Name: Évaluation de biomarqueurs dans les gliomes par immunohistochimie sur la paraffine 3D gliome Neurosphère Cultures (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Découvrez une méthode d'immunohistochimie sur neurosphères de gliome en paraffine 3D préservant leur morphologie. Cette technique permet d'évaluer les biomarqueurs tumoraux tout en maintenant la structure tridimensionnelle des cellules.

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Ce travail a été soutenu par la National instituts de santé/National Institute of Neurological Disorders & Stroke (NINDS/NIH) subventions R37-NS094804, NS074387-R01, R21-NS091555 à M.G.C. ; NIH/NINDS accorde R01-NS076991 et NS082311-R01 R01-NS096756 PRL ; NIH/NINDS R01-EB022563 ; 1UO1CA224160 ; le département de neurochirurgie ; Coeur joyeux de Leah M.G.C. et PRL ; et RNA biomédecine Grant F046166 à M.G.C. F.M.M. est pris en charge par un F31 NIH/NINDS-F31NS103500. J.P. disposait d’un Fulbright-argentin ministère des Sports et de la bourse de l’enseignement.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université du Michigan.
1. génération de Brain Tumor Neurospheres provenant d’un modèle de souris
<ol><li>Avant l’intervention de dissection, préparer des cellules souches neurales médias (Media NSC : DMEM/F12 avec 1 supplément de x B27, 1 x N2 supplément, 1 x normocin et 1 x antibiotique/antimycosiques additionné humaine recombinante EGF et basic-FGF à des concentrations de 20 ng/mL de chaque). Remplir un tube de 1,5 mL avec 300 µL de médias NSC et réserver pour plus tard.</li>
	<li>Sélectionnez une souris avec une grande tumeur. Remarque : La taille d’une tumeur peut être surveillée par bioluminescence si le plasmide ou virus injecté encode luciférine. Habituellement, une grande tumeur a une bioluminescence de > 106 photons/s/cm2/sr.</li>
	<li>Euthanasier la souris avec une surdose d’isoflurane : infuser un papier de soie à l’isoflurane et introduire le tissu dans une chambre de l’euthanasie, en évitant tout contact direct avec les souris pour éviter les irritations. Attendez que les souris ne montrent pas un réflexe de pédale (habituellement 5-10 min). Décapiter la souris et disséquer le cerveau tel que décrit dans Calinescu et al. 13.</li>
	<li>Si les tumeurs sont fluorescentes, utilisez un microscope à dissection équipé d’une lampe fluorescente pour identifier la masse de la tumeur dans le cerveau. Avec une pince fine, disséquer la tumeur (habituellement 5-7 mm de diamètre) du tissu cérébral normal.</li>
	<li>Placer la tumeur disséquée dans le tube de 1,5 mL avec les médias de NSC (étape 1.1). Homogénéiser la tumeur avec un pilon en plastique jetable qui s’insère dans les parois du tube microcentrifuge en appliquant une légère pression.</li>
	<li>Pour dissocier les amas de cellule, ajouter 1 mL de médias sans enzymes dissociation et incuber pendant 5 min à 37 ° C.</li>
	<li>Filtrer la suspension cellulaire à travers un tamis de cellule 70 µm et laver la crépine avec 20 mL de médias de la NSC.</li>
	<li>Centrifuger à 300 x g pendant 5 min, éliminer le surnageant et resuspendre le culot dans 6 ou 15 mL de médias de NSC, selon la taille de la pastille.</li>
	<li>Plaque de la suspension de cellules de tumeur dans un flacon de culture T-25 ou T-75 et de la culture à 37 ° C dans un incubateur de culture de tissus avec une atmosphère de 95 % air et 5 % de CO2.</li>
	<li>Après 3 jours, transférer le NS suspension sain et re-plaque eux dans une fiole de culture de tissus T-25 ou T-75. Si nécessaire, ajoutez plus de médias NSC à la culture. Remarque : Il n’y aura généralement une population mixte de cellules, certains seront morts, certains seront sont conformés et certains vont se former NS qui vont flotter dans les médias</li>
</ol>2. Comment entretenir et passage de la NS
NOTE : Éviter la prolifération et maintenir les cellules à une densité relativement élevée. Confluence est déterminée par la taille des sphères (centre noir de grandes sphères surcroissance moyenne). Le taux de croissance de la NS dépendra des oncogènes utilisés pour générer des tumeurs.
<ol><li>Une fois que la culture de NS a atteint confluence, percevoir la culture dans un tube à centrifuger stérile et pellet le NS à 300 g pendant 5 min.</li>
	<li>Jeter le surnageant, ajouter 1 mL de la solution de détachement cellulaire et pipette pour remettre en suspension l’extrait concentré.</li>
	<li>Incuber à 37 ° C pendant 5 min, effleurant le tube toutes les 2 min pour aider la dissociation cellulaire. Remarque : Quand NS rejoindre confluence, ils peuvent être généralement vus macroscopiquement comme des petites sphères blanches. Afin d’assurer la dissociation cellulaire, au moins tous les NS visibles doit avoir disparu.</li>
	<li>Ajouter 5 mL de HBSS 1 x et la pipette plusieurs fois. Culot de cellules à 300 g pendant 5 min. éliminer le surnageant. Resuspendre le culot dans 5 mL de médias de NSC additionné de recombinants EGF et basic-FGF.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de cellules à 15 mL de NSC médias et la culture dans une fiole de T-75 à 37 ° C dans un incubateur de culture de tissus avec une atmosphère de 95 % air et 5 % de CO2.</li>
	<li>Ajouter des facteurs de croissance (EGF et basic-FGF) tous les 3 jours. Si les médias se tourne lumière orange et les cellules ne sont pas encore confluentes, changer les médias. Pour ce faire, centrifuger le NS à 300 g pendant 4 min et remettre en suspension dans les médias de NSC additionnés de facteurs de croissance. Remarque : Selon la taille de la pastille formée, cellules devrez peut-être être scindé en plusieurs flacons.</li>
</ol>3. gel NS pour le stockage à long terme
<ol><li>Quand la culture NS devienne confluente, dissocier les cellules comme décrit aux points 2.1 à 2.4. Dès que le plomb a été re-suspendu dans HBSS, enlevez une partie aliquote et compter les cellules.</li>
	<li>Centrifuger de cellules à 300 g pendant 4 min et retirer autant que possible du liquide surnageant.</li>
	<li>Resuspendre le culot dans la congélation des médias (FBS inactivés par la chaleur, 10 % DMSO). Il est recommandé de geler entre 1 x 106 et 3 x 106 cellules / flacon / mL.</li>
	<li>Diviser les cellules cryovials autant au besoin et lentement refroidir les coupes remises en suspension par la première de les transférer à la glace, puis à-20 ° C, puis à-80 ° C et enfin le lendemain à un conteneur de stockage d’azote liquide.</li>
</ol>4. fixation de la tumeur NS
<ol><li>Tumeur de culture NS dans une fiole de T-25 pendant 2 ou 3 jours jusqu'à ce que les cellules sont confluentes (~ 3 x 106 cellules). Recueillir tumeur NS dans un tube conique 15 mL un flacon confluentes moins d’un T-25. Pellet à 300 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Resuspendre le culot dans 1 mL de formol 10 % et conserver à température ambiante (RT) pendant 10 min. ajouter 5 mL de 1 x HBSS et les cellules comme fait à l’étape 3.2 de granule. Répétez cette étape une fois de plus.</li>
	<li>Placer le tube conique 15 mL contenant le culot sur la glace.</li>
</ol>5. paraffine plongement de tumeur NS
<ol><li>Resuspendre le culot de NS lavé dans 500 µL d’agarose liquide chaud de 2 % et mélanger doucement en pipettant également.</li>
	<li>Placer immédiatement la NS d’agarose incorporé sur la glace jusqu'à ce que l’agarose polymérise. Retirer la pièce de l’agarose hébergeant le NS. Placer l’éprouvette d’agarose polymérisé avec le NS dans la cassette pour tissus traitement (Figure 2).</li>
	<li>Continuer avec le traitement de tissus (à l’aide d’un processeur de paraffine automatique) et de paraffine embedding (à l’aide d’une station d’encastrement).</li>
</ol>6. la section de la Nouvelle-Écosse de paraffine
<ol><li>Mettre le bain d’eau à 42 ° C et insérez la lame sur le microtome soigneusement à l’aide de deux pinceaux pour s’assurer que c’est de niveau. Utiliser cette lame que pour tailler.</li>
	<li>Placez le bloc de paraffine sur le microtome. Avec la main non dominante, appuyez sur le levier situé sur le côté gauche qui contrôle l’épaisseur de chaque section. Appuyez sur pour la deuxième étape qui indique une épaisseur de 30 µm.</li>
	<li>Commencer à tailler le bloc (i.e., enlever la paraffine excès) en tournant le volant à main grossière de la main droite jusqu'à ce que la surface de l’échantillon est atteinte. À ce stade, relâcher le levier qui contrôle l’épaisseur garniture à 10 μm ou 5 μm. Arrêter de tailler quand la surface de l’échantillon est atteint.</li>
	<li>Remplir une glacière avec de la glace et ajouter juste assez d’eau pour que lorsque le bloc de paraffine est placé sur la glace, l’eau agit comme un film autour du bloc de paraffine, protégeant de toucher directement la glace. Incuber le bloc de paraffine sur la glace pendant 20 min.</li>
	<li>Jeter la lame usagée et insérer un nouveau pour la coupe. Bloc sec à l’aide de gaze, puis placez-le sur le microtome.</li>
	<li>Avec la main non dominante, obtenir une paire de pinces courbées qui serviront à tirer sur le ruban de la paraffine. Garder un pinceau humide près de la main droite, qui sera utilisé pour transférer le ruban de paraffine au bain-marie. Commencer à section en tournant le volant à main grossière de la main droite à un rapide rythme. Utilisez la pince dans la main gauche pour maintenir le ruban de la paraffine.</li>
	<li>Le pinceau humide permet de transférer le ruban de paraffine au bain-marie.</li>
	<li>La courbe de la pince permet de séparer les sections en superficiellement plaçant la pince entre deux sections de paraffine, puis en poussant les deux sections de suite doucement. Remarque : Cette motion doit être entièrement sur la surface de la section de la paraffine. N’appuyez pas vers le bas sur la section.</li>
	<li>Utilisez le pinceau humide pour pousser les sections séparées de paraffine sur lames de microscope d’adhérence chargés positivement.</li>
	<li>Laisser les lames sécher pendant la nuit à l’intérieur d’une hotte chimique avant leur stockage dans des boîtes de diapositive. Le stockage des lames dépend du type de tache effectuée.</li>
</ol>7. l’immunohistochimie (IHC) de paraffine NS
<ol><li>Faire fondre la paraffine en plaçant les diapositives dans un support en métal et incuber à 60 ° C pendant 20 min.</li>
	<li>Déparaffiner les diapositives par incubation dans un train de réhydratation à RT : 3 x xylène pendant 5 min, 100 % d’éthanol x 2 pour 2 min, éthanol à 95 % x 2 pour 2 min, éthanol à 70 % x 1 pendant 2 minutes et 1 x eau déionisée pour 2 min. point, garder les lames dans l’eau du robinet jusqu'à ce que la recherche d’antigène , comme le dessèchement provoquera des anticorps non-spécifiques.</li>
	<li>Incuber les lames dans un tampon au citrate (acide citrique 10 mM, 0,05 % de détergent non ionique, pH 6) à 125 ° C pendant 30 s et à 90 ° C pendant 10 s. Laissez-les refroidir, puis rincer les lames 5 fois avec de l’eau distillée.</li>
	<li>Incuber les lames à RT à 0,3 % H2O2 pendant 30 min.</li>
	<li>Laver les diapositives 3 fois en mémoire tampon (0,025 % de détergent au SCT) pendant 5 min avec agitation douce de lavage.</li>
	<li>Incuber les lames à RT avec bloquant la solution (sérum de cheval de 10 %, 0,1 % de BSA au SCT) pendant 30 min.</li>
	<li>Incuber les lames pendant la nuit à 4 ° C dans une chambre humidifiée avec de l’anticorps primaire préparé en solution de dilution (0,1 % de BSA au SCT). Laver les diapositives 3 fois en mémoire tampon pendant 5 min avec agitation douce de lavage.</li>
	<li>Incuber les lames à RT pendant 1 h avec l’anticorps secondaire biotinylé préparé en solution de dilution. Laver les diapositives 3 fois en mémoire tampon pendant 5 min avec agitation douce de lavage.</li>
	<li>Incuber les lames à la RT dans l’obscurité pendant 30 min avec la peroxydase du raifort avidine-biotinylé complexe. Laver les diapositives 3 fois en mémoire tampon pendant 5 min avec agitation douce de lavage.</li>
	<li>Incuber les lames avec DAB-H2O2 substrat marques ici pour 2 à 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Rincer 3 fois avec de l’eau du robinet. Tremper (1-2 s) des diapositives dans la solution de l’hématoxyline à contre-coloration et rincez-les soigneusement à l’eau du robinet jusqu'à la clairière.</li>
	<li>Déshydrater les diapositives comme suit : incuber dans l’eau distillée pendant 2 min, 3 fois de plonger dans l’éthanol à 80 %, incuber dans l’éthanol à 95 % 2 fois pendant 2 min de chaque, incuber dans l’éthanol 100 % 2 fois pendant 2 min chacune et enfin dans le xylène 3 fois pendant 3 min chaque.</li>
	<li>Lamelle couvre-objet les diapositives avec un support de montage à base de xylène et laissez-les sécher sur une surface plane à la droite, jusqu'à ce qu’ils sont prêts pour l’imagerie.       Remarque : Si vous effectuez 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) coloration, les lames peuvent être stockés à température ambiante. Toutefois, si immunofluorescence souillant est effectuée, diapositives doivent être conservés dans l’obscurité à-20 ° C pour réduire les photos-blanchiment.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans cet article, nous détaillons une méthode reproductible et polyvalente pour exécuter immunohistochimie sur gliomes de paraffine NS, qui maintiennent la structure 3D caractéristique des cellules tumorales qui poussent dans le cerveau in situ. Cette technique possède les avantages suivants par rapport à l’aide de cellules plaqués sur les surfaces en plastique ou de verre : J’ai) la préservation de la structure 3D de la Nouvelle-Écosse ; II) en évitant de stress de dissociation cellulaire avant l’analyse de l’e...

Les gliomes sont des tumeurs solides primaires du système nerveux central classées selon leurs caractéristiques phénotypiques et génotypiques selon l' organisation mondiale de la santé1. Cette classification comprend la présence ou l’absence de mutations de pilote, qui représentent une source attrayante de biomarqueurs2. Biomarqueurs sont des caractéristiques biologiques qui peuvent être mesurés et évalués pour indiquer les processus normaux et pathologiques, ainsi que des réponses pharmacologiques à une intervention thérapeutique à3. Biomarqueurs peuvent être détectées dans les tissus tumoraux et cellules de gliome, ce qui permet sa caractérisation biologique sous différents aspects. Quelques exemples de biomarqueurs de gliome muté isocitrate déshydrogénase 1 (IDH1), une enzyme mutante caractéristique des gliomes de bas-grade associés meilleur pronostic4. IDH1 muté s’exprime souvent en combinaison avec TP53 et alpha-thalassémie/mental retardation syndrome lié à le X (ATRX)-inactivation des mutations, définissant un gliome spécifique du sous-type4,5. Mutations inactivant ATRX également se produisent dans 44 % des gliomes de haut grade pédiatriques2,6 et ont été associées à des tumeurs agressives et instabilité génomique6,7. En outre, pédiatriques diffus intrinsèques pontines gliomas (DIPG) sont différenciés en sous-groupes selon la présence ou l’absence d’une mutation de K27M dans le gène H3F3A de l’histone H3, ou dans le gène HIST1H3B/C1,6. Par conséquent, l’introduction de la caractérisation moléculaire permet la subdivision, étude et le traitement des gliomes comme des entités distinctes, ce qui permettra le développement de plus de plus des traitements pour chaque sous-type ciblés. En outre, l’analyse de biomarqueurs peut servir à évaluer les différents processus biologiques tels que l’apoptose8autophagie9, cycle cellulaire progression10, cellule prolifération11et la différenciation des cellules12 .
Des modèles animaux issus du génie génétique qui hébergent les lésions génétiques présentes dans les cancers humains sont essentiels pour l’étude de la signalisation des voies qui véhiculent la progression de la maladie. Notre laboratoire a mis en place l’utilisation du système transposase Sleeping Beauty (SB) pour développer des modèles de souris génétiquement modifiées de gliome hébergeant des mutations spécifiques qui récapitulent gliome humain sous-types13,14. Ces modèles de souris génétiquement modifiées sont utilisées pour générer des dérivées de tumeurs NS, qui permettent des études in vitro dans un système 3D, mise en miroir des traits saillants présent dans les tumeurs in situ15. Aussi, la greffe d’orthotopical de NS chez la souris peut générer des tumeurs secondaires qui conservent les caractéristiques de la tumeur primitive et imitent les propriétés phénotypiques, génomiques et histopathologiques des tumeur primitive correspondante15.
Dans la culture sans sérum, cellules de tumeur du cerveau avec des propriétés de cellules souches peuvent être enrichies, et en présence de facteurs de croissance épidermiques (EGF) et facteurs de croissance fibroblastiques (FGF), ils peuvent être cultivés comme colonies de culture cellulaire unique comme cultures de NS. Dans ce système de culture sélective, la plupart des cellules de différenciation ou différenciées rapidement mourir, alors que les souches cellules se divisent et forment des amas cellulaires. Cela permet la génération d’une culture de NS qui maintient les gliomes tumeur caractéristiques16,17,18. Gliome NS peut servir à évaluer plusieurs aspects de la biologie tumorale, y compris l’analyse de biomarqueurs qui ont des applications dans le diagnostic, le pronostic, classement, état de la progression tumorale et état de différenciation cellulaire. Ici, nous détaillons un protocole pour générer des gliomes NS et intégrer les cultures 3D en paraffine à utiliser pour la coloration de IHC. Un des avantages de la fixation et l’incorporation de gliome NS, c’est que la morphologie de la Nouvelle-Écosse est mieux maintenue par rapport au conventionnel cytospin méthode19, dans laquelle gliome NS sont soumis à des manipulations stressantes pour la dissociation cellulaire et deviennent aplaties. En outre, enrobage étanche toute expression de fluorophore endogène de tumeur génétiquement NS, ce qui permet une coloration dans les spectres de fluorescence. L’objectif général de cette méthode consiste à préserver la structure 3D des cellules de gliome par une paraffine intégrant les processus et permettre la caractérisation des gliomes neurospheres par immunohistochimie.

<table><tbody><tr><td>Lame de microtome revêtue HP35</td><td>Thermo Scientific</td><td>3150734</td><td></td></tr><tr><td>Microtome RM 2135</td><td>Leica</td><td>MR2135</td><td></td></tr><tr><td>Solution de formol, tamponnée neutre, 10 %</td> <td>Sigma-aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit polyclonal anti-ATRX,Santa</td> <td>Cruz Biotechnology</td><td>sc-15408</td><td>IHC, dilution 1:250</td></tr><tr><td>Rabbit polyclonal anti-Ki-67</td><td>Abcam</td><td>Ab15580</td><td>IHC, dilution 1:1000</td></tr><tr><td>Lapin polyclonal anti-OLIG2</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td>IHC, dilution 1:500</td></tr><tr><td>Chèvre polyclonal anti-lapin bioconjugué</td><td>Dako</td><td>E0432</td><td>IHC, dilution 1:1000</td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC HRP kit</td><td>Vector Laboratories Inc</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT</td><td>Biocare médical</td><td>BDB2004 L/prix till 12/18</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplément</td><td>ThermoFisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-27 Supplément</td><td>ThermoFisher</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>Accutase&reg ; Solution de décollement de cellules</td><td>Biolegend</td><td>423201</td><td></td></tr><tr><td>AGAROSE LE</td><td>GoldBio</td><td>A-201-1000</td><td></td></tr><tr><td>Genesee Sc. Corporation</td><td>Olympus 15 ml</td><td>21-103</td><td></td></tr><tr><td>Genesee Sc. Corporation</td><td>TC-75 gourde</td><td>25-209</td><td></td></tr><tr><td>Genesee Sc. Corporation</td><td>TC-25 gourde</td><td>25-207</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330-057</td><td>NS media</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>GibcoTM</td><td>14175-103</td><td>solution saline équilibrée</td></tr><tr><td>C57BL/6</td><td>Taconic</td><td>B6-f</td><td>C57BL/6</td></tr></tbody></table> souris

Évaluation de biomarqueurs dans les gliomes par immunohistochimie sur la paraffine 3d gliome neurosphère cultures

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Analyse de l’expression de la protéine dans les gliomes est pertinente pour plusieurs aspects dans l’étude de sa pathologie. Nombreuses protéines ont été décrits comme biomarqueurs avec des applications dans le diagnostic, le pronostic, classement, état de la progression tumorale et état de différenciation cellulaire. Ces analyses de biomarqueurs sont également utiles pour caractériser les tumeurs neurospheres (NS) produit de patients de gliome et modèles de gliome. NS de tumeur fournissent un modèle précieux in vitro pour évaluer les différentes caractéristiques de la tumeur d'où ils proviennent et peuvent mieux miroir gliome biologie. Nous décrivons ici une méthode détaillée pour analyser des biomarqueurs dans la tumeur NS à l’aide de l’immunohistochimie (IHC) sur tumeur paraffine NS.

Pour suivre le développement de tumeurs et d’évaluer si la tumeur a atteint la taille nécessaire pour générer les NS, nous avons analysé la luminescence émise par des tumeurs à l’aide de bioluminescence. Ceci permet l’étude de l’efficacité de la transduction dans les chiots et la progression tumorale par le signal de la luminescence de la luciférase (Figure 1A et 1 b). Lorsque la taille de la tumeur atteint un signal de 1 x 1...

Neurospheres cultivés comme 3D cultures constituent un outil puissant pour étudier la biologie de gliome. Nous présentons ici un protocole pour effectuer l’immunohistochimie en conservant la structure 3D de gliome neurospheres par enrobage de paraffine. Cette méthode permet la caractérisation des propriétés neurosphère gliome tels que stemness et différenciation neurale.

Évaluation de biomarqueurs dans les gliomes par immunohistochimie sur la paraffine 3D gliome Neurosphère Cultures

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Ce protocole est significatif parce que peut être employé pour étudier la présence du biomarqueur de gliome par une méthode qui préserve la structure 3D des neurosphères de tumeur. Le principal avantage de ce protocole est que la morphologie des neurosphères est maintenue par rapport à la méthode de cytospin dans laquelle les cellules sont soumises à une manipulation stressante et s’aplatir. Cette méthode peut être appliquée à tous les autres systèmes de culture tissulaire dans lesquels les cellules sont cultivés en 3D et le maintien de la structure est important.Pour commencer, la culture des neurosphères tumorales ou NS dans un flacon T-25 jusqu’à ce que les cellules sont confluentes. Élire la tumeur NS dans un tube conique de 15 millilitres. Impellet la NS à 300 Gs pendant cinq minutes.Après cela, suspendre à nouveau la pastille en un millilitre de 10% de formaline et incuber le tube à température ambiante pendant 10 minutes. Ajouter cinq millilitres de HBSS à la NS re-suspendue. Impellet les cellules comme précédemment décrit. Placer le tube contenant la pastille sur la glace.Suspendre à nouveau la pastille NS lavée dans 500 microlitres d’agarose liquide chaud à deux pour cent.

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Ce protocole vidéo démontre l'isolement et l'expansion des cellules souches comme des cellules de glioblastome mutliforme résection chirurgicale humaine (GBM) tissu tumoral en utilisant la méthode de dosage Neurosphère culture.

L&#39;isolement et l&#39;expansion des cellules humaines de glioblastome multiforme tumeur utilisant le test Neurosphère

Source : Núñez, F. J., et al. Évaluation des biomarqueurs dans le gliome par immunohistochimie sur des cultures de gliome 3D de la neurosphère intégrées à la paraffine. J. Vis. exp. (2019). Cette vidéo fait la démonstration d’une technique immunohistochimique pour le marquage de biomarqueurs tumoraux dans les neurosphères tumorales cérébrales intégrées à la paraffine. Les sections de la neurosphère subissent une élimination de la paraffine et une réhydratation, suivies d’un traitement visant à...

Coloration immunohistochimique de biomarqueurs dans des coupes de la neurosphère d’une tumeur cérébrale

Protocole pour la propagation des spécimens chirurgicaux à haute teneur dissociés de gliome dans le milieu sans sérum de neurosphère pour sélectionner pour des cellules avec le phénotype de cellules souches cancéreuses. Pour les spécimens qui ne se développent pas en tant que neurosphères, un protocole alternatif est suggéré. Une technique de incorporation de paraffine pour maintenir l’architecture 3D de neurosphère pour immunocytochemistry est décrite.

Optimisation de la culture cellulaire de gliome de haut grade à partir d’échantillons chirurgicaux pour une utilisation dans des modèles animaux cliniquement pertinents et l’immunochimie 3D

Ce protocole a été développé pour identifier quantitativement les composants de micro-environnement de la tumeur dans les résections du patient au glioblastome utilisant l'immunohistochimie chromogène et ImageJ.

Immunohistochimie quantitatif du microenvironnement cellulaire dans les résections du glioblastome du patient

Ici, nous présentons un système de culture monocouche mixte ex-vivo pour l'étude de la migration des cellules de gliome humain (hGC) en temps réel. Ce modèle permet d'observer les interactions entre les hGC et les axones myélinisés et non myélinisés dans une chambre compartimentée.

Surveillance en temps réel de la migration cellulaire des gliomes humains sur les co-cultures d'Axon-Oligodendrocyte de Ganglion de racine dorsal

La microdissection laser (LMD) est une technique sensible et hautement reproductible qui peut être utilisée pour découvrir des voies qui médité glioma hétérogénéité et invasion. Ici, nous décrivons un protocole optimisé pour isoler les zones discrètes du tissu de gliome utilisant le LMD laser suivi de l’analyse transcriptomique.

Microdissection laser de sous-régions de Glioma pour la caractérisation spatiale et moléculaire de l’hétérogénéité intratumorale, des oncostreams et de l’invasion

Ici, nous décrivons un essai d’invasion facile à utiliser pour le glioblastome. Cet essai convient aux cellules souches du glioblastome. Une macro fidjienne pour faciliter la quantification de l’invasion, de la migration et de la prolifération est également décrite.

Un modèle sphéroïde 3D pour le Glioblastome

Ici, nous établissons une plateforme de profilage métabolique intégrant des sphéroïdes de gliome tridimensionnels (3D) et une normalisation basée sur l’imagerie via l’analyse des flux extracellulaires. Cette approche permet une évaluation plus précise des réponses métaboliques tumorales aux traitements médicamenteux et donne un aperçu des mécanismes potentiels de résistance.

Progrès dans le profilage métabolique des sphéroïdes de tumeurs cérébrales tridimensionnelles pour le criblage de médicaments

Nous présentons un modèle de migration 3D du glioblastome utilisant des gliomasphères magnétiques dérivées du patient générées à partir de tumeurs nouvellement diagnostiquées et récurrentes. Cette plateforme permet de visualiser la dynamique migratoire spécifique au patient et d’évaluer l’efficacité thérapeutique. Le test peut être multiplexé après migration afin d’évaluer la localisation et les schémas d’expression des protéines.

Essai de migration du glioblastome 3D reproductible avec localisation sphéroïde médiée par nanoparticules magnétiques dans des conditions hypoxiques

Ce protocole décrit une méthode pour le traitement rapide de la post-mortem diffuse des échantillons de gliome pontique intrinsèques pour l'établissement de modèles de culture de cellules provenant de patients ou la caractérisation directe des cellules tumorales et microenvironnement.

Un protocole pour Rapid Post-mortem Culture cellulaire de Diffuse Intrinsic Pontine gliome (DIPG)

Découvrez une méthode d'immunohistochimie sur neurosphères de gliome en paraffine 3D préservant leur morphologie. Cette technique permet d'évaluer les biomarqueurs tumoraux tout en maintenant la structure tridimensionnelle des cellules.

Évaluation de biomarqueurs dans les gliomes par immunohistochimie sur la paraffine 3D gliome Neurosphère Cultures

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