Utilisant le protozoaire Paramecium caudatum comme vecteur d’Infections d’origine alimentaire chez les larves de poisson zèbre

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la microbiologie sur la dynamique de la colonisation et l’infection par les micro-organismes dans le tractus gastro-intestinal. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est plus représentative des infections d’origine alimentaire chez l’homme et qu’elle réduit les lésions tissulaires potentielles chez les poissons par rapport au gavage oral. La démonstration visuelle de cette méthode est critique car les étapes de lavage peuvent être difficiles à exécuter en raison de la nature très motile de la paramécie.

À partir d’une culture vivante, ajoutez un millilitre de culture paramécium et un millilitre d’une culture e-coli MG1655 à un flacon de culture tissulaire de dix millilitres contenant huit millilitres de milieu E3. Faites tourbillonner légèrement le flacon avant de le placer à 22 degrés Celsius en passant un millilitre de la co-culture dans un nouveau flacon de culture tissulaire de dix millilitres contenant neuf millilitres de milieu E3 frais, complété par 108 unités de formation de colonies par millilitre d’e-coli MG1655, toutes les deux semaines. Pour déterminer la demi-vie bactérienne dans un paramecium compter le nombre de paramécie à partir d’une densité optique de 600 bactéries paramécie co-culture et ajouter un aliquot de 50 microlitres de supernatant à un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre toutes les heures pendant six heures.

Ajouter 950 microlitres d’un surfactant non ionique d’un pour cent dans PBS aux tubes. Et lyse la paramécie dans chaque échantillon avec une minute de vortex, puis faire une dilutions sur dix de chaque échantillon dans PBS stérile. Et plaquez 100 microlitres de chaque dilution sur des plaques sélectives pour une incubation de 16 heures à 37 degrés Celsius.

Le lendemain, ne comptez que les colonies individuelles isolées et distinctes pour déterminer le nombre de colonies bactériennes dans la plaque. Et identifier une plaque avec une dilution qui donne 30-300 unités de formation de colonies. La veille de l’infection, recueillir un volume de bactéries à partir d’une densité optique de 600 cultures par traitement par centrifugation.

Et re-suspendre les granulés dans un millilitre de E3 moyen par tube. Ensuite, ajoutez un microlitre d’une tache bactérienne appropriée à chaque suspension bactérienne. Et protéger les tubes photo blanchissement avec du papier d’aluminium.

Avant d’incuber les échantillons de bactéries avec rotation de bout en bout pendant 15 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, laver les bactéries deux fois dans un grand volume de milieu E3 pour enlever l’excès de colorant. Et re-suspendre les granulés dans un millilitre de milieu E3 frais par tube.

Ajouter ensuite un millilitre de suspension bactérienne à chacun des deux flacons de paramécie fraîche par condition pendant une incubation de deux heures à température ambiante. Tirez le contenu des deux flacons par condition dans des tubes coniques individuels de 50 millilitres. Et pelleter les échantillons par centrifugation.

À l’aide d’une pipette stériologique, remplacer environ dix millilitres du supernatant E3 dans chaque tube par dix millilitres de milieu E3 frais pour 3 lavages par centrifugation. Après le dernier lavage, retirer environ dix millilitres des supernatants E3, en prenant soin de ne pas perturber les granulés, et de suspendre à nouveau les granulés dans les dix millilitres restants du milieu E3. Transférer 500 microlitres de chaque suspension dans des tubes individuels de microcenrifugeuse de 1,5 millilitre et granuler la paramécie par centrifugation.

Jetez 400 microlitres des supernatants, et ajoutez 20 microlitres de solution de formaldéhyde de 36,5 pour cent aux 100 microlitres restants de paramecia avec pipetting doux. Après cinq minutes à température ambiante, mesurer le volume total réel dans chaque tube par pipette avant de compter le nombre de paramécie morte par millilitre. Pour l’infection d’origine alimentaire du poisson zèbre, diluer les échantillons de paramécie à deux fois dix à cinq paramécie par millilitre de concentration moyenne E3.

Et ajouter 3 millilitres de chaque culture paramecia à un puits d’une plaque de 6 puits par condition. Ensuite, transférez dix poissons zèbres anesthésiés à chaque puits dans un volume minimal de liquide. Et incuber les co-cultures pendant deux heures à 30 degrés Celsius dans un incubateur diurne dans des conditions de lumière du jour.

Pour déterminer le taux de proies, visualisez le poisson zèbre nourri sous un microscope stéréo tout en acquérant des séquences vidéo de la capture des proies. La capture des proies se caractérise par la frappe d’un poisson zèbre vers la proie. Chaque frappe est estimée à un événement de capture de proies.

À la fin de l’incubation, laver le poisson zèbre dans 5 puits différents contenant 3 millilitres d’E3 frais moyen complété par 100 milligrammes par litre de tricaine par puits. Et intégrer chaque poisson zèbre dans 3 millilitres de 1 pour cent d’agarose à faible fond dans une plaque noire bien nanti six puits. Lorsque tous les poissons ont été incorporés, placez la plaque sous un microscope stéréo et utilisez une pointe de chargement de gel coupé pour s’assurer que les têtes sont sur la gauche et les queues sont sur la droite dans chaque champ d’observation.

Attendez 5 minutes pour que l’agarose se mante, puis superposez le poisson incorporé avec un milieu E3 frais complété par de la tricaine, et imagez le poisson zèbre sur un microscope fluorescent pour évaluer l’évolution des infections bactériennes. Pour l’e-coli pathogène, la densité bactérienne initiale est de 790 bactéries par paramécium, et les bactéries sont dégradées dans les vacuoles de chaque atome coupé paramécium avec une demi-vie d’environ 2,3 heures. La proie s’accompagne d’un comportement frappant caractéristique, et la détermination du taux de proie est basée sur l’hypothèse que chaque frappe conduit à l’internalisation de 1 paramécium.

Après la digestion, les bactéries libres passent de l’onégie au milieu et à l’intestin postérieur, où elles sont détectées environ 1 à 2 heures après le début de la proie. S-enterica, par exemple, se localise principalement dans les muqueuses intestinales avec une invasion épithéliale conduisant à l’infiltration de neutrophiles dans l’épithélium. N’oubliez pas que le travail avec certains types de bactéries peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port de l’équipement de protection individuelle approprié doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.