des cellules non liées.

Recueillir les cellules non liées et les incuber avec des anticorps anti-CD19 APC et anti-CD27 PE pendant quinze minutes à quatre degrés Celsius. Lavez les cellules deux fois dans le PBS contenant 10% de sérum de chèvre. Ensuite, utilisez le trieur cellulaire pour purifier les cellules mémoire B à une pureté de 95%.

Après cela, ajouter soluble CD40 ligand et anti-polyhistidine anticorps monoclonal pour l’activation des cellules mémoire B. Plaquez les cellules B de mémoire purifiées dans des plaques de culture de six puits pendant quatre jours avec l’interleukine-2, l’interleukine-10 et l’interleukine-15. Pour le profilage de l’expression génétique, utilisez un trieur cellulaire pour purifier les préplasmablastes CD20 négatifs cd38 au quatrième jour.

Le quatrième jour, comptez les cellules et plaquez-les dans des plaques de culture de 12 puits à une densité cellulaire de 250 000 cellules par millilitre en ajoutant deux millilitres de suspension cellulaire dans chaque puits. Pour induire la différenciation, retirez les oligonucléotides CPG et le ligand soluble CD40 et ajoutez un nouveau milieu de culture contenant un nouveau cocktail cytokine comprenant l’interleukine-2, l’interleukine-6, l’interleukine-10 et l’interleukine-15. Culture des cellules pendant trois jours à 37 degrés Celsius.

Pour le profilage de l’expression génétique, utilisez un trieur cellulaire pour purifier les plasmablastes CD38-positifs, CD20 négatifs au septième jour. Le septième jour, comptez les cellules. Plaquez les cellules dans des plaques de culture de 12 puits à une densité cellulaire de 500 000 cellules par puits, en ajoutant deux millilitres de suspension cellulaire à chaque puits.

Différenciez les plasmablastes en cellules plasmatiques précoces à l’aide d’un milieu de culture frais contenant de l’interleukine-6, de l’interleukine-15 et de l’interféron-alpha pendant trois jours à 37 degrés Celsius. Pour le profilage de l’expression génétique, utilisez un trieur cellulaire pour purifier les cellules plasmatiques précoces CD20 négatives, CD38 positives, CD138-positives au jour 10. Tout d’abord, la culture des cellules stromales pendant cinq jours avec le milieu de la culture.

Utilisez un filtre de 0,2 microlitre pour filtrer le supernatant de culture cellulaire stromale pour obtenir un milieu conditionné par cellules stromales et congeler jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi. Ensuite, la culture des premières cellules plasmatiques dans les plaques de culture de 12 puits, en utilisant le milieu cellulaire stromal précédemment obtenu avec interleukine-6 et AVRIL à une densité cellulaire de 500.000 cellules par puits, en ajoutant deux millilitres de suspension cellulaire à chaque puits. Incuber à 37 degrés Celsius, le renouvellement de la cellule stromale conditionnée milieu chaque semaine.

Ensuite, mesurez la sécrétion d’immunoglobuline à partir de cellules plasmatiques triées par cytométrie d’écoulement. Culture des cellules plasmatiques à une densité d’un million de cellules par millilitre pendant 24 heures et de récolter la culture supernatant. À l’aide d’un kit ELISA, mesurez l’immunoglobuline G et l’immunoglobuline A.First, lancez l’outil Web bioinformatique en libre accès GenomicScape.

Dans le menu parcourir les données, sélectionnez l’ensemble de données nommé cellules B humaines aux cellules plasmatiques. La visualisation du profil d’expression génétique d’un gène unique ou d’une liste de gènes est disponible à l’aide de l’outil Expression/Coexpression Report dans les outils d’analyse. Ensuite, sélectionnez Outils d’analyse webSAM pour charger l’outil SAM.

Choisissez les cellules B humaines à l’ensemble de données des cellules plasmatiques et sélectionnez le groupe d’échantillons à comparer. Utilisez les différents filtres disponibles pour appliquer les options de filtrage d’intérêt. Pour comparer les profils d’expression génétique avec l’outil SAM, modifiez les options de filtrage, y compris le changement de pli, le nombre de permutations, le taux de fausse découverte et le type de comparaison.

Le logiciel calculera l’analyse et fournira des gènes exprimés différemment entre les groupes sélectionnés. Dans cette étude, les changements d’expression des facteurs épigénétiques dans la différenciation normale de cellules de plasma sont étudiés. À l’aide de l’analyse SAM multi-classes, 71 gènes sont considérés comme significativement exprimés différemment entre les cellules B de la mémoire, les préplasmablastes, les plasmablastes, les cellules plasmatiques précoces et les cellules plasmatiques de moelle osseuse avec un taux de fausse découverte de moins de 5%Le stade cellulaire de mémoire B est caractérisé par la surexpression de 23 gènes épigénétiques de joueur, y compris 39,13% des acétyltransferases d’histone, 30,43% des méthyltransferases d’histone , 21,74 % des deméthylases d’histone, 4,35 % des protéines liant le méthyle et 4,35 % des deacetylases histones.

14 gènes des joueurs épigénétiques sont surexprimés de manière significative au stade préplasmablastique, dont 50% des méthyltransferases histones, 14,28% des méthyltransferases d’ADN, 21,43% des deacetylases d’histone, 7,14% des déméthylases d’histone, et 17,14% des acétyltransferases d’histone. À la suite de cette procédure, plusieurs analyses visant à identifier et à comprendre les modifications apportées à la structure et à l’architecture de la chromatine au cours de ces différenciations des cellules plasmatiques B2 ont pu être effectuées. Ce modèle de différenciation in vitro permettra de générer suffisamment de cellules pour compléter cette analyse moléculaire afin de révéler à la fois les voies impliquées dans toute cette modélisation et leur impact transcriptionnel en aval lors de la différenciation des cellules plasmatiques B2.

Ces connaissances dérivées de cette recherche pourraient éclairer et instruire sur les stratégies diagnostiques et thérapeutiques pour les troubles des cellules plasmatiques, comme dans le cas du myélome multiple, un cancer sans remède définitif, pour lequel un meilleur pronostic et des stratégies thérapeutiques améliorées sont absolument nécessaires. Caractériser et comprendre les changements structurels et architecturaux épigénétiques qui affectent la chromatine pendant la différenciation des cellules plasmatiques B2 sera particulièrement intéressant. Ceci pourrait être fait utilisant le séquençage de gène, ERRBS, séquençage d’ATAC, IC, et séquençage d’ARN.

Une hétérogénéité modérée pourrait être observée dans le pourcentage de cellules B activées, de préplasmablastes, de plasmablastes et de cellules plasmatiques, selon le sang sain du donneur, utilisé pour la purification des cellules B de la mémoire.