Name: Détection d’activité de la protéase par Zymographie peptides fluorescents (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Découvrez la zymographie par peptides fluorescents pour la détection des protéases en biochimie. Cette technique modulaire permet de cibler des protéases spécifiques et d'étudier leur activité dans les biomatériaux.

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Financement fourni par The Ohio State University College of Engineering, département de génie biomédical et le Comprehensive Cancer Center - Arthur G. James Cancer Hospital et Richard J. Solove Research Institute.

1. préparation de la couche de Gel résolution
<ol><li>Préparer un 10 % de polyacrylamide résoudre solution de gel conformément au tableau 1. Ajouter la Tétraméthyléthylènediamine (TEMED) et le Persulfate d’Ammonium (APS) immédiatement avant de couler le gel comme leur ajout initie la réaction de polymérisation.</li>
	<li>Remplir une cassette de mini gel de vide de 1,5 mm à mi-chemin (5 mL) avec la solution de gel résolution de 10 %.</li>
	<li>Ajoutez une fine couche d’isopropanol (~ 500 µL) en haut du gel polyacrylamide de produire un gel niveau et éviter les bulles. Utiliser la solution de restes de polyacrylamide pour suivre l’avancement de la réaction de polymérisation. Lorsque le polyacrylamide dans le tube est complètement durcie, la réaction est complète (~ 40 min).</li>
</ol>2. préparation de la molécule Azido-PEG3-maléimide Linker
<ol><li>Alors que la première couche de gel résolution est polymérisant, récupérer le kit azido-PEG3-maléimide du stockage-20 ° C et laisser les composants à température ambiante. Il y a deux composantes dans chaque kit. Flacon 1 contient un ester maléimide-NHS, un blanc cassé au gris solide. Flacon 2 contient azido-PEG3-amine, une huile légèrement jaune. Remarque : Les auteurs vous suggérons d’utiliser le kit d’azido-PEG3-maléimide 25 mg car il ne peut être stocké pendant de courtes périodes de temps (1 à 2 heures) à-20 ° C après être préparé avant de commencer à se dégrader. 25 mg est suffisante pour produire 10 gels de peptide. Utiliser des gels dans les 3 semaines de préparation.</li>
	<li>Dissoudre les composants du flacon 2 dans le fabricant recommandé volume de diméthylsulfoxyde (DMSO) et vortexer pendant 30 s pour assurer les liquides ont été bien mélangés.</li>
	<li>Transvaser le contenu du flacon 1 dans un ballon à fond rond propre et sec 100 mL contenant une barre de remuer. Remarque : Rincer le ballon avec de l’acétone et sécher complètement avant utilisation pour empêcher l’humidité d’interférer avec la réaction.</li>
	<li>Insérer immédiatement un bouchon en caoutchouc de cloison avec un diaphragme qui peut être percé avec une seringue dans la bouche du ballon. Travailler rapidement pour empêcher l’humidité d’entrer dans la fiole.</li>
	<li>Insérer deux 18 jauge aiguilles de seringues dans le diaphragme et connecter l’un à un réservoir de gaz inerte (gaz argon,etc. ). Laisser le gaz inerte pour remplir la fiole pendant 3 min. mélanger les composants des flacons 1 et 2 sous gaz inerte pour éviter que des produits de réaction indésirable. Attention : La deuxième aiguille de seringue est de fournir un évent, permettant ainsi à l’air atmosphérique, contenue dans le ballon s’écouler de la fiole qu’il remplit de gaz inerte. N’oubliez pas d’inclure une aiguille de vent !</li>
	<li>Couper le gaz inerte et retirez-le de l’aiguille. À l’aide d’une seringue, injecter la totalité du contenu du flacon 2 dans la fiole.</li>
	<li>Retirer les aiguilles et seringues et laisser les composants à mélanger pendant 30 min à température ambiante tout en remuant.</li>
	<li>Enlever le bouchon du septum en caoutchouc et verser le contenu dans un tube à centrifuger propre de 5 mL. La solution azido-PEG3-maléimide doit être utilisée au sein de 1 heure à température ambiante.</li>
</ol>3. préparation du Peptide résoudre la couche de Gel
<ol><li>Une fois la première couche de gel résolution a polymérisé, décanter la couche de l’isopropanol. Rincez la partie supérieure du gel par pipetage 1 mL d’eau désionisée sur le dessus du gel et puis versez l’eau.</li>
	<li>Extraire le peptide fluorescent fonctionnalisés thiol du stockage de-80 ° C et laisser décongeler à température ambiante. Remarque : Le peptide fonctionnalisés thiol peut être préparé comme décrit plus haut11,12. Peptides disponibles dans le commerce peuvent également être utilisés, mais exigent l’ajout d’un résidu cystéine terminale pour permettre le maléimide-thiol cliquez sur réaction. Dissoudre le peptide à une concentration de stock de 10 mM et conserver à-80 ° C dans de petites aliquotes (30 uL) pour limiter les cycles répétés de gel-dégel.</li>
	<li>Préparer une solution de gel contenant la molécule azido-PEG3-maléimide linker et le peptide fluorescent conformément au tableau 1de résoudre de 10 %. Ajouter le TEMED et APS immédiatement avant de couler le gel comme leur ajout initie la réaction de polymérisation.</li>
	<li>Remplir la moitié de la portion restante de la cassette de gel (3 mL) avec le peptide résoudre solution de gel. Remarque : Une approche multicouche de gel résolution réduit la quantité de peptide et linker nécessaire à chaque gel. La taille de la couche de gel résolution de peptide est réglable pour s’adapter à un plus large éventail de poids moléculaires au besoin.</li>
	<li>Pipeter une mince couche d’isopropanol (~ 500 µL) vers le haut du gel polyacrylamide de produire un gel niveau et éviter les bulles. Utiliser la solution de restes de polyacrylamide pour suivre l’avancement de la réaction de polymérisation. Lorsque le polyacrylamide dans le tube est complètement durcie, la réaction est complète (~ 40 min). Remarque : Le peptide fluorescent est sensible à la lumière. Garder les gels recouverts de papier aluminium pour éviter le Photoblanchiment au développement, électrophorèse, lavage et préparation du gel.</li>
	<li>Décanter la couche isopropanol et rincer la partie supérieure du peptide résoudre le gel avec de l’eau désionisée comme au point 3.1.</li>
	<li>Si utiliser les gels immédiatement, passez à l’étape 4, dans le cas contraire, immergez les gels préparés dans 100 mL de 1 x tamponné phosphate salin (PBS) à 4 ° C dans une boîte en plastique pour éviter les gels ne se dessèchent pas. Envelopper la boîte en papier d’aluminium pour éviter le Photoblanchiment. Gels peuvent être stockées dans du PBS jusqu'à 3 semaines avant son utilisation.</li>
</ol>4. préparation du Gel empilable
<ol><li>Préparer une solution de gel empilage de 5 % selon le tableau 1. Ajouter le TEMED et APS immédiatement avant de couler le gel comme leur ajout initie la réaction de polymérisation.</li>
	<li>Remplir la partie restante de vide de la cassette de gel (environ 2 mL) avec la solution de gel empilage.</li>
	<li>Insérer rapidement un peigne de gel de 1,5 mm dans la couche de gel d’empilement, n’assurant aucune bulle reste coincés sous les puits. Utiliser la solution de restes de polyacrylamide pour suivre l’avancement de la réaction de polymérisation. Lorsque le polyacrylamide dans le tube est complètement durcie, la réaction est complète (~ 10 min).</li>
	<li>Retirez délicatement le peigne et le ruban à l’arrière de la cassette de gel.</li>
</ol>5. préparation des échantillons biologiques pour l’électrophorèse
<ol><li>Préparer les milieux cellulaires conditionné, lysats cellulaires, homogénats tissulaires et les normes MMP comme décrit ailleurs sous des conditions de non réducteur2. Ne pas chauffer les échantillons.</li>
	<li>Par exemple, préparer des milieux cellulaires conditionné comme suit :<ol>
<li>Plaque 40 000 cellules/cm2 cellules dans la plaque de 6 puits dans les milieux de culture pour le sérum fœtal (SVF) 10 %. Incuber les cellules dans une chambre humidifiée (5 % CO2 à 37 ° C) pendant 24 heures et leur permet d’atteindre le confluent de 70 à 80 %. Remarque : Si les cellules n’ont pas atteint la confluence désirée après 24 heures, leur permettre de se développer dans les milieux de culture pour le BF 10 % pendant 24 heures supplémentaires.</li>
		<li>Laver les cellules deux fois avec du PBS et ajouter 2 mL de milieu de culture sans sérum. Incuber les cellules dans une chambre humidifiée (5 % CO2 à 37 ° C) pendant 24 heures supplémentaires.</li>
		<li>À l’aide d’une pipette sérologique, recueillir les milieux conditionnés dans chaque puits. Centrifuger les médias à 1200 tr/min pendant 3 minutes pour enlever les débris cellulaires. Prenez le surnageant et concentré à l’aide d’un 15 mL, 10 kDa poids moléculaire coupure filtre centrifuge. Centrifuger les blocs filtrants à 4 000 x g pendant 15 min dans un rotor oscillant de seau ou 5 000 x g pendant 15 min dans un rotor à angle fixe. Remarque : Cette étape est facultative mais peut augmenter l’intensité des bandes protéolytiques dans les gels de zymographie peptide.</li>
		<li>Transvaser le filtrat concentré dans un tube à centrifuger fraîches 1,5 mL. Échantillons aliquote et magasin à-80 ° C pendant jusqu'à trois cycles de gel-dégel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantifier la teneur en protéines à l’aide d’un test de quantification des protéines standard (p. ex. BCA, analyse de Bradford, etc.).</li>
</ol>6. électrophorèse of Biological Samples in Peptide Zymographie Gels
<ol><li>Dissoudre les échantillons dans un tampon échantillon zymographie classiques (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 25 % de glycérol, 4 % SDS, 0,01 % bleu de bromophénol). Pour les échantillons de cellules et de tissus, ~ 30 µg de protéines totales par puits est recommandé et 50-100 ng de protéines pour les normes MMP.</li>
	<li>Ajouter 400 mL de 1 x Tris-Glycine SDS exécutant le tampon à l’appareil de gel. Charge jusqu'à 35 µL de l’échantillon par puits. Exécuter les exemples à 120 V à 4 ° C pendant 1 h 30 ou jusqu'à ce que les normes de poids moléculaire indiquent que les protéases d’intérêt sont dans le peptide résoudre la couche de gel (qui a une couleur orange visible). Remarque : La plupart des MMPs et leurs variantes entraient dans le cadre de 35 à 100 kDa. Lorsque les normes de poids moléculaire indiquent que ces poids sont dans le peptide résoudre la couche de gel, électrophorèse peut être arrêté. Le même principe peut être appliqué à d’autres classes de protéases avec des poids moléculaires connus. S’il y a un intérêt dans la détection de plusieurs protéases sur un plus large éventail de poids moléculaires, réduire la taille de la couche de gel de résoudre et augmenter la taille de la couche de gel résolution de peptide.</li>
	<li>Après électrophorèse, retirez les gels de la cassette en plastique et lavez les gels trois fois pour chaque 10 min à température ambiante sous agitation modérée dans un tampon de renaturation contenant 2,5 % X-100 de Triton, 1 µM ZnCl2et 5 mM CaCl2 à 50 mM Tris-HCl, pH 7,5.</li>
	<li>Gels de transfert à une pays en développement solution tampon contenant 1 % Triton X-100, 1µm ZnCl2 et 5 mM CaCl2 en 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 pendant 15 min. remplacer avec frais de développement solution tampon et incuber les gels à 37 ° C sous agitation modérée pendant 24 heures , en s’assurant que les gels sont complètement immergés dans la solution.</li>
</ol>7. imagerie du Peptide Zymographie gelées
<ol><li>Après 24 heures, gels d’image à l’aide d’un fluorescent gel scanner/imageur en utilisant les filtres appropriés d’excitation et d’émission. Par exemple, les gels de peptide montrés les résultats représentatifs sont conjugués à la fluorescéine et ont été photographiés à l’aide d’un filtre d’excitation de 488 nm et un filtre d’émission de 521 nm. En utilisant les filtres appropriés pour votre fluorophore maximisera la détection d’activité protéolytique. NOTE : Images peuvent également être prises avec un imageur de gel équipé d’un transilluminateur UV, souvent utilisé pour l’imagerie des gels d’ADN coloré au bromure d’éthidium. Image les gels en utilisant le transilluminateur UV (365 nm) réglage et un filtre d’émission de 590 nm.</li>
	<li>Effectuer une évaluation densitométrique des intensités de bande à l’aide de ImageJ comme décrit ailleurs13.</li>
</ol>

<ol><li>Vandooren, J., Geurts, N., Martens, E., Vanden Steen, P. E., Opdenakker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymography+methods+for+visualizing+hydrolytic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes.</a> Nature Methods. 10 (3), 211-220 (2013).</li>
<li>Toth, M., Fridman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Gelatinases+%28MMP-2+and+MMP-9%29+by+Gelatin+Zymography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Assessment of Gelatinases (MMP-2 and MMP-9) by Gelatin Zymography.</a> Methods in Molecular Medicine. 57, (2001).</li>
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<li>Nagase, H., Fields, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+matrix+metalloproteinase+specificity+studies+using+collagen+sequence-based+synthetic+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Human matrix metalloproteinase specificity studies using collagen sequence-based synthetic peptide.</a> Biopolymers. 40 (4), 399-416 (1996).</li>
<li>Mucha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Type-1+Matrix+Metalloprotease+and+Stromelysin-3+Cleave+More+Efficiently+Synthetic+Substrates+Containing+Unusual+Amino+Acids+in+Their+P1%E2%80%B2+Positions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1′ Positions.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).</li>
<li>Thimon, V., Belghazi, M., Labas, V., Dacheux, J. -L., Gatti, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-+and+two-dimensional+SDS-PAGE+zymography+with+quenched+fluorogenic+substrates+provides+identification+of+biological+fluid+proteases+by+direct+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">One- and two-dimensional SDS-PAGE zymography with quenched fluorogenic substrates provides identification of biological fluid proteases by direct mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 375 (2), 382-384 (2008).</li>
<li>Sun, X., Salih, E., Oppenheim, F. G., Helmerhorst, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+mass+spectrometric+characterization+of+proteases+and+inhibitors+in+human+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics.+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Activity-based mass spectrometric characterization of proteases and inhibitors in human saliva.</a> Proteomics. Clinical Applications. 3 (7), 810-820 (2009).</li>
<li>Yu, W., Woessner, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin-Enhanced+Zymographic+Detection+of+Matrilysin+and+Collagenases%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Heparin-Enhanced Zymographic Detection of Matrilysin and Collagenases.</a> Analytical Biochemistry. 293 (1), 38-42 (2001).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les techniques actuelles de zymographic s’appuient sur l’incorporation des substrats indigènes dans des gels de polyacrylamide pour la détection de la protéolyse. Alors que ces techniques ont rallié la généralisation, elles sont encore limitées dans le nombre des protéases, qu'ils peuvent détecter. Ici, un protocole a été décrite dans les peptides fluorescents, protéase-dégradables sont incorporés dans le polyacrylamide gel de résoudre. À l’aide de couplage covalent une molécule azido-PEG3-maléimide linker permet la sépa...

Zymographie gel est une technique biologique utilisée pour mesurer l’activité protéolytique dans des échantillons biologiques, tels que des fluides corporels ou des milieux de culture de cellule pour1,2,3. Les échantillons sont séparées par leurs poids moléculaires avec électrophorèse par un gel de polyacrylamide embarqué avec un substrat biodégradable. Substrats dégradables communs incluent gélatine, caséine, collagène et élastine, qui ont été utilisés pour mesurer l’activité des métalloprotéinases matricielles (MMP) -1, -2, -3, -7, -8, -9 et -11, en plus d’une variété de cathepsines1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. après électrophorèse, les enzymes sont renaturé et laisse se pour dégrader les protéines dans le gel. En gel traditionnel zymographie, le gel est coloré avec un colorant de la protéine, comme le bleu de Coomassie, et activité de la protéase est détectée comme une perte de signal, c'est-à-dire blanc bandes (dégradation des protéines) sur un fond bleu foncé.
Nous décrivons ici un protocole pour une autre méthode de gel zymographie, dans laquelle le substrat biodégradable est un court, peptide fluorogénique par covalence incorporé dans le gel de polyacrylamide (Figure 1). La substitution de peptides synthétiques comme les substrats dégradables permet la détection d’un plus large éventail de protéases contre zymographie gel traditionnel avec des protéines natives9. Liaison covalente du peptide fluorogène empêche la diffusion de peptide et de migration au cours de l’électrophorèse sur gel, observée avec les précédentes méthodes9,10. De plus, l’utilisation d’un substrat fluorogène permet la détection directe de l’activité de la protéase sans coloration supplémentaire et étapes de coloration. L’objectif général de cette méthode est la détection de l’activité protéase dans des échantillons biologiques via l’incorporation covalente des peptides fluorogéniques dans les gels zymogramme.

<table><tbody><tr><td>Cassettes de gel vides de 1,5 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC2015</td><td></td></tr><tr><td>Peignes de cassette de gel vides de 1,5 mm, 10 puits</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC3510</td><td></td></tr><tr><td>1x Saline tamponnée au phosphate</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-010-049</td><td></td></tr> Solution <tr><td>SDS à 20 %</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td></td></tr><tr><td>3x Tampon d’échantillon de zymographie</td><td>Bio-Rad</td><td>1610764</td><td></td></tr><tr><td>40 % (p/v) Acrylamide/Bis (19:1)</td><td>Ambion</td><td>AM9022</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire à 6 puits</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>087721B</td><td></td></tr><tr><td>Unité de filtration centrifuge Amicon Ultra-2 (10 kDa MWCO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>UFC201024</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Azido-PEG3-Maleimide Kit</td><td>Click Chimie Outils</td><td>AZ107</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP510100</td><td></td></tr><tr><td>Diméthyl Sulfoxyde Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP231</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416P</td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA Kit de dosage des protéines</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>N N N’N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Alimentation de base PowerPac</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide Aiguilles hypodermiques</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826</td><td></td></tr><tr><td>Flacon à fond rond (100 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-873-144</td><td></td></tr><tr><td>Bouchon en caoutchouc septum</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-872-546</td><td></td></tr><tr><td>Seringue stérile à embout glissant (1 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-434</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hydrochlroide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9410 Imageur moléculaire</td><td>GE Amersham</td><td>8149-30-9410</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de zinc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>208086</tr></tbody></table>

détection d’activité de la protéase par zymographie peptides fluorescents

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

Le but de cette méthode est de mesurer l’activité protéolytique des échantillons biologiques complexes. Les échantillons sont séparés par le poids moléculaire en utilisant l’électrophorèse par un gel résolution intégré avec un substrat biodégradable. Cette méthode diffère de zymographie gel traditionnel qu’un peptide fluorogène trempé est par covalence incorporé dans le gel résolution au lieu de protéines pleine longueur, tels que la gélatine ou de la caséine. Utilisation des peptides fluorogène permet une détection directe de l’activité protéolytique sans coloration des étapes supplémentaires. Enzymes dans les échantillons biologiques fendent le peptide fluorogène trempés, résultant en une augmentation de fluorescence. Le signal fluorescent dans les gels est alors photographié avec un scanner de gel fluorescent standard et quantifiées par densitométrie. L’utilisation de peptides comme le substrat biodégradable élargit considérablement les protéases possibles détectables avec les techniques de zymographic.

À l’aide de la méthode décrite ici, deux peptides fluorescents de protéase-dégradables ont été incorporées dans des gels de polyacrylamide : GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (abrégé en QGIW dans tout le texte et les figures) et GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2 C (abrégé en LACW dans tout le texte et les figures). ↓ indique le site de clivage. QGIW est un collagène-j’ai dérivé séquence conçu pour détecter les collagénases cellulaire14. LACW est une séquenc...

Nous présentons ici un protocole détaillé pour une technique mis à jour le zymographic dans lequel les peptides fluorescents sont utilisés comme substrat biodégradable en lieu et place des protéines natives. Électrophorèse d’échantillons biologiques dans zymogrammes de peptides fluorescents permet la détection d’un plus large éventail de protéases que les techniques de zymographic précédente.

Détection d’activité de la protéase par Zymographie peptides fluorescents

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Les techniques zymographiques actuelles détectent un nombre limité de protéases. La zymographie fluorescente de peptide emploie des peptides fluorescents comme substrat dégradable permettant la mesure d’une plus grande gamme de protéases. Le principal avantage de cette méthode est sa conception modulaire.La séquence du peptide fluorescent détermine quelles protéases sont détectées et le peptide fluorescent peut facilement être échangé avec un peptide d’une séquence différente, une capacité à détecter d’autres protéases. Cette technique peut aider à éclairer la conception de peptides’use en tant que relieurs dégradables dans les biomatériaux conçus tels que ceux utilisés pour l’administration de médicaments ou des applications d’ingénierie tissulaire. L’incorporation de ce peptide dans cette technique peut identifier les protéases sécrétées par les tissus qui sont responsables de la dégradation des biomatériaux.La démonstration de cette technique est importante afin de visualiser l’approche multicque unique par rapport à d’autres techniques de zymographie. La démonstration de cette technique sera, Ameya Deshmukh, un étudiant diplômé de mon laboratoire. Pour commencer, préparez une solution de gel de résolution de 10% polyacrylamide telle que décrite dans le tableau un du protocole de texte.Immédiatement avant de verser le gel, ajouter le TEMED et l’APS. Ensuite, remplissez et videz la cassette de gel mini de 1,5 millimètre à mi-chemin avec la solution de gel de résolution. Ajouter une fine couche d’isopropanol au sommet du gel de polyacrylamide pour produire un gel de niveau et prévenir les bulles.Utilisez la solution de polyacrylamide reste pour suivre la progression de la réaction de polymérisation. Lorsque le polyacrylamide dans le tube a complètement solidifié la réaction est complète. Alors que la première couche de gel de résolution est polymérisante, récupérer le kit Azido-PEG3-Maleimide de stockage à 20 degrés Celsius et permettre aux composants d’atteindre la température ambiante.Ensuite, dissoudre les composants de flacon deux dans le fabricant recommandé volume de DMSO. Et vortex pendant 30 secondes pour s’assurer que les liquides sont bien mélangés. Transférer le contenu du flacon un dans un flacon de fond rond propre et sec de 100 millileter qui contient une barre d’agitation.Insérez immédiatement un bouchon septum en caoutchouc avec un diaphragme qui peut être perforé avec une seringue dans la bouche du flacon. Ensuite, insérez deux aiguilles de seringue de calibre 18 dans le diaphragme. Connectez l’une des aiguilles de seringue à un réservoir d’essence inerte et laissez le gaz remplir le flacon du fond rond pendant trois minutes.Ensuite, coupez le gaz inerte et détachez-le de l’aiguille. À l’aide d’une seringue, injecter le contenu complet du flacon deux dans le flacon. Retirer les deux aiguilles et la seringue.Laisser mélanger les composants pendant 30 minutes à température ambiante en remuant. Après cela, retirez le bouchon de septum en caoutchouc et transférez le contenu dans un tube de centrifugeuse propre de cinq millilitres. Une fois que la première couche de gel de résolution a polymérisé verser la couche isopropanol.Pipet un millilitre d’eau déionisée sur le dessus du gel, puis versez l’eau pour rincer le gel. Récupérez le peptide fluorescent fonctionnalisé au thiol de stockage à 80 degrés Celsius. Laissez-le décongeler à température ambiante.Préparez une solution gel 10% résolvant contenant la molécule de liaison Azido-PEG3-Maleimide et le peptide fluorescent tel que décrit dans le tableau un du protocole de texte. Immédiatement avant de verser le gel ajouter le TMED et APS. Ensuite, remplissez la moitié de la partie restante de la cassette de gel avec la solution de gel de résolution peptidique.Ajouter une fine couche d’isopropanol au sommet du gel de polyacrylamide pour produire un gel de niveau et prévenir les bulles. Utilisez la solution de polyacrylamide reste pour suivre la progression de la réaction de polymérisation. Une fois la réaction terminée, verser la couche isopropanol.Pipet un millilitre d’eau déionisée sur le dessus du gel, puis versez l’eau pour rincer le gel. Si vous n’utilisez pas les gels immédiatement, conservez-les en les immergeant dans une boîte en plastique remplie de 100 millilitres de 1x PBS à quatre degrés Celsius. Envelopper la boîte dans du papier d’aluminium pour éviter le photobleaching.Tout d’abord, préparez une solution de gel empilage de 5 % telle qu’elle est décrite dans le tableau un du protocole texte. Immédiatement avant de verser le gel ajouter le TMED et APS. Remplissez le reste de la partie vide de la cassette de gel avec la solution de gel empilage.Insérez rapidement un peigne gel de 1,5 millimètre dans la couche de gel empilant en vous assurant qu’aucune bulle ne reste emprisonnée sous les puits. Utilisez la solution de polyacrylamide reste pour suivre la progression de la réaction de polymérisation. Lorsque la réaction est terminée, retirez doucement le peigne et la bande de l’arrière de la cassette de gel.Pour commencer, dissoudre les échantillons dans le tampon d’échantillon de zymographie conventionnelle. Ajouter 400 millilitres os 1X tris glycène SDS tampon en cours d’exécution à l’appareil de gel. Chargez jusqu’à 35 microlitres d’échantillon par puits.Exécutez les échantillons à 120 volts à quatre degrés Celsius pendant une heure et demie ou jusqu’à ce que les normes de poids moléculaire indiquent que les protéases d’intérêt se trouvent dans la couche de gel résolvant le peptide. Après cela, retirer les gels de la cassette en plastique. Lavez les gels trois fois dans un tampon de re-naturing à température ambiante sous l’agitation douce.À chaque lavage, d’une durée de 10 minutes. Transférer les gels dans une solution tampon en développement pendant 15 minutes. Remplacez ensuite la solution par un tampon frais en développement et incubez à 37 degrés Celsius sous une douce agitation pendant 24 heures.Après cela, utilisez un imageur de scanner de gel fluorescent avec les filtres d’excitation et d’émission appropriés pour l’image des gels. Dans cette étude aux peptides dégradables fluorescents de protéase sont incorporés dans les gels de polyacrylamide. QGIW est une séquence dérivée de collagène conçue pour détecter la collagène cellulaire, tandis que LACW est une séquence qui a été optimisée pour la détection de MMP-14 et MMP-11.L’imagerie fluorescente révèle de nombreuses bandes dans les gels peptidiques LACW, alors qu’une seule bande est observée dans les gels QGIW. Comparés à la zymographie de gélatine, les gels de LACW sont capables de détecter plus de bandes protéolytiques, ce qui démontre la capacité de la zymographie peptidique à détecter un plus large éventail de protéases présentes dans les échantillons biologiques que les méthodes traditionnelles utilisant des substrats indigènes. Les cellules de zymographie peptidique sont ensuite incubées dans un tampon de développement contenant soit GM6001, un inhibiteur du MMP à large spectre, soit E64, un inhibiteur général de la cathepsine.Le traitement des gels peptidiques LACW avec GM6001, diminue l’intensité des bandes. Alors que le traitement par E64 n’a aucun effet discernable. Le traitement des gels peptidiques QGIQ avec GM6001 entraîne une ablation complète des bandes précédemment observées.Alors que e64 n’a aucun effet. La zymographie à la gélatine est effectuée à l’aide de MMP-9 purifié et activé pour comparer la sensibilité de la zymographie peptidique à l’étalon-or actuel. Les gels LACW sont capables de détecter les plus petites concentrations de MMP-9.Les protéases nécessitent des conditions spécifiques pour redesserner et s’activer. Préparez soigneusement les solutions tampons pour vous assurer que la composition et le PH sont corrects. Cette méthode peut être complétée par des techniques existantes pour vérifier l’identité et effectuer une analyse plus approfondie des protéases mesurées.Cela inclut le ballonnement occidental, le PCR en temps réel et la spectrométrie de masse. Soyez prudent lors de la manipulation du polyacrylamide. La solution non variable est considérée comme une neurotoxine puissante et l’équipement de protection individuelle approprié doit toujours être porté lors de sa manipulation.

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Le kit de détection de protéase fluorescent est conçu pour la mesure de l'activité de la protéase à l'aide fluorométrie. Il est également approprié pour la détection de traces de contamination de la protéase. La méthode est basée sur la hydroysis protéolytique d'une formulation exclusive d'un substrat marqué FITC caséine.

L&#39;utilisation du kit de détection de protéase fluorescent pour déterminer l&#39;activité de protéase

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La détermination de la spécificité de la protéase dans les tissus de souris extraits par spectrométrie de masse MALDI-TOF : manipulation PH afin de provoquer des modifications de la spécificité

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