Purification et analyse d'un anticorps monoclonal à partir de cellules ovaires de hamster chinois à l'aide d'un système automatisé de microbioréacteur

Ce protocole traite de l’analyse d’échantillons limités obtenus à partir de microbioréacteurs pour extraire des informations vitales sur les attributs de qualité critique des produits. Un autre avantage de ces techniques est qu’elles utilisent un minimum de temps d’analyse pour déterminer les attributs clés qui dictent les paramètres de qualité du produit manufacturé. David Powers, Talia Faison et Phillip Angart, chercheurs de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure.

Commencez par ouvrir le logiciel attaché au système de purification et en plaçant des tubes coniques de 15 millilitres pour recueillir l’élitisme purifié de l’anticorps et les tubes coniques de 50 millilitres pour recueillir le débit pendant le lavage à haute teneur en sel dans le collecteur de fractions. Ensuite, ajouter 0,22 micromètre pore filtré fluide de culture cellulaire récoltée à une seringue vide de 12 millilitres avec une buse plafonnée. Après avoir enlevé le bouchon, insérez la buse de seringue dans le port d’injection manuelle du système de purification.

Tordez la seringue pour la serrer en place et déprimez le piston jusqu’à ce que tout le volume de l’échantillon ait été injecté et soit visible dans la boucle d’échantillon de 10 millilitres de grand volume ci-joint. Sélectionnez la méthode enregistrée et cliquez sur Exécuter lorsqu’il est invité par le logiciel de l’instrument. Lorsque tous les anticorps ont été échappés, neutralisez immédiatement la protéine purifiée avec une base de tris molaire à un pH d’environ 5,5.

Pour concentrer l’anticorps purifié par centrifugation, placez 100 filtres kilodaltons dans des tubes de collecte de filtrate. Laver les filtres avec 500 microlitres d’eau distillée double, puis centrifugeuse. Répéter le lavage du filtre deux fois.

Après le deuxième lavage, jeter le filtrate et transférer les filtres rincés dans de nouveaux tubes de centrifugeuse. Ensuite, ajoutez 500 microlitres d’échantillon à chaque filtre pour la centrifugation. À la fin de la vrille, inverser le filtre dans un nouveau tube de collecte pour obtenir l’échantillon concentré avec une centrifugation finale.

Pour l’étiquetage et l’isolement n-glycan, diluer 7,5 microlitres de chaque échantillon concentré d’anticorps. Avec 15,3 microlitres de spectrométrie de masse chromatographie liquide ou de l’eau de qualité LCMS dans des tubes d’un millilitre du kit, et dénaturer les anticorps avec six microlitres d’une solution de 5% d’un surfactant favorable aux enzymes et à la spectrométrie de masse à 90 degrés Celsius pendant trois minutes. À la fin de la dénaturation, laisser refroidir les échantillons à température ambiante pendant trois minutes avant d’ajouter 1,2 microlitre de peptide N-glycosidase F pour une incubation de cinq minutes à 50 degrés Celsius.

Après avoir refroidi les échantillons pendant trois minutes à température ambiante, étiqueter les échantillons de 12 microlitres de téter fluorescent reagent dissous dans du diméthylformamide anhydre pendant cinq minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, diluer le mélange n-glycan étiqueté avec 358 microlitres d’acétyltrile et placer une plaque de chromatographie d’interaction hydrophilique dans un collecteur sous vide avec des cales et des bacs à déchets. Conditionner les puits avec 200 microlitres d’eau avec le vide ajusté à 10 à 15 kilopascals pour s’assurer que le liquide prendra 15 à 30 secondes pour passer à travers la résine chromatographie d’interaction hydrophilique.

Equilibrer les puits avec 200 microlitres de 85% d’acétyonitrile pendant 15 à 30 secondes avant de charger 400 microlitres de chaque mélange de glycan étiqueté à chaque puits, en appliquant le vide après chaque nouveau liquide est ajouté. Lorsque tous les échantillons ont été ajoutés, lavez la résine deux fois avec 600 microlitres d’acide 1% formic et 90% d’acétylonitrile par lavage et remplacez le bac à déchets par des tubes de collecte de 600 microlitres. Puis échapper aux N-glycans étiquetés avec trois volumes de 30 microlitres de tampon d’élitution spectrométrie et diluer les dilutions de piscine avec 310 microlitres de diméthylformamide dans l’acénitonitrile échantillonné eluent.

Pour analyser les échantillons d’élitution N-glycan étiquetés sur un système de chromatographie liquide ultraperformance couplé à un détecteur de fluorescence et à un quadruple temps de spectromètre de masse de vol, utilisez un format de munitions millimolaires et une acéonitrile de qualité LCMS à 100 % pour les phases mobiles. Réglez le débit initial à 0,4 millilitres par minute, le gradient LC offrant un format ammonium croissant pendant la phase d’élitution. Réglez le détecteur de fluorescence pour mesurer une excitation de 265 nanomètres et une émission de 425 nanomètres avec un taux d’échantillonnage de deux hertz.

Réglez le quadruple temps de vol vers le mode de sensibilité aux ion ss1 positif avec une plage de masse de 100 à 2 000 Dalton, un temps d’analyse de 0,25 seconde et une acquisition de données continuum. Chargez ensuite les échantillons dans l’échantillonneur automatique réglé à 10 degrés Celsius et exécutez la méthode chargée. Pour désaltrer un échantillon en vue de l’analyse de la variante de charge, enclenchez le bouchon inférieur d’une colonne de desalting de 0,5 millilitre, desserrez le bouchon supérieur et placez la colonne de desalting dans un tube de centrifugeuse de 1,7 millilitre.

Transférez la nouvelle colonne dans un nouveau tube de microcentrifugeuse et ajoutez 80 microlitres d’une solution d’anticorps de 3,5 milligrammes par millilitre au sommet de la colonne. Alignez la colonne sur l’orientation d’origine et centrifugez la colonne. Puis jeter la colonne de désaltage et bien mélanger l’échantillon concentré.

Diluer l’échantillon à une concentration de deux milligrammes par millilitre dans 25 microlitres d’eau ultrapure dans un seul puits d’une plaque de 96 puits et ajouter cinq microlitres de tampon d’étiquetage et cinq microlitres de étiqueteur d’étiquetage au puits. Après une incubation de 10 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière, mélanger 60 microlitres d’eau de qualité réaugeuse avec l’échantillon et couvrir la plaque d’un joint de plaque pour centrifugation. Pour préparer la puce de la variante de charge, retirez la solution de stockage et lavez les puits un, trois, quatre, sept, huit et dix avec de l’eau.

Remplacez l’eau par un tampon de fonctionnement pH 7.2 et ajoutez 750 microlitres de tampon en cours d’exécution au tube tampon. Appuyez sur Déchargez la plaque sur l’interface utilisateur de l’instrument et retirez le joint de la plaque de 96 puits. Insérez la plaque et le tube tampon dans les endroits indiqués sur le plateau d’échantillonnage GX2 et appuyez sur la plaque de chargement.

Placez la puce dans la chambre à puce, fermez le couvercle de la chambre à puce, sélectionnez l’analyse de la variante de charge protéique HT lorsqu’elle est invitée, et cliquez sur Exécuter. La purification de l’échantillon de culture cellulaire récoltée à partir du bioréacteur microscale automatisé par chromatographie liquide protéique rapide permet de caractériser les attributs de qualité critiques des protéines purifiées par diverses méthodes analytiques en aval, comme démontré. Les données n-glycan des anticorps monoclonaux chinois produits par hamster traités par spectrométrie de masse devraient sembler semblables à ces chromatogrammes représentatifs.

Chromatographie d’exclusion de taille la diffusion de lumière à angle multiple peut être utilisée pour évaluer le profil d’agrégation et le poids moléculaire de l’anticorps. La petite quantité d’échantillon et l’importance de l’agrégation sont des attributs de qualité critiques pour faire de cette technique un outil d’analyse complémentaire très précieux pour le système automatisé de microbioréacteurs. Le résultat de l’électrophorése de zone micro capillaire est un électrophétogramme et peut être utilisé pour montrer le profil de la variante de charge pour un anticorps monoclonal, une signature unique pour la protéine étudiée qui est très sensible au pH d’exploitation.

La consommation d’acides aminés peut également être surveillée pour déterminer si l’épuisement provoque des changements dans les attributs de qualité critiques de l’anticorps. Il est important d’assurer une purification adéquate et efficace du produit manufacturé, car les étapes analytiques ne peuvent être effectuées qu’avec une protéine correctement purifiée. Le produit peut également faire l’objet de tests de cartographie et de stabilité du peptide.

Mais une fois que la protéine a été utilisée pour une méthode de caractérisation, elle ne peut généralement pas être utilisée pour une autre. Ces techniques permettent d’analyser les produits produits à partir de plates-formes de dépistage du biotraitement à faible volume et à haut débit afin de comprendre l’influence des paramètres de biotraitement sur la qualité du produit. Certaines de ces techniques utilisent de l’acide perchlorique concentré, de l’acide formique, du N-diméthylformamide, qui sont tous dangereux et doivent être manipulés avec soin tout en portant l’équipement de protection approprié.