Name: Évaluation des réponses de l’hôte-pathogène et l’efficacité du vaccin chez la souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Découvrez une méthode d'évaluation in vivo de l'efficacité vaccinale et des réponses immunitaires chez la souris. Ce protocole permet de mesurer la charge bactérienne et les réponses de l'hôte pour divers agents pathogènes.

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole complet décrit ici afin d’étudier l’immunité induite par le vaccin à l’infection par b. pertussis permettra également l’évaluation des réponses de l’hôte à une variété d’autres pathogènes. Le protocole traite de méthodes pour livrer des immunisations, déterminer qui suit l’efficacité vaccin pathogène défi et dissection parallèle de la fonction immunitaire. Dans l’adaptation du protocole afin d’étudier d’autres agents pathogènes, plusieurs paramètres devront être modifiés. Ceux-ci incluent, mais ne s...

Les vaccins représentent l’une des plus grandes réalisations du XXe siècle la santé publique, mais nous ne comprenons toujours pas entièrement les mécanismes par lesquels vaccins efficaces stimulent l’immunité protectrice. L’identification des signatures moléculaires (e.g., marqueurs d’activation cellulaire, expansion des sous-types cellulaires et des caractéristiques de l’expression génique) induite après vaccination fournit une multitude d’informations pour prévoir et générant un efficace réponse immunitaire. La complexité des réponses de l’hôte-pathogène ne peut être reproduite adéquatement à l’aide du systèmes in vitro cell culture1. Les modèles in vivo vaccin visent à évaluer simultanément plusieurs types de cellules immunitaires chez l’hôte. Cela procure un avantage lorsque caractérisant le vaccin antigène traitement et présentation, la sécrétion de cytokines différentielle et expansion des cellules immunitaires. Le protocole décrit ici fournit une méthode détaillée pour déterminer l’efficacité du vaccin par l’évaluation de la réponse immunitaire systémique et locale et quantification de la charge pathogène dans les tissus d’intérêt. L’exemple fourni ici teste l’efficacité d’un vaccin expérimental pour l’agent pathogène Bordetella pertussis (b. pertussis).
B. pertussis est une bactérie Gram-négative qui est l’agent étiologique de la maladie respiratoire coqueluche (pertussis)2,3. Contact étroit avec des personnes infectées (symptomatiques ou asymptomatiques) conduit à la transmission, la colonisation et la maladie. Malgré le vaccin global significatif couverture4, la coqueluche est considéré comme une résurgence de la maladie dans de nombreux pays dans le monde entier et est des principales causes évitables chez les enfants morts5,6,7, 8. en 2015, b. pertussis et la coqueluche ont été inclus dans l’Institut National des allergies et maladies infectieuses (NIAID) émergents liste pathogène/maladies infectieuses, en insistant sur la nécessité pour le développement d’un meilleur vaccin qui confère immunité protectrice longue durée de vie.
Une région active d’enquête pour contrôler la recrudescence de la coqueluche est actuellement, développement d’un vaccin acellulaire contre la coqueluche de prochaine génération (aPV) avec une combinaison optimale de nouveaux adjuvants et antigènes pour imiter la réponse immunitaire provoquée par la cellule entière coqueluche vaccin (PVS)9. En utilisant le protocole décrit, nous avons récemment rapporté que la modification des aPV cours approuvé par la FDA par l’ajout d’un nouvel adjuvant, facteur de colonisation Bordetella A (BcfA), donné lieu à une réduction plus efficace de la charge bactérienne de b. pertussis de poumons de souris10,11. Cette protection accrue a été accompagnée par l’inclinaison d’une réponse immunitaire Th1/Th2 induite par l’alun au plus protecteur du profil immunitaire Th1/Th1710. Ce protocole est détaillé et complet, permettant à l’enquêteur se renseigner maximale durant l’évaluation simultanée de l’hôte et de la réponse immunitaire à une variété de pathogènes.
Le protocole décrit ici suit le calendrier de vaccination représentatif, illustré à la Figure 1, pour assurer des réponses immunitaires hôte optimale.

<table><tbody><tr><td>Chambre d’induction 2L</td><td>Vet Equip</td><td>941444</td><td></td></tr><tr><td>Fluriso</td><td>Vet One</td><td>V1 501017</td><td>n’importe quelle marque est appropriée</td></tr><tr><td>Bordet Gengou Agar Base</td><td>BD bioscience</td><td>248200</td><td></td></tr><tr><td>Caséine</td><td>Sigma</td><td>C-7078</td><td></td></tr><tr><td>Casamino acides</td><td>VWR</td><td>J851-500G</td><td>Passoire Scholte (SS) composants du milieu</td></tr><tr><td>Acide L-glutamique</td><td>Produits de recherche Int</td><td>G36020-500</td><td></td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Produits de recherche Int</td><td>P50200-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>Fisher</td><td>BP362-1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium hexahydraté</td><td>Fisher</td><td>M2670-500G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Fisher</td><td>C75-500</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Fisher</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>L-cystéine HCl</td><td>Fisher</td><td>BP376-100</td><td>Suplements de média SS</td></tr><tr><td>Sulfate ferreux heptahydraté</td><td>Sigma</td><td>F-7002</td><td></td></tr><tr><td>Niacine</td><td>Research Products Int</td><td>N20080-100</td><td></td></tr><tr><td>Glutathion</td><td>Produits de recherche Int</td><td>G22010-25</td><td></td></tr><tr><td>Acide ascorbique</td><td>Produits de recherche Int</td><td>A50040-500</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>F2442-500mL</td><td>&nbsp ; n’importe quelle source américaine, gentamicine non inactivée par la chaleur</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>B-mercaptoéthanol</td><td>Fisher&nbsp ;</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>15mL dounce broyeur de mouchoirs</td><td>Wheaton</td><td>357544</td><td>toute marque similaire est appropriée</td></tr><tr><td>Homogénéisateur à main sans fil</td><td>Kontes/Sigma&nbsp ;</td><td>Z359971-1EA</td><td>toute marque similaire est appropriée</td></tr><tr><td>Instruments - ciseaux, ciseaux courbes, pinces, pinces fines, écarteurs triangulaires</td><td></td><td></td><td>n’importe quelle marque est appropriée</td></tr><tr><td>Seringues de 3 ml</td><td>BD bioscience</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>tubes coniques de 15 ml</td><td>Fisher</td><td></td><td></td>339651</tr><tr><td>tubes microfuge de 1,5 ml</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>70um passoires</td> Fisher<td>&nbsp ;</td><td></td><td></td>22363548</tr><tr><td>plaques de 60 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>130181</td><td></td></tr><tr><td>plaques de culture tissulaire à 48 puits</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>08-772-1C</td><td></td></tr><tr><td>Seringue à insuline 1 mL 28G1/2</td><td>Fisher Scientific/Excel Int.</td><td>14-841-31</td><td></td></tr><tr><td>Souris IFN-gamma ELISA Ready-SET-Go ! Kit</td><td>Invitrogen / eBioscience</td><td>50-173-21</td><td></td></tr><tr><td>Souris IL-17 ELISA Ready-SET-Go ! Kit</td><td>Invitrogen / eBioscience</td><td>50-173-77</td><td></td></tr><tr><td>Souris IL-5 ELISA Ready-SET-Go ! Kit</td><td>Invitrogen / eBioscience</td><td>50-172-09</td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluation des réponses de l’hôte-pathogène et l’efficacité du vaccin chez la souris

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Les vaccins sont une merveille médical de 20ème siècle. Ils ont fortement réduit la morbidité et la mortalité causées par les maladies infectieuses et a contribué à une augmentation frappante de l’espérance de vie dans le monde entier. Déterminer l’efficacité du vaccin reste néanmoins un défi. Des preuves nouvelles suggèrent que le vaccin acellulaire (aPV) pour Bordetella pertussis (b. pertussis) induit l’immunité sous-optimale. Par conséquent, un défi majeur est de concevoir un vaccin de nouvelle génération qui induit une immunité protectrice sans les effets secondaires d’un vaccin à germes entiers (PVS). Nous décrivons ici un protocole que nous avons utilisé pour tester l’efficacité d’un adjuvant prometteur, roman qui biaise la réponse immunitaire à un phénotype Th1/Th17 protectrice et favorise un meilleur dégagement d’un défi de b. pertussis dans le tractus respiratoire murin. Cet article décrit le protocole de vaccination de souris, l’inoculation bactérienne, tissu récolte et analyse des réponses immunitaires. En utilisant cette méthode, au sein de notre modèle, nous avons avec succès élucidé les mécanismes cruciaux induites par un vaccin acellulaire contre la coqueluche prometteuse génération. Cette méthode peut être appliquée à n’importe quel modèle de maladies infectieuses afin de déterminer l’efficacité du vaccin.

Le modèle décrit présente une méthode pour évaluer l’efficacité du vaccin et les réponses immunitaires au cours des interactions hôte-pathogène. La figure 1 illustre le calendrier de vaccination représentatif utilisé pour vacciner et infecter des souris et récolter des tissus pour analyse. Figure 2 illustre la configuration du système anesthésie employée pour induire la souris, permettant aux enquêteurs de livrer les immunisation...

Nous présentons ici un protocole élégant pour in vivo l’évaluation du vaccin hôte et l’efficacité des réponses immunitaires. Ce protocole peut être adapté pour des modèles de vaccin qui étudient les virus, bactéries ou parasites pathogènes.

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Le protocole permet d’évaluer les réponses des hôtes à une variété d’agents pathogènes et de formulations de vaccins. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’évaluation de la charge bactérienne et des réponses immunitaires in vivo, à l’aide d’un modèle animal tractable. Kacy Yount, étudiante diplômée de mon laboratoire, démontre cette procédure.Pour l’immunisation, confirmer un manque de réponse au pincement des pieds chez une souris anesthésiée de six à douze semaines, et charger une seringue à insuline d’un millilitre, munie d’une aiguille de calibre 28,5 avec un millilitre de 0,1 millilitre du vaccin d’intérêt. Tenir la seringue à un angle de 45 degrés, avec le biseau orienté vers le haut, insérer l’aiguille environ cinq millimètres dans le deltoïde de la souris, et injecter le vaccin. Gardez l’aiguille insérée dans le muscle pendant cinq à dix secondes, puis faites pivoter la seringue à 180 degrés, de sorte que le biseau est orienté vers le bas pour créer un joint, et pour prévenir les fuites de vaccin, avant de retirer lentement l’aiguille du site d’injection.Ensuite, retournez la souris dans sa cage, avec surveillance, jusqu’à ce qu’elle se rétablisse complètement. Environ deux semaines après avoir stimulé, infecter les souris vaccinées. Saisissez une souris anesthésiée par le scruff du thorax dorsal, derrière les omoplates et le cou, et placez la souris droite pour accéder au nez.À l’aide d’une pointe de pipette de 200 microlitres, appliquez lentement de 20 à 25 microlitres de l’inoculum bactérien d’intérêt pour chaque nare de l’animal, en tenant la souris jusqu’à ce que l’inoculum entier ait été inhalé. Ensuite, livrer un volume égal de PBS stérile à un groupe de souris comme un contrôle négatif. Au point d’extrémité expérimental approprié, placez un côté ventral de souris infecté vers le haut sur un conseil de dissection, et fixez les membres.Mouiller le corps avec 70% d’éthanol, et utiliser des forceps pour serrer la peau sous l’abdomen au centre du bassin. À l’aide de ciseaux pointus, faire une coupe verticale jusqu’à la mandibule, et disséquer la peau de la paroi péritonéale. Déplacez la peau sur les côtés de la carcasse pour créer un champ dégagé pour la récolte stérile d’organes, et saisissez le péritoine intact sous la cage thoracique, à ou près du foie.Couper le péritoine vers la cage thoracique pour exposer le tube digestif inférieur, et déplacer le côlon vers la gauche pour révéler la rate. À l’aide de forceps incurvés, saisir la rate et disséquer le tissu conjonctif à l’aide de ciseaux. Placez ensuite la rate dans un tube conique de 15 millilitres contenant 3 millilitres de RPMI, et 5% de sérum bovin fœtal sur la glace.Utilisez des forceps pour stabiliser la cage thoracique au processus xyphoïde, et coupez le diaphragme. Les poumons doivent se dégonfler et tomber vers la colonne vertébrale. Coupez la cage thoracique sur les côtés pour enlever la cuirasse, et coupez les artères pulmonaires et les veines pour isoler et enlever le lobe supérieur du poumon droit.Fixer le lobe dans un tube conique de 15 millilitres de formaline tamponnée neutre à température ambiante pendant au moins 24 heures, et isoler les lobes restants des poumons droit et gauche. Placez ensuite les lobes dans un tube conique de 15 millilitres, contenant deux millilitres de 1 % de caséine dans le PBS sur la glace. Utilisez un pipetman d’un millilitre avec pointe pour recueillir le sang remplissant la cavité thoracique, et transférer le sang dans un tube de microcentrifugeuse pré-étiqueté de 1,5 millilitre sur la glace.Enlever les glandes parotides, sublinguales et submaxillaires et les ganglions lymphatiques qui recouvrent la trachée, et ouvrir et enlever les membranes protectrices entourant la trachée. À l’aide de forceps fins et de ciseaux, séparez soigneusement la trachée de l’œsophage et de tout autre tissu conjonctif du haut des clavicules jusqu’au fond de la mandibule. Utilisez des forceps pour tenir la trachée et couper la trachée au sommet de la clavicule.Tirez vers le bas de la trachée pour maximiser l’élasticité, et couper la trachée au fond de la mandibule, juste au-dessus du larynx, isolant environ un centimètre de tissu. Placez ensuite l’organe dans un tube de microcentrifugeuse préétiqueté de 1,5 millilitre, contenant 0,3 millilitres de caséine de 1 % dans le PBS sur la glace. Maintenant, tournez la souris pour un accès clair au nez, et pulvériser la tête avec 70% d’éthanol.Saisissez manuellement l’animal directement derrière le crâne, et utilisez des ciseaux pour couper la chair molle du museau, en commençant par le bas du nez et en se déplaçant vers le haut. Retirez la fourrure, la peau et les moustaches autour du nez, et insérez les extrémités d’une paire incurvée de ciseaux dans les nares avec les courbes pointées vers le bas. Coupez le passage nasal vers les yeux, créant une formation en V.Ensuite, utilisez des forceps fins pour recueillir le septum nasal, et les tissus mous dans la formation, et placez le tissu dans un tube de microcentrifugeuse pré-étiqueté de 1,5 millilitre contenant 0,3 millilitres de 1% de caséine dans PBS, sur la glace. Pour traiter le tissu pulmonaire, transférez le contenu entier du tube d’échantillon pulmonaire dans un homogénéisateur stérile de Dounce de 15 millilitres, et utilisez un pilon pour homogénéiser le tissu. Dissocier l’échantillon jusqu’à ce qu’il ne reste pas de grosses particules de tissu et remettre la suspension homogénéisée au tube original de 15 millilitres.Retirer un aliquot de 0,3 millilitre pour le placage des unités de formation de colonies, et recueillir le reste de l’homogénéité par centrifugation. Aliquot 0,5 millilitres de supernatant dans des tubes de microcentrifugeuse pré-étiquetés pour le stockage à 20 degrés Celsius jusqu’à l’analyse de l’expression cytokine par Eliza. Ensuite, diluer en série 0,1 millilitre aliquots de la suspension pulmonaire homogénéisée mis de côté en 0,9 millilitres de PBS stérile par dilution, et utiliser un épandeur triangle stérile pour plaque 0,1 millilitre de chaque dilution empiriquement choisie sur pré-étiqueté 10%Bordet-Gengou plus plaques streptocolycine.Ici, la densité optique représentative 600 mesures et calculs pour réaliser une suspension bactérienne d’une densité optique, pour préparer un inoculum bactérien dilué cent fois à livrer aux souris, sont montrés. Après sept jours de stimulation antigène vaccinale, les cellules immunisées de la rate du groupe vaccinal combiné produisent de l’interféron gamma et de l’IL17, tout en réduisant considérablement la régulation de l’IL5, favorisant une aide T, une polarisation T 17 de la réponse immunitaire lors d’une infection à coqueluche B. L’énumération par unité de formation de colonies de bactéries récupérées dans les voies respiratoires d’une souris infectée par la coqueluche B peut être utilisée pour évaluer les effets protecteurs du vaccin d’intérêt.Travaillez aussi rapidement et aussi efficacement que possible afin d’éviter la nécrose tissulaire, et stockez le tissu isolé sur la glace pour préserver la viabilité des bactéries récupérées. La cytométrie du flux ELISpot et l’isolement de l’ADN et de l’ARN peuvent être effectués pour évaluer les cellules immunitaires, la production d’analytes et pour permettre des analyses épigénétiques et transcriptomiques. Lorsque vous travaillez avec des agents infectieux tels que bordetella coqueluche, il est important de se rappeler de porter l’EPI approprié, et de travailler dans un cabinet de biosécurité certifié afin de prévenir la transmission d’agents pathogènes.Ce protocole détaille l’énumération de cfu des voies respiratoires, particulièrement le pharynx nasal. Répondre aux questions dans les domaines des vaccins et des maladies infectieuses sur le ciblage de la colonisation bactérienne dans le nez.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Dans cette vidéo, nous décrivons un protocole pour tester l’efficacité d’un vaccin acellulaire contre la coqueluche contre l’infection à Bordetella pertussis chez la souris. Après la vaccination, les souris ont été soumises à une infection et leur homogénat de tissu a été cultivé pour analyser les colonies bactériennes afin de déterminer l’immunité protectrice induite par le vaccin.

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L&#39;utilisation de l&#39;oropharynx Intratrachéal PAMP administration et lavage broncho-alvéolaire pour évaluer l&#39;hôte une réaction immunitaire chez la souris

Les modèles animaux se sont révélés être des outils précieux dans la définition de mécanismes spécifiques hôtes et pathogènes qui contribuent au développement de l'inflammation chronique. Nous décrivons ici un modèle murin d'infection par voie orale avec l'agent pathogène humain Porphyromonas gingivalis et méthodologies de détail pour évaluer la progression de l'inflammation au niveau des sites locaux et systémiques.

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Infection expérimentale avec<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; En tant que modèle pour l&#39;étude de l&#39;hôte Réponses Interféron-y

Virus de l’influenza (IAVs) sont des agents pathogènes respiratoires humains importants. Pour comprendre le pouvoir pathogène de IAVs et d’effectuer des essais précliniques de nouveau vaccin approches, modèles animaux imitant la physiologie humaine sont nécessaires. Nous décrivons ici les techniques pour évaluer l’IAV pathogenèse, humorale et l’efficacité du vaccin en utilisant un modèle de souris de l’infection.

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Évaluation rapide In Vivo des fonctions de génération de l’Adjuvant T cytotoxique Lymphocytes pour le développement de vaccins

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Ici, nous présentons une méthode efficace et efficiente pour les injections de veines de queue de rongeurs à l’aide d’un dispositif de réchauffement / retenue de conception unique. En rationalisant l’initiation des processus de vasodilatation et de contention, ce protocole permet des injections intraveineuses précises et opportunes de grands groupes d’animaux avec une détresse minimale.

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Évaluation des réponses de l’hôte-pathogène et l’efficacité du vaccin chez la souris

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