Name: Tests in Vitro pour évaluer la Migration, Invasion et la prolifération de lignées cellulaires immortalisées humaine au premier trimestre trophoblaste (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Découvrez trois tests in vitro pour évaluer la migration, l'invasion et la prolifération des cellules trophoblastiques humaines. Ces méthodes permettent une analyse visuelle et quantitative des facteurs influençant l'invasion trophoblastique.

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Les auteurs remercient Dr Gil Mor pour fournir les cellules Sw.71. Cette recherche a été financée par une bourse de chercheur de McKern Albert à S.W.

1. préparation de la cellule
<ol><li>Maintenir les cellules dans des flacons de T-75 dans les milieux de croissance standard à 37 ° C, 5 % de CO2et 95 % d’humidité. Remarque : Les cellules utilisées dans ces expériences étaient l’immortalisé les cellules Trophoblastiques au premier trimestre des lignes Swan.71 (Sw.71) et DB-8/SVneo9,10. Les cellules Sw.71 ont été gardés en DMEM/F-12 additionné de 10 % inactivés par la chaleur bovine sérum fœtal (SVF), pyruvate de sodium 1,0 mM, 10 mM HEPES, 0,10 mM MEM non essentiels des acides aminés, 100 unités/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine. Les cellules de HTR-8/SVneo ont été maintenus en milieu RPMI-1640 additionnée de 5 % FBS inactivés par la chaleur.</li>
	<li>Laissez les cellules se reproduire avant d’avoir atteint le confluent de 90 à 100 %. À l’aide d’une hotte à flux stérile de culture de tissus, aspirer les médias des cellules fiole et lavage avec 10 mL de stérile 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).</li>
	<li>Aspirer le PBS et ajouter 5 mL de 1 x (0,05 %) la trypsine-EDTA au ballon, en s’assurant que les cellules sont couvertes par la trypsine. Placer la fiole dans l’incubateur de laboratoire maintenue à 37 ° C, 5 % de CO2et 95 % d’humidité jusqu'à ce que toutes les cellules ont détachées du bas du ballon (environ 5-10 min).</li>
	<li>Ajouter 10 mL de milieux de culture pré chauffé dans le ballon pour désactiver la trypsine-EDTA.</li>
</ol>2. si vous grattez Assay
<ol><li>Après l’étape 1.4, semences le nombre adéquat de cellules dans une plaque 24 puits pour atteindre 100 % confluent en 48 h. Remarque : Il est possible d’effectuer le test de gratter avec une variété de mises en page différentes plaques. Le nombre maximal de puits autorisés par l’outil de fabricant de plaie est un format de 96 puits.</li>
	<li>Le lendemain (jour avant dosage zéro), remplacez médias médias libres-rouge de phénol complétées selon les besoins, y compris FBS de dextran-dépouillé inactivés par la chaleur, charbon de bois. Remarque : D’autres études ont recommandé l’utilisation des médias avec une faible concentration de FBS (par exemple, 1 %) pour minimiser la prolifération cellulaire, qui peut être utilisée comme une alternative à ce protocole11.</li>
	<li>Le jour du test de l’éraflure, prétraiter les cellules pendant 30 min en ajoutant le traitement souhaité pour les médias dans chaque puits. Les expériences décrites utilisent véhicule (solution de 1 PBS x) et 100 nM de dexaméthasone dilué dans du PBS de x 1.</li>
	<li>
Pour créer des plaies uniformes, placez stérile 10 pointes de pipette µL sur les broches de l’outil de fabricant de plaie. Abaissez les pointes dans la première rangée de puits et de déplacer la plaque le long de la voie ferrée de la machine à la plaie jusqu'à ce que les pointes de pipette atteint l’autre côté du puits.
	<ol>
<li>Remettez la plaque sur la position de départ, ce qui permet de toucher en permanence le fond de la plaque à maintenir constant enroulé sur le diamètre du puits, les pointes de pipette. Enlever et remplacer les pointes de pipette µL 10 stérile et abaisser les pointes vers la prochaine ligne de puits.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Répétez l’étape 2.4 jusqu'à ce que tous les puits sont rayés. Remarque : Si un outil de fabricant de blessure n’est pas disponible, les blessures peuvent être créés en grattant manuellement au centre du puits avec une pointe de pipette de 10 µL.</li>
	<li>Aspirez soigneusement médias et laver délicatement les cellules deux fois avec la solution 1 PBS x. Après un lavage final, ajouter supplémenté-rouge de phénol libre, dénudée ou médias basse-FBS avec traitement désiré ou véhicule (tel qu’indiqué dans l’étape 2.3). Remarque : HTR-8/SVneo cellules doivent être lavés avec supplémenté rouge de phénol médias, lavage avec 1 x PBS qui provoquerait des cellules à se détacher.</li>
	<li>Placer la plaque 24 puits contenant des puits rayés dans l’imageur automatisé, time-lapse (voir Table des matières) logés dans une étuve de laboratoire maintenue à 37 ° C, 5 % de CO2et 95 % d’humidité. Image de puits à intervalles réguliers comme nécessaire pour permettre aux cellules compléter la cicatrisation (par exemple, toutes les 2 h pendant 72 h).</li>
	<li>Calculer la densité de la plaie et la largeur par le logiciel associé à l’imageur automatisé, time-lapse (voir Table des matières). Pour calculer la variation en pourcentage dans les plaies de taille par rapport à la taille de la plaie de départ, définissez la largeur de la plaie au temps 0 égal à 100 %. Divisez la taille de la plaie dans chaque validant subséquente par la taille de la plaie au temps 0 et multiplier par 100 pour obtenir le pourcentage (Figure 1).</li>
</ol>3. invasion Assay
<ol><li>Étape suivante 1.4, graines, le nombre de cellules en plaques 6 puits afin de permettre les cellules atteignent 90 % confluent dans 48 h. maintenir cellules dans un incubateur de laboratoire égale à 37 ° C, 5 % de CO2et 95 % d’humidité.</li>
	<li>Le lendemain, remplacez médias médias libres-rouge de phénol complétées selon les besoins, y compris FBS de dextran-dépouillé inactivés par la chaleur, charbon de bois. Remarque : Les cellules peuvent être prétraités à cette époque selon le protocole expérimental.</li>
	<li>Pour l’instant, placez la cuvette de la matrice extracellulaire de 10 mg/mL (voir Table des matières) sur glace et laissez-le décongeler dans le réfrigérateur pendant la nuit.</li>
	<li>Le lendemain, test préalable cool invasion fournit en plaçant des plaques 24 puits, culture cellulaire insère, microtubes à centrifuger et pointes de pipette dans le réfrigérateur (4 ° C) pendant au moins 2 h avant de travailler avec la matrice extracellulaire.</li>
	<li>À l’aide de fournitures réfrigérés dans la hotte de culture tissulaire, matrice extracellulaire de 10 mg/mL dilué 1:1 avec les médias de phénol-rouge-libre, exempt de sérum à une concentration finale de 5 mg/mL. Remarque : Toujours garder le stock et la matrice extracellulaire diluée sur la glace. Le ratio de la matrice extracellulaire aux médias peut être réglé selon les propriétés de la lignée cellulaire utilisée dans le test.</li>
	<li>Utilise des conduites réfrigérés dans la hotte de la culture de tissus, ajouter 100 μL de matrice extracellulaire diluée pour les inserts (voir Table des matières) qui ont été placés dans la plaque 24 puits. S’assurer que la matrice est niveau sans les bulles. Placer la plaque 24 puits contenant la matrice-enduit insertions dans l’incubateur à 37 ° C pour permettre la matrice à durcir.</li>
	<li>Pour préparer des cellules pour l’analyse de l’invasion, laver les cellules avec 1 mL de PBS 1 x, aspirer le PBS et ajouter 500 µL de 1 x trypsine-EDTA dans chaque puits. Placer la plaque de 6 puits dans l’incubateur de laboratoire maintenue à 37 ° C, 5 % de CO2et 95 % d’humidité jusqu'à ce que toutes les cellules ont détaché de la partie inférieure de la plaque.</li>
	<li>Une fois que les cellules ont détaché, ajouter 500 µL de phénol-rouge-libre, sans sérum médias dans chaque loge des trypsinisés cellules.</li>
	<li>Transférer 1 000 µL de cellules individuelles pour tubes de microcentrifuge et la centrifuger pendant 5 min à 400 x g à 4 ° C.</li>
	<li>Aspirer les médias et remettre en suspension des cellules dans les médias phénol-rouge-libre, sans sérum (volume dépendra de la concentration des cellules). Cellules de numération utilisant une cellule automatisée counter (voir Table des matières) et régler le volume de suspension cellulaire pour une concentration finale de 5 x 105 cellules / mL. Remarque : Un hémocytomètre et microscope peuvent également servir à compter les cellules.</li>
	<li>Ajouter 600 μL de milieux de culture complète dans les puits de la plaque 24 puits qui sera utilisée pour le dosage de l’invasion. Remarque : Chimioattractants supplémentaires ou traitements peuvent être ajoutés au milieu de croissance complète dans le puits (chambre basse). Les expériences décrites ajouté véhicule (solution de 1 PBS x) ou 100 dexaméthasone nM dilué dans du PBS de x 1 à la chambre basse.</li>
	<li>Place le revêtus insérer dans chaque cupule contenant du milieu de culture complet qui sera utilisé pour le dosage de l’invasion. Puis ajouter 200 μl de cellules sur le dessus de chaque insertion cellule revêtus (chambre haute) pour un total de 1 x 105 cellules. Remarque : Comme témoin négatif pour cet essai, un volume égal de médias phénol-rouge-libre, sans sérum (sans cellules) peut être ajouté à la chambre haute.</li>
	<li>Placer la plaque de 24 puits dans l’incubateur de laboratoire maintenue à 37 ° C, 5 % de CO2et 95 % d’humidité pendant 24 h. Remarque : La période d’incubation de 24 h a été optimisée pour les cellules immortalisées au premier trimestre trophoblaste et encore des tests peuvent être nécessaire pour déterminer la période d’incubation nécessaire dans les autres lignées cellulaires.</li>
	<li>Après incubation pendant la nuit, aspiration des médias restants de la chambre supérieure et inférieure sans déranger la matrice extracellulaire. Ensuite, retirer délicatement la matrice extracellulaire et envahit les cellules de la partie supérieure de l’insert avec un coton-tige, pistonnage autant de fois que nécessaire pour enlever la matrice extracellulaire.</li>
	<li>Lavez chaque insert 3 x avec 1 x PBS, ajout de PBS aux deux chambres supérieures et inférieures du puits. Aspirer les PBS après chaque lavage.</li>
	<li>Fixer les cellules attachés aux inserts en plaçant des insertions dans méthanol glacé 100 % pendant 30 min à 4 ° C. Lavage insère 3 x avec 1 x PBS et supprimer PBS après lavage de la finale. Colorer les cellules attachés aux inserts pendant 10 min avec le violet de gentiane de 0,2 % à 20 % d’éthanol.</li>
	<li>Rincer 3 fois avec de l’eau désionisée et aspirer l’eau désionisée après le lavage final.</li>
	<li>Inserts de séchage à l’air pendant 1 h à température ambiante. À l’aide de forceps et une lame de rasoir, découpez soigneusement la membrane du fond de l’insert et monter sur une lame de verre avec le côté du bas vers le haut. Permettre à des supports de montage sécher à température ambiante.</li>
	<li>Obtenir au moins 4 images uniques des cellules envahies par exemple à l’aide d’un microscope optique avec un objectif 20 x. Compter le nombre total de cellules dans chaque image et régulariser le nombre de cellules d’échantillons de contrôle et de tracer des données (Figure 2).</li>
</ol>4. essai de prolifération
<ol><li>Étape suivante 1.4, compter les cellules trypsinisés du flacon à l’aide d’un compteur de cellules automatisées et des graines en plaques 6 puits à une densité de 2 x 105 cellules par puits dans des milieux de croissance standard.</li>
	<li>Placer les cellules dans un incubateur de laboratoire maintenu à 37 ° C, 5 % de CO2et 95 % d’humidité pendant 4 h ou jusqu'à ce que les cellules ont adhéré.</li>
	<li>Médias de changement au rouge de phénol liberté des médias a complété selon les besoins, y compris FBS de dextran-dépouillé inactivés par la chaleur, charbon de bois et ajouter le traitement souhaité. Les expériences décrites ajouté véhicule (solution de 1 PBS x) ou 100 dexaméthasone nM dilué dans du PBS de x 1. Placer les plaques 6 puits dans une étuve de laboratoire maintenue à 37 ° C, 5 % de CO2et 95 % d’humidité.</li>
	<li>Retirez les supports et les remplacer avec traitement et nouveaux médias toutes les 48 h.</li>
	<li>Après 24, 48 ou 72 h de traitement, laver les cellules avec 1 mL de solution 1 PBS x et ajouter 500 µL de trypsine-EDTA dans chaque puits. Placer la plaque 6 puits en incubateur jusqu'à ce que les cellules ont détaché de la plaque.</li>
	<li>Une fois que les cellules ont détaché de la plaque, ajouter 500 µL des médias libres supplémentés de phénol rouge pour désactiver la trypsine.</li>
	<li>Ajouter 5 µL de cellules trypsinisés à 5 µL de bleu de Trypan dans une éprouvette et la composition de pipetage.</li>
	<li>Compter les cellules de chaque puits en double à l’aide d’un compteur de cellules automatisées.</li>
	<li>Moyenne du nombre de cellules par puits à chaque point dans le temps et l’intrigue en fonction du temps (Figure 3).</li>
</ol>

<ol><li>Ji, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+trophoblast+cell+differentiation%3A+Physiological+regulation+and+pathological+relevance+to+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).</li>
<li>Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+and+placental+development+during+the+first+trimester%3A+implications+for+the+pathophysiology+of+pre-eclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia.</a> Placenta. 21, S25-S30 (2000).</li>
<li>Norwitz, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+implantation+and+placentation%3A+laying+the+blueprint+for+pregnancy+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biomedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Defective implantation and placentation: laying the blueprint for pregnancy complications.</a> Reproductive Biomedicine Online. 13 (4), 591-599 (2006).</li>
<li>Ness, R. B., Sibai, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+and+disparate+components+of+the+pathophysiologies+of+fetal+growth+restriction+and+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+%26+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Shared and disparate components of the pathophysiologies of fetal growth restriction and preeclampsia.</a> American Journal of Obstetrics & Gynecology. 195 (1), 40-49 (2006).</li>
<li>Knöfler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+growth+factors+and+signalling+pathways+controlling+human+trophoblast+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion.</a> The International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 269-280 (2010).</li>
<li>Huber, A. V., Saleh, L., Bauer, S., Husslein, P., Knöfler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF%CE%B1-Mediated+Induction+of+PAI-1+Restricts+Invasion+of+HTR-8%2FSVneo+Trophoblast+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">TNFα-Mediated Induction of PAI-1 Restricts Invasion of HTR-8/SVneo Trophoblast Cells.</a> Placenta. 27 (2), 127-136 (2006).</li>
<li>Nadeem, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+Signals+through+Activin+Receptor-Like+Kinase+7+to+Inhibit+Trophoblast+Migration+and+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Nodal Signals through Activin Receptor-Like Kinase 7 to Inhibit Trophoblast Migration and Invasion.</a> The American Journal of Pathology. 178 (3), 1177-1189 (2011).</li>
<li>Onogi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+inhibits+invasion+of+extravillous+trophoblast+cells+through+reduction+of+matrix+metalloproteinase+%28MMP%29-2+activation+in+the+early+first+trimester+of+human+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Hypoxia inhibits invasion of extravillous trophoblast cells through reduction of matrix metalloproteinase (MMP)-2 activation in the early first trimester of human pregnancy.</a> Placenta. 32 (9), 665-670 (2011).</li>
<li>Straszewski-Chavez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+characterization+of+a+novel+telomerase+immortalized+first+trimester+trophoblast+cell+line%2C+Swan+71%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">The isolation and characterization of a novel telomerase immortalized first trimester trophoblast cell line, Swan 71.</a> Placenta. 30 (11), 939-948 (2009).</li>
<li>Graham, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+first+trimester+human+trophoblast+cells+with+extended+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of first trimester human trophoblast cells with extended lifespan.</a> Experimental Cell Research. 206 (2), 204-211 (1993).</li>
<li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li>
<li>Kisanga, E. P., Tang, Z., Guller, S., Whirledge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+signaling+regulates+cell+invasion+and+migration+in+the+human+first-trimester+trophoblast+cell+line+Sw.+71%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Reproductive+Immunology%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid signaling regulates cell invasion and migration in the human first-trimester trophoblast cell line Sw. 71.</a> American Journal of Reproductive Immunology. , e12974(2018).</li>
<li>Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenol+red+in+tissue+culture+media+is+a+weak+estrogen%3A+implications+concerning+the+study+of+estrogen-responsive+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (8), 2496-2500 (1986).</li>
<li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cell+death+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Measurement of cell death in mammalian cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 12, Unit 12 18 (2004).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Cette procédure s’appuie sur l’utilisation de la migration et l’invasion des essais afin d’inclure le taux de prolifération cellulaire comme un facteur potentiel de différences mesurées dans le mouvement de cellules Trophoblastiques. Utilisés ensemble, ces essais in vitro sont des méthodes simples et efficaces qui peuvent servir à identifier les voies cellulaires qui régulent la migration de trophoblaste. Comme décrit ci-dessus, cellules Trophoblastiques peuvent être traitées avec des hormones, cytokines, facteurs de cro...

Développement placentaire est une étape cruciale dans la mise en place de la grossesse, un impact sur la santé maternelle et fœtale. Toutefois, les bases mécanistiques par lesquels ce processus se produit ne sont pas entièrement comprise. La migration cellulaire est un processus biologique important qui contribue à la mise en place et les fonctions du placenta pendant la grossesse. Après l’implantation du blastocyste, le trophectoderme se différencie en villositaire trophoblastes, qui recouvrent la surface des villosités choriales et sont impliqués dans l’échange de nutriments et de gaz, et de trophoblaste extravilleux (tte), qui migrent à partir des villosités et envahissent la caduque et le système vasculaire maternelle1. Migration de la tte est essentielle pour remodelage des artères spirale maternelle et établissant la circulation utéro pour soutenir la croissance foetale2. Invasion du trophoblaste insuffisants pendant la grossesse se traduit par un développement anormal placentaire et peut-être contribuer à des complications de la grossesse comme la pré-éclampsie, hypertension gravidique, restriction de croissance intra-utérine et prématurité3, 4. Comprendre les facteurs qui affectent la motilité trophoblaste est donc essentiel de déterminer les voies nécessaires à placentation normale.
Migration de trophoblaste est contrôlée par un réseau complexe de molécules, y compris les facteurs de croissance, les cytokines, les hormones et de facteurs angiogéniques5de signalisation. En raison des limitations de l’étude du placenta in vivo, essais in vitro utilisant immortalisé les cellules Trophoblastiques humaines lignes ont été essentielles pour identifier les facteurs qui contribuent à la motilité de trophoblaste. Essais sur zéro et invasion ont été utilisés intensivement pour évaluer quantitativement le rôle des molécules individuelles sur trophoblaste cell migration6,7,8. Cependant, bien qu’utiles en tandem pour étudier comment des changements dans la migration peuvent être causés par des changements dans envahissant de la cellule, ces deux tests ne tiennent pas compte des mécanismes supplémentaires qui peuvent contribuer à des taux altérés de la migration cellulaire. Par exemple, des réductions du taux de prolifération cellulaire peuvent entraîner moins de cellules disponibles à migrer.
Nous décrivons ici les méthodes in vitro quantitatives pour l’évaluation de migration de trophoblaste à l’aide de scratch, prolifération cellulaire et analyses d’invasion cellulaire. Dans l’essai de gratter, une plaie uniforme est créée dans une monocouche de cellules, et la migration des cellules pour combler le vide est mesurée par imagerie automatisée, time-lapse de la taille de la plaie et la densité des cellules au sein de la plaie. Le test de prolifération cellulaire est basé sur le calcul du ratio de cellules à chaque point dans le temps par rapport à une quantité connue de départ des cellules. Dans l’essai d’invasion cellulaire, les cellules sont ensemencées au sommet d’une chambre d’insertion culture cellulaire d’enduit de matrice extracellulaire (p. ex. Transwell), et le nombre de cellules qui envahissent par le biais de la matrice extracellulaire en réponse à la chimio-attractant est compté.
L’essai de scratch est un outil simple et efficace qui peut être utilisé pour déterminer comment les différentes conditions environnementales affectent la migration cellulaire. Les prolifération et invasion épreuves peuvent par la suite être utilisées pour déterminer la contribution de la prolifération cellulaire et son caractère invasif à l’évolution globale de la migration cellulaire. Collectivement, ces tests fournissent des mesures robustes des processus biologiques qui peuvent contribuer à la motilité cellulaire. Deux lignées de cellules immortalisées trophoblaste au premier trimestre ont été utilisées dans les essais décrits, la Swan.71 (Sw.71) et la HTR-8/SVneo9,10. Toutefois, ces tests peuvent également être optimisés pour dans d’autres types de cellules pour identifier les principaux modulateurs de la migration cellulaire et l’invasion.

<table><tbody><tr><td>0,4 % Trypan blue stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>0,5 % Trypsine-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>1,0 M HEPES</td><td>AmericanBio</td><td>AB06021-00100</td><td></td></tr><tr><td>10 mM MEM acides aminés non essentiels</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>100 mM pyruvate de sodium</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de transpuits à 24 puits Corning</td><td></td><td>3422</td><td>Contiennent des filtres en polycarbonate avec un 8 &mu ; </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> Compteur <tr><td>de cellules automatisé Compteur de cellules automatisé</td><td>Thermo Fisher</td> Scientific <td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8310-4</td><td></td></tr><tr><td>La dexaméthasone (Dex ; 1, 4-prégnadiène-9&alpha ;-fluoro-16&alpha ;-méthyl-11&bêta ;, 17, 21-triol-3, 20-dione ; &ge ; 98 % TLC)</td><td>Steraloids</td><td>P0500-000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Ham' s F12</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte 24-well ImageLock Plates</td><td>Essen BioScience</td><td>4365</td><td>Si vous utilisez le système d’imagerie IncuCyte Zoom, ensemencez les cellules sur les plaques IncuCyte ImageLock. Ces plaques ont des marqueurs repères au bas de la plaque qui sont utilisés comme référence pour l’imagerie répétée dans un champ de vision constant.</td></tr><tr><td>Logiciel IncuCyte</td><td>Essen BioScience</td><td>2010A Rev2</td><td></td></tr><tr><td>Système IncuCyte ZOOM</td><td>Essen BioScience</td><td>N/A</td><td>Les images du test Scratch ont été capturées et analysées à l’aide du préréglage " Blessure par égratignures" sur le système IncuCyte ZOOM. D’autres microscopes time-lapse peuvent également être utilisés.</td></tr><tr><td>Matrigel Membrane Matrix</td><td>Becton Dickinson</td><td>356231</td><td>Facteur de croissance réduit, sans rouge de phénol</td></tr><tr><td>Microlames</td><td>VWR International, LLC</td><td>48311-7003</td><td></td></tr><tr><td>Verre de protection de microscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-E</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé Olympus IX71</td><td>Pénicilline Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>(10 000 unités/mL)/streptomycine (10 000 & micro ; g/mL)</td><td>Life Technologies</td><td>151-40-122</td><td></td></tr><tr><td>Sans rouge de phénol DMEM/Ham’s F12</td><td>Life Technologies</td><td>11039-021</td><td></td></tr><tr><td>Outil de fabrication de plaies semi-automatique</td><td>Essen BioScience</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

tests in vitro pour évaluer la migration, invasion et la prolifération de lignées cellulaires immortalisées humaine au premier trimestre trophoblaste

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Mouvement cellulaire est une propriété essentielle de trophoblastes durant le développement placentaire et début de grossesse. Les troubles de la grossesse tels que la restriction de croissance intra-utérine et de la prééclampsie, qui sont associés à l’invasion du trophoblaste inadéquate du système vasculaire maternelle attestent l’importance de la migration correcte de trophoblaste et invasion. Malheureusement, notre compréhension des mécanismes par lequel le placenta se développe de migrer trophoblaste est limitée. Analyse in vitro de la migration cellulaire via le dosage zéro est un outil utile pour identifier les facteurs qui régissent la capacité migratoire de trophoblaste. Toutefois, ce test seul ne définit pas les modifications cellulaires qui peuvent se traduire par la migration des cellules altérées. Ce protocole décrit trois différents essais in vitro utilisés collectivement pour évaluer le mouvement des cellules Trophoblastiques : le test de gratter, le dosage de l’invasion et le test de prolifération. Protocoles décrits ici peuvent également être modifiées pour utilisation dans les autres lignées de cellules afin de quantifier le mouvement cellulaire en réponse à des stimuli. Ces méthodes permettent d’identifier les facteurs individuels qui contribuent à la circulation de cellules et d’effectuer un examen approfondi des mécanismes éventuels changements apparents dans la migration cellulaire, les enquêteurs.

Les lignées de cellules immortalisées humaine au premier trimestre trophoblaste HTR-8/SVneo et Sw.71 ont été utilisées lors de ces expériences pour déterminer le rôle des glucocorticoïdes dans le trophoblaste cell migration12. Les glucocorticoïdes ont été utilisés dans ces expériences qu’elles ont été récemment montrées d’altérer les fonctions de trophoblaste, même si les traitements alternatifs peuvent être utilisé12. Les deux lignées cellu...

Nous présentons ici un protocole très accessible pour évaluer le mouvement cellulaire dans les cellules Trophoblastiques humaines à l’aide de trois essais in vitro : le test de gratter, le dosage d’invasion de transwell et le test de prolifération cellulaire.

Tests in Vitro pour évaluer la Migration, Invasion et la prolifération de lignées cellulaires immortalisées humaine au premier trimestre trophoblaste

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Ces méthodes peuvent être utilisées pour déterminer les facteurs qui influencent l’invasion trophoblaste qui peuvent fournir un aperçu des principaux résultats obstétricaux indésirables. L’avantage de cette technique est qu’elle fournit une analyse visuelle et quantitative de plusieurs facteurs qui peuvent influencer l’invasion des trophoblastes, y compris la prolifération et la migration. Pour commencer l’analyse à gratter, ensemencer le nombre approprié de cellules dans une plaque de 24 puits pour atteindre 100% confluence en 48 heures.Le lendemain, changer les médias en phénol rouge médias libres complétés par la chaleur inactivée charbon de bois dextran dépouillé FBS. Le jour de l’égratignure, ajouter le traitement désiré aux médias dans chaque puits pour prétratre les cellules pendant 30 minutes. Pour créer des plaies uniformes, placez des pointes stériles de pipette de 10 microlitres sur les broches de l’outil de fabricant de plaies.Abaissez les pointes dans la première rangée de puits et déplacez la plaque le long de la voie du fabricant de plaies jusqu’à ce que les pointes de pipette atteignent l’autre côté du puits. Déplacez ensuite la plaque vers la position de départ pour assurer une plaie constante sur le diamètre du puits. Abaissez les pointes dans la rangée suivante de puits et répétez jusqu’à ce que tous les puits soient rayés.Confirmez que l’égratignure couvre la largeur du puits en observant la plaque au microscope. Ensuite, aspirez soigneusement le média et lavez doucement les cellules avec 1x PBS deux fois. Après un lavage final, ajouter le phénol complété rouge dénudé ou faible teneur en FBS avec un traitement désiré.Ensuite, placez la plaque avec les puits rayés dans un imageur de timelapse automatisé logé dans un incubateur qui contient 37 degrés Celsius de température et 5% de dioxyde de carbone à 95% d’humidité atmosphère. Imagez les cellules à intervalles réguliers au besoin pour permettre aux cellules d’achever la cicatrisation des plaies. Pour commencer l’analyse d’invasion, ensemencer le nombre approprié de cellules dans des plaques de six puits dans un incubateur qui maintient une température de 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone à 95% d’humidité atmosphérique.Permettre aux cellules d’atteindre 90% de confluence en 48 heures. Le lendemain, changer les médias en phénol rouge médias libres complétés par la chaleur inactivée charbon de bois dextran dépouillé FBS. Placer un flacon de 10 milligrammes par matrice extracellulaire millilitre dans un réfrigérateur sur la glace et laisser décongeler toute la nuit.Le lendemain, utilisez des pointes de pipette réfrigérées pour diluer 10 milligrammes par millilitre de la matrice extracellulaire avec le phénol rouge libre de sérum médias libres à une concentration finale de cinq milligrammes par millilitre. Ajouter ensuite 100 millilitres de matrice extracellulaire diluée aux inserts réfrigérés qui ont été placés dans la plaque réfrigérée de 24 puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pour permettre à la matrice de durcir.Pour préparer les cellules pour l’analyse d’invasion, laver les cellules avec un millilitre de 1x PBS. Ensuite, aspirez le PBS et ajouter 500 microlitres de 1x Trypsin EDTA à chaque puits. Placez la plaque de six puits dans l’incubateur qui maintient une température de 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans l’atmosphère de 95 % d’humidité jusqu’à ce que toutes les cellules se soient détachées du fond de la plaque.Une fois que les cellules se sont détachées, ajouter 500 microlitres du phénol rouge libre sérum médias libres à chaque puits des cellules trypsinisées. Ensuite, transférez 1000 microlitres de cellules détachées dans un tube de microcentrifugeuse et tournez vers le bas pendant cinq minutes à 400 fois g à quatre degrés Celsius. Ensuite, aspirez les médias et resuspendez les cellules dans le phénol rouge libre sérum médias libres.Comptez les cellules à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé et ajustez le volume de la suspension cellulaire pour une concentration finale de 0,5 million de cellules par millilitre. Ajouter 600 microlitres du média de croissance complet à chaque puits de la plaque de 24 puits et y placer l’insert pré-enduit. Ajoutez ensuite 200 microlitres de cellules au-dessus de chaque insert cellulaire pré-enduit pour un total de 0,1 million de cellules.Placez la plaque de 24 puits dans l’incubateur qui maintient une température de 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone à 95 % d’humidité pendant 24 heures. Après l’incubation pendant la nuit, aspiration du reste des médias des chambres supérieures et inférieures sans perturber la matrice extracellulaire. Retirez ensuite soigneusement la matrice extracellulaire et les cellules non envahies de la partie supérieure des inserts à l’aide d’un coton-tige.Lavez chaque insert trois fois en ajoutant 1x PBS aux chambres supérieures et inférieures du puits. Aspirer PBS après chaque lavage. Pour fixer les cellules attachées aux inserts, placez les inserts dans du méthanol froid à 100 % glacé à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes.Lavez les inserts trois fois avec 1x PBS et retirez PBS après le lavage final. Tacher les cellules attachées aux inserts avec 0,2% de violet cristal dans 20% d’éthanol pendant 10 minutes. Rincer à l’eau déionisée trois fois et aspirer l’eau déionisée après le lavage final.Inserts secs à l’air à température ambiante pendant une heure. Enfin à l’aide de forceps et d’une lame de rasoir, couper soigneusement la membrane inférieure de l’insert et le monter sur une glissière de verre avec le côté inférieur face vers le haut. À l’aide d’un microscope léger dont l’objectif est de 20 X, obtenez au moins quatre images uniques des cellules envahies par échantillon.Pour commencer l’analyse de prolifération, utilisez un compteur de cellules automatisé pour compter les cellules trypsinisées du flacon. Cellules de graine dans des plaques de six puits à une densité de 0,2 million de cellules par puits dans les médias de croissance standard. Placez ensuite les cellules dans l’incubateur qui maintient une température de 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone à 95 % d’humidité pendant quatre heures ou jusqu’à ce que les cellules aient adhéré.Ensuite, changer les médias en phénol rouge médias libres complétés par la chaleur inactivée charbon de bois dextran dépouillé FBS et le traitement désiré. Placez la plaque de six puits dans l’incubateur qui maintient une température de 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone à 95 % d’humidité atmosphérique. Remplacez ensuite les médias par les médias frais complétés par le traitement désiré toutes les 48 heures.Après 24, 48 ou 72 heures de traitement, laver les cellules avec un millilitre de 1x PBS et ajouter 500 microlitres de Trypsin EDTA à chaque puits. Placer une plaque de six puits dans l’incubateur jusqu’à ce que les cellules se soient détachées de la plaque. Une fois que les cellules se sont détachées de la plaque, ajouter 500 microlitres du phénol supplémentaire rouge médias libres pour désactiver trypsine.Enfin, ajouter cinq microlitres des cellules trypsinisées à cinq microlitres de Trypan Blue dans un tube séparé et mélanger par pipetting. Utilisez un compteur cellulaire automatisé pour compter les cellules de chaque puits en double. Immortalisé humain premier trimestre trophoblast Swan.71 cellules ont été traitées pendant zéro, huit, et 18 heures avec le véhicule 1x PBS ou 100 micromolar de la dexaméthasone glucocorticoid synthétique dans l’essai de éraflure. Mesure de la taille de la plaie et de la densité de la plaie dans Swan. Les cellules 71 et HTR-8/SVneo traitées avec un véhicule ou une dex de 100 nanomolaires ont montré que le traitement par dex réduisait le taux de fermeture des plaies, ce qui indique que les glucocorticoïdes pouvaient inhiber la migration cellulaire.Après l’essai d’invasion, le traitement glucocorticoid a réduit l’envahissement cellulaire comme montré par une réduction de 15% du nombre de cygne envahi. 71 cellules HTR-8/SVneo traitées avec 100 nanomolaires dex pendant 24 heures par rapport aux cellules traitées avec le véhicule. Après l’essai de prolifération cellulaire, le traitement glucocorticoïde a réduit la prolifération cellulaire comme indiqué par moins de cygne.71 cellules HTR-8/SVneo traitées avec 100 nanomolaires dex par rapport aux cellules traitées avec le véhicule. Des méthodes pour évaluer la mort cellulaire pourraient être employées en même temps que cette procédure pour déterminer si l’apoptose ou la nécrose contribuent aux fonctions altérées de trophoblaste. Nous avons adopté de façon unique l’utilisation de techniques standard couramment utilisées en biologie du cancer pour l’étude de la fonction trophoblaste.Il n’y a aucun danger associé à ces méthodes. La seule précaution que les téléspectateurs devraient prendre est d’utiliser une technique stérile pour la culture des tissus.

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Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Dans ce protocole, nous décrivons la dissection du placenta de la souris sur la grossesse D10.5, suivie de l'isolement des cellules trophoblastiques en utilisant un gradient de Percoll. Nous avons ensuite démontrer l'utilisation des cellules isolées dans un essai invasion matrigel.

Isolement des cellules trophoblastiques primaires de souris et le test invasion trophoblastique

Traditionnel, en deux dimensions techniques de culture cellulaire entraînent souvent des caractéristiques modifiées par rapport aux marqueurs de différenciation, de cytokines et de facteurs de croissance. Culture cellulaire en trois dimensions dans le système de culture cellulaire en rotation (CRCT) rétablit l'expression de plusieurs de ces facteurs comme montré ici avec une lignée de cellules trophoblastiques extravilleux.

Rotation systèmes de culture cellulaire de la culture de cellules humaines: les cellules du trophoblaste humain comme modèle

Couramment utilisés, des méthodes très accessibles pour examiner la migration cellulaire et l'invasion in vitro sont décrits. La première méthode est la fermeture de la plaie dosage de cellules qui mesure la motilité cellulaire. La deuxième méthode est la migration et l'invasion essai transwell qui évalue la capacité chimiotactique et invasif des cellules.

Dans la migration cellulaire in vitro et Invasion dosages

Ce protocole décrit un procédé pour transfecter efficacement ARNsi dans les cytotrophoblastes villeux humaines fraîchement isolées en utilisant la microporation et l'identification des complexes ADN-protéine dans ces cellules. Les cellules transfectées peuvent être contrôlées par Western Blot et des analyses EMSA pendant la période de culture de 4 jours.

siRNA Transfection et EMSA Analyses sur fraîchement isolés villosités cytotrophoblastes humaines

Ce manuscrit présente un modèle in vitro unique de cellules cytotrophoblastes villositaires humaines immunopurifiées cultivées sous hypoxie/réoxygénation. Ce modèle est adapté pour étudier les effets protecteurs de traitements prometteurs, tels que la mélatonine, sur les complications de la grossesse associées à une augmentation du stress oxydatif et à une altération de la fonction placentaire.

Human Trophoblast primaire Culture cellulaire de modèle pour étudier les effets protecteurs de la mélatonine contre l&#39;hypoxie / perturbation induite par la réoxygénation-

Ici, nous présentons un protocole pour la conversion directe de fibroblastes embryonnaires murins en cellules souches trophoblastiques pleinement fonctionnelles et stables par surexpression de dix jours de Tfap2c, Gata3, Eomes et Ets2.

Protocole pour la conversion directe des fibroblastes embryonnaires murins en trophoblaste cellules souches

Ici, nous présentons un protocole pour générer efficacement des cellules trophoblastiques humaines à partir de cellules souches pluripotentes humaines en utilisant la protéine morphogénique osseuse 4 et des inhibiteurs des voies Activin/Nodal. Cette méthode est adaptée à la différenciation efficace des cellules souches pluripotentes humaines et peut générer de grandes quantités de cellules pour la manipulation génétique.

In Vitro Différenciation des cellules souches pluripotentes humaines en cellules trophoblastiques

Présenté ici est un protocole d’échantillonnage de tissus humains de villosités placentaires suivie d’isolement de cytotrophoblastes pour culture de cellules primaires. Traitement des trophoblastes avec TNFα récapitule l’inflammation dans l’environnement intra-utérin obèse et facilite la découverte de cibles moléculaires réglée par l’inflammation dans les placentas avec l’obésité maternelle.

Un modèle trophoblastiques humaines primaires pour étudier l’effet de l’Inflammation associées à l’obésité maternelle sur la réglementation de l’autophagie dans le Placenta

Ici, nous décrivons une méthode pour réchauffer les blastocystes humains vitrifiés, les cultiver à travers la période d’implantation in vitro, les digérer en cellules individuelles et recueillir les cellules trophoblastiques précoces pour une étude plus approfondie.

Collection à cellule unique de cellules trophoblastiques dans les embryons humains de stade de péri-implantation

Le protocole actuel permet de récupérer des structures tubulaires formées dans l’essai classique d’angiogenèse-formation de tubes in vitro où les cellules, telles que les cellules trophoblastiques, s’organisent en structures capillaires sur une couche de matrice de membrane basale extracellulaire. Les structures récupérées sont utilisées pour l’isolement de l’ARN et des protéines pour diverses analyses biochimiques.

Récupération de cellules trophoblastiques à partir d’un test de formation de tube d’angiogenèse pour l’analyse de l’expression des marqueurs de différenciation

Ce protocole permet la purification, la caractérisation et la culture des trophoblastes extravilleux primaires HLA-G+ (EVT) à partir de la base de la déduite basale et de la membrane chorionique des placentas humains à terme. Les cultures primaires d’EVT maintiennent leur viabilité pendant 96 heures, permettant la coculture avec des cellules immunitaires maternelles correspondantes à l’échantillon et l’analyse cytométrique et moléculaire de leurs interactions en flux subséquente.

Purification des trophoblastes extravilleux HLA-G+ à partir de tissus placentaires humains pour le phénotypage et l’analyse fonctionnelle

Découvrez trois tests in vitro pour évaluer la migration, l'invasion et la prolifération des cellules trophoblastiques humaines. Ces méthodes permettent une analyse visuelle et quantitative des facteurs influençant l'invasion trophoblastique.

Tests in Vitro pour évaluer la Migration, Invasion et la prolifération de lignées cellulaires immortalisées humaine au premier trimestre trophoblaste (Vidéo) | JoVE Journal

Tests in Vitro pour évaluer la Migration, Invasion et la prolifération de lignées cellulaires immortalisées humaine au premier trimestre trophoblaste

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