Stimulation électrique et mécanique simultanée pour promouvoir le potentiel de cellules Cardiomyogénique
18 janvier 2019
Nous présentons ici un protocole pour la formation d’une population de cellules à l’aide de stimuli électriques et mécaniques, émulant la physiologie cardiaque. Cette stimulation électromécanique améliore le potentiel de cardiomyogénique des cellules traitées et est une stratégie prometteuse pour autre thérapie cellulaire, modélisation de la maladie et dépistage des drogues.
Il s’agit d’une méthode pour appliquer la stimulation électromécanique sur les cellules. Il a de multiples applications pour étudier ses effets sur une population cellulaire, la pré-formation pour l’accouchement in vivo, et la maturation cellulaire. L’avantage est que les stimuli électriques et mécaniques peuvent être appliqués avec le même dispositif individuellement ou simultanément tout en gardant stérile virale intacte.
Cette technique est une approche indirecte de notre thérapie. La thérapie cellulaire est considérée comme des cellules électromécaniquement stimulées peut être une population cellulaire intéressante pour traiter l’intro-myocarde. Cette méthode appartient généralement au domaine cardiovasculaire, mais elle pourrait également être appliquée au système nerveux.
C’est une technique facile qui demande de la patience. La partie la plus difficile sera de travailler avec les petits morceaux, et de garder la stérilité tout au long. Il ya peu de détails de manipulation qui sont difficiles à expliquer, de sorte que la démonstration visuelle est vraiment utile.
Commencez par transférer 12 constructions PDMS nettoyées sur des plaques stériles de 10 centimètres. Pour assurer une stérilisation complète, exposez les plaques à la lumière UV pendant cinq minutes. Transférez ensuite chaque construction dans une plaque distincte de culture cellulaire de 35 millimètres, ou des plaques de 6 puits pour l’ensemencement immédiat des cellules.
Pour commencer l’ensemencement cellulaire, lavez d’abord un flacon confluent T75 d’ATDPCs cardiaques avec cinq millilitres de 1x PBS. Pour détacher les cellules, ajouter un millilitre de 0,05% trypsine-EDTA. Et incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Ajouter ensuite cinq millilitres de milieu complet pour inactiver la trypsine-EDTA. Recueillir toutes les cellules détachées dans un tube de 15 millilitres. Lavez le verre cellulaire deux fois avec cinq millilitres de PBS pour recueillir les cellules restantes, et ajoutez-les au tube de 15 millilitres.
Centrifugeuse à 230 g pendant cinq minutes à 22 degrés Celsius. Retirez le supernatant et suspendez les cellules en deux millilitres de milieu complet et comptez-les avec l’hémocytomètre. Semences 200 microlitres d’ATDPCs cardiaques dans chaque plaque avec le PDMS construit pour obtenir environ 80% de la surface d’ensemencement couverte par les cellules le lendemain.
Incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Ajouter délicatement 2 millilitres de milieu complet préchauffé par assiette. Incuber les cellules avec les constructions à 37 degrés Celsius, et 5% de CO2 pendant la nuit.
Avant de commencer cette procédure, assigner six des 12 constructions pour la stimulation électromécanique, et en garder six pour les contrôles non stimulés. Utilisez 70% d’éthanol pour nettoyer l’unité de stimulation. Placez l’unité de stimulation, les électrodes stériles et les pinces à épiler à l’intérieur de l’armoire d’écoulement.
Afin de manipuler facilement les électrodes et les constructions, retirez 90% du milieu de chaque plaque de culture cellulaire. Placez les constructions PDMS dans la bonne position vers l’aimant pour assurer l’attraction magnétique entre les aimants fixes et mobiles. Ces deux étapes précédentes dans lesquelles vous manipulez les constructions PDMS ensemencées de la cellule et les électrodes tout en gardant la stérilité tout au long du processus sont les plus critiques.
Ensuite, connectez le fil de platine aux connecteurs d’électrode. Orientez la partie PTFE des électrodes dans leurs espaces désignés dans les constructions PDMS. Ajouter 2,5 millilitres de milieu complet frais préchauffé à chaque construction.
Une fois que toutes les constructions PDMS sont placées et reliées électriquement à la plate-forme, placez la plate-forme dans l’incubateur de 37 degrés Celsius et de 5 % de CO2. Puis connectez la source électrique et mécanique. Pour configurer le programme de stimulation, spécifiez les régimes de stimulation électrique et mécanique à travers les interfaces utilisateur du stimulateur électrique et de l’application, qui contrôle la stimulation mécanique.
Pour régler le synchronisme, allumez le stimulateur électrique et attendez que le menu principal apparaisse sur l’écran. Sélectionnez ensuite l’option deux, modifiez la séquence, plus Entrez. Pour modifier le menu séquence, utilisez l’onglet mode pour sélectionner le courant " en cliquant plus " et en appuyant sur Entrez " Pour la période, sélectionnez 1000"avec plus/moins et appuyez sur Entrez"Et pour l’onglet mode déclencheur, sélectionnez externe par logiciel et appuyez sur Entrez"Pour l’onglet amplitude, sélectionnez 1"avec plus/moins et appuyez sur Entrez"Puis, de retour dans le menu principal, sélectionnez l’option 4, puis générer de la séquence, puis appuyez sur Entrez"Dans la section de stimulation mécanique du panneau d’application de contrôle, d’abord écrire 1000"dans le contrôle du texte période plus.
Écrivez ensuite 500"dans le contrôle du texte de temps ON, pour définir la durée mécanique de l’impulsion. Enfin, écrivez 2000"dans le contrôle du texte d’excursion pour livrer une allongement de construction de 10%. Changez les médias cellulaires deux fois par semaine, en supprimant d’abord les anciens médias, puis en ajoutant des médias chauds et frais sur les côtés du support PDMS.
Le septième jour, à la fin de l’expérience, recueillir les échantillons tels que décrits dans le manuscrit. Les ATDPCs cardiaques électromécaniquement stimulés ont augmenté leur potentiel cardiomyogenic. Ceci a été indiqué par PCR en temps réel montrant l’expression accrue des gènes cardiaques tôt et en retard spécifiquement le facteur cardiaque de transcription GATA-4, la chaîne lourde structurale de bêta-myosine de marqueur, et le gène lié au calcium Connexin43.
La coloration de phalloidin contre des fibres d’actine a prouvé que la majorité des cellules alignées selon le modèle vertical. La distribution de Connexin43 était la plupart du temps dans le cytoplasme, et à la membrane de plasma, contribuant à la communication intracellulaire par des jonctions d’écart. Les facteurs de transcription MEF2 et GATA-4 ont été localisés aux noyaux dans les ATDPCs cardiaques.
Mais gata-4 n’a pas été détecté dans les ATDPCs sous-cutanés. Les marqueurs cytoplasmiques SERCA2, et l’alpha-actinine sarcomeric, n’ont pas montré une organisation mature de sarcomere typique pour des cardiomyocytes. Et les coups n’ont pas été observés dans le contrôle et stimulé les populations cellulaires.
Un monocouche cellulaire sain au début de ce protocole et le maintien de la stérilité tout au long de la procédure sont cruciales. Après la collecte de l’échantillon, les techniques standard d’expression des protéines du génome peuvent être effectuées. Cette technique permet de mieux comprendre l’effet des stimuli électriques et/ou mécaniques cellulaires.
Jusqu’à récemment, il était impossible d’utiliser le même dispositif pour les deux stimulations, ce qui rend les résultats plus difficiles à comparer.
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Aperçu
Cet article présente une méthode permettant d'appliquer une stimulation électromécanique aux cellules, augmentant ainsi leur potentiel cardiomyogénique. Cette technique trouve des applications en thérapie cellulaire, en modélisation des maladies et en criblage de médicaments.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Recherche cardiovasculaire
- Thérapie cellulaire
- Applications en neurosciences
Contexte
- La stimulation électromécanique peut améliorer la maturation cellulaire.
- Cette méthode permet l'application simultanée de stimuli électriques et mécaniques.
- La technique préserve des conditions stériles pour l'intégrité virale.
- Elle est pertinente pour les études portant sur le système cardiaque et le système nerveux.
Objectif de l'étude
- Améliorer le potentiel cardiomyogénique des populations cellulaires.
- Explorer les effets de la stimulation électromécanique sur les cellules.
- Proposer une méthode de préparation préalable à la livraison in vivo.
Méthodes utilisées
- Application de stimuli électriques
- Application de stimuli mécaniques
- Techniques de stimulation simultanée
- Préservation des conditions stériles
Résultats principaux
- Amélioration de la maturation des cellules traitées.
- Potentiel pour des applications thérapeutiques efficaces à base de cellules.
- Versatilité d'application dans différents domaines.
- Indications encourageant des recherches supplémentaires en modélisation des maladies.
Conclusions
- La stimulation électromécanique est une stratégie prometteuse pour la thérapie cellulaire.
- Cette méthode pourrait conduire à des progrès dans le criblage de médicaments.
- Des études supplémentaires sont nécessaires pour explorer tout son potentiel.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La stimulation électromécanique répond à une limitation majeure de la thérapie cellulaire cardiaque : le phénotype immature des cardiomyocytes dérivés de cellules souches. En reproduisant les signaux électriques et mécaniques physiologiques, cette méthode améliore le potentiel cardiomyogénique, renforçant ainsi la fiabilité prédictive des modèles précliniques. Cela permet de réduire les risques associés aux thérapies cellulaires et aux plateformes de modélisation des maladies avant les études préalables à l'AMM.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'étudier l'engagement dans la lignée cardiaque par la surexpression de gènes précoces (GATA-4), structuraux (chaîne lourde bêta de la myosine) et régulateurs du calcium (Connexine43).
- Valeur opérationnelle : Fournit une plateforme normalisée de stimulation pour comparer les effets du conditionnement électrique, mécanique ou combiné sur des populations cellulaires.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des cellules électriquement et mécaniquement conditionnées, présentant des fibres d’actine alignées et une connexine 43 localisée au niveau membranaire, favorisant la préparation aux tests fonctionnels.
- Valeur opérationnelle : Permet un préconditionnement reproductible de lots cellulaires en vue d’un profilage reproductible de la réponse aux médicaments dans des formats à haut débit.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Relie la découverte et les flux de travail précliniques en favorisant la maturation des cellules vers un phénotype proche de celui des cellules adultes, réduisant ainsi l'ambiguïté mécanistique dans les études de greffage.
- Valeur opérationnelle : Permet la production à grande échelle de populations cellulaires stimulées pour des criblages de réponse-dose et de toxicité dans des modèles de maladies cardiovasculaires.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode s'inscrit dans la continuité découverte-préclinique, permettant la génération de cellules conditionnées après l'expansion des progéniteurs et avant la validation fonctionnelle ou les tests de composés.
- Biologie de la découverte : Teste l'hypothèse selon laquelle des signaux biophysiques induisent la différenciation en cardiomyocytes, permettant ainsi la validation de cibles par l'expression de marqueurs.
- Criblage : Génère des cellules préparées par stimulation présentant un couplage structural et électrique amélioré, augmentant ainsi la sensibilité des tests aux composés cardiotropes.
- Analytique : Fournit des résultats quantitatifs par PCR et imagerie (par exemple, expression génique, alignement de l'actine, distribution des jonctions gap) permettant des comparaisons objectives entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Fait progresser les cellules depuis un état précurseur vers un phénotype cardiaque plus mature, assurant une continuité préclinique dans la modélisation des maladies.
- Réutilisation en entreprise : La plateforme de stimulation peut être réutilisée avec différentes lignées cellulaires et régimes de stimulation, favorisant ainsi une standardisation entre les équipes de découverte.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive dans la spécification de lignage cardiaque grâce à des analyses multiparamétriques de maturation.
- Valeur opérationnelle : Une stimulation électrique et mécanique simultanée, stérile, réduit la variabilité et la manipulation manuelle.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'aller/arrêt en réduisant les incertitudes mécanistiques relatives aux mécanismes d'action des thérapies cellulaires.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des candidats cellulaires selon leur potentiel de maturation en réponse à la stimulation.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Compétences en culture cellulaire, technique stérile et utilisation d'appareils de stimulation.
- Accès à des stimulateurs électriques et mécaniques dotés d'un logiciel de commande synchronisé.
- Protocoles normalisés pour l'ensemencement des constructions, le changement de milieu et la configuration des paramètres de stimulation.
- Considérations d'adaptation selon les types cellulaires, les matériaux de matrice et les formes d'onde de stimulation.
- Limite : la maturation a été évaluée par l'expression des marqueurs ; aucune mesure fonctionnelle, comme la contractilité, n'a été observée dans cette étude.
