Un système d’Induction de stomates groupées par traitement de Immersion de Solution de sucre chez les plantules de Arabidopsis thaliana
15 février 2019
Ce protocole vise à démontrer comment induire des stomates en cluster dans les cotylédons des plantules de Arabidopsis thaliana en traitement d’immersion avec une solution moyenne contenant du sucre et observer des structures intracellulaires tels que les chloroplastes et les microtubules dans les cellules stomatiques en cluster à l’aide de confocal laser microscopie.
Cette méthode a répondu à une question clé de la biologie du développement végétaux. C’est-à-dire, quelle est l’importance de la distribution spatiale des stomates? Notre système d’induction pour les stomates groupées utilisant la solution de saccharose est assez facile et directement applicable aux lignées transgéniques ou mutantes d’Arabidopsis thaliana.
Pour commencer, ajouter 1,1 gramme de sels moyens Murashige-Skoog et 15 grammes de saccharose à un bécher. Ajouter 490 millilitres d’eau distillée au bécher et mélanger avec la barre de remue-ménage. Utilisez de l’hydroxyde de potassium pour ajuster le pH à 5,8.
Ensuite, diluer la solution avec 500 millilitres d’eau distillée et transférer la solution diluée dans une bouteille moyenne. Après cela, autoclave la solution. Préparez la solution de stérilisation selon le protocole texte.
Ensuite, en travaillant dans des conditions aseptiques, placez environ 50 graines transgéniques d’A.thaliana portant un marqueur fluorescent dans un tube de 1,5 millilitre. Ajouter ensuite un millilitre de 70% d’éthanol au tube et mélanger en inversant le tube cinq fois. Après avoir laissé couler les graines au fond du tube, retirer délicatement l’éthanol à l’aide d’une micropipette.
Ajouter un millilitre de solution de stérilisation aux graines et inverser le tube cinq fois pour mélanger. Retirer délicatement la solution de stérilisation des graines à l’aide d’une micropipette. Ajouter ensuite un millilitre d’eau stérile.
Ajouter 1,5 millilitres de la solution Murashige-Skoog à chaque puits d’une plaque de puits de 24 puits. Ajouter ensuite deux graines stérilisées à chaque puits. À l’aide de deux couches de parafilm, collez le couvercle à la plaque.
Ensuite, transférez la plaque dans une chambre de croissance pour l’incuber pendant 14 jours. Tout d’abord, transférez 30 microlitres de solution Murashige-Skoog de la plaque de puits 24 au centre d’une toboggan en verre. À l’aide de ciseaux disséquants, retirer le cotyledon d’un semis vieux de 14 jours.
Flottez le cotyledon avec le côté observation face vers le haut sur la chute de la solution Murashige-Skoog. Préparez le cotyledon selon les méthodes précédemment décrites dans le Journal of Visualized Experiments. Placez le spécimen sur la scène d’un microscope laser confocal.
Enfin, utilisez l’éclairage du champ lumineux pour sélectionner les cellules de garde groupées pour l’observation. Dans ce protocole, l’amas stomatal a été induit dans les semis d’A.thaliana. Les cellules de garde groupées cultivées dans le saccharose contenant des chloroplastes plus gros que les cellules de garde cultivées dans des conditions sans saccharose.
L’agrandissement des chloroplastes a été confirmé avec un marqueur stroma chloroplaste et des autofluorescents de chlorophylle, suggérant que le traitement de saccharose ait eu comme conséquence l’accumulation de grain d’amidon dans les chloroplastes. En outre, l’observation confocale de la baignoire-6 de GFP a indiqué que les microtubules corticals étaient radialement orientés dans les cellules sucrose-traitées, juste comme dans les cellules de garde saccharose-libres. En fait, nous avons découvert cette méthode par accident.
Après la découverte, nous avons examiné la réponse environnementale des stomates groupées. Nous croyons que notre système pourrait aider à examiner l’importance de la distribution des stomates.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Ce protocole décrit comment induire la formation de stomates groupés dans les cotylédons de jeunes plants d'Arabidopsis thaliana à l'aide d'un milieu contenant du sucre. Il explique également l'observation de structures intracellulaires telles que les chloroplastes et les microtubules dans les cellules de garde par microscopie confocale à laser.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie du développement des plantes
- Fonction stomatique
- Techniques de microscopie
Contexte
- Les stomates jouent un rôle crucial dans les échanges gazeux et la régulation hydrique des plantes.
- La distribution spatiale des stomates influence la physiologie et le développement des plantes.
- Arabidopsis thaliana est un organisme modèle pour l'étude de la biologie végétale.
- La microscopie confocale à laser permet une observation détaillée des structures cellulaires.
Objectif de l'étude
- Induire la formation de stomates en grappes chez les plantules d'Arabidopsis thaliana.
- Étudier les structures intracellulaires des cellules gardes.
- Fournir une méthode applicable à des lignées transgéniques ou mutantes.
Méthodes utilisées
- Préparation d'un milieu contenant du sucre à l'aide de sels de Murashige-Skoog et de saccharose.
- Ajustement du pH à 5,8 à l'aide d'hydroxyde de potassium.
- Traitement par immersion des plantules dans le milieu préparé.
- Observation des cellules de garde par microscopie confocale à laser.
Résultats principaux
- Induction réussie de stomates groupés dans les cotylédons.
- Visualisation des chloroplastes et des microtubules dans les cellules gardiennes.
- Applicabilité démontrée à diverses lignées d'Arabidopsis.
- Fourni des informations sur la distribution spatiale des stomates.
Conclusions
- La méthode est efficace pour l'étude du développement stomatique.
- Elle améliore la compréhension de la fonction stomatique chez les plantes.
- De futures recherches pourront s'appuyer sur ce protocole afin d'obtenir des connaissances supplémentaires.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La compréhension de la distribution spatiale des stomates alimente les modèles prédictifs d'efficacité de l'utilisation de l'eau par les plantes et de leur capacité photosynthétique, ce qui est pertinent pour l'optimisation du rendement des cultures et la résilience au stress en biotechnologie agricole. Ce système d'induction permet une analyse mécanistique de la biologie des cellules gardes sans modification génétique, soutenant ainsi la validation de cibles dans les voies de signalisation végétale. La méthode offre une plateforme reproductible et évolutive pour évaluer les effets de composés sur le dessin et la fonction stomatiques dans les circuits de découverte.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'interroger les mécanismes de mise en place spatiale lors du développement des stomates afin de valider des cibles dans les voies de signalisation végétale.
- Valeur opérationnelle : Fournit un système non génétique, inducible chimiquement, applicable à des lignées transgéniques ou mutantes, pour la réduction des risques associés aux cibles.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des paramètres phénotypiques quantifiables (stomates groupés, agrandissement des chloroplastes) pour le criblage à haut débit de composés bioactifs.
- Valeur opérationnelle : Utilise un milieu MS standardisé avec du saccharose et des lectures en microscopie confocale afin d'assurer la reproductibilité du test entre différents laboratoires.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Établit un lien entre le regroupement des stomates et des biomarqueurs intracellulaires (taille des chloroplastes, orientation des microtubules) pour une détection mécanistique des risques dans les études de réponse des plantes au stress.
- Valeur opérationnelle : Permet une continuité allant de la découverte de gènes/cibles à la validation phénotypique dans des systèmes pertinents pour les maladies.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre aux flux de travail de la phase précoce de découverte, où le criblage phénotypique et la validation de cibles précèdent l'identification de composés candidats, notamment dans les filières de développement de produits agrochimiques et de caractères végétaux.
- Biologie de la découverte : Permet de tester des hypothèses sur l'importance du fractionnement stomatique grâce à un regroupement inductible sans modification génétique.
- Criblage : Permet de mettre en place des systèmes prêts à l'essai avec des phénotypes quantifiables des cellules gardiennes pour le criblage de bibliothèques de composés.
- Analytique : Fournit des lectures quantitatives en microscopie confocale (taille des chloroplastes, orientation des microtubules) afin de comparer les effets des traitements.
- Recherche translationnelle : Relie les observations intracellulaires à la fonction stomatique pour la modélisation prédictive en réponse au stress.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place une plateforme d'induction réutilisable, applicable à diverses lignées d'Arabidopsis mutantes et transgéniques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive dans la validation des cibles grâce à la réduction du risque phénotypique des mécanismes de disposition des stomates.
- Valeur opérationnelle : Normalisation par l'utilisation d'un milieu MS-saccharose défini et le réglage du pH, assurant la reproductibilité.
- Valeur stratégique : Permet de prendre dès le départ des décisions d'orientation (suite ou arrêt) concernant les composés affectant le développement stomatique, réduisant ainsi le risque d'échec en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Facilite la priorisation ajustée au risque des cibles fondée sur la validation phénotypique dans des systèmes de stomates groupés.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture de tissus végétaux, en technique stérile et en microscopie confocale.
- Dépend de l'accès à un autoclave, à des chambres de croissance et à des microscopes à balayage laser.
- Exige une standardisation de la stérilisation des graines et de la préparation du milieu contenant du saccharose entre les équipes.
- L'adaptation à d'autres espèces ou types de tissus peut nécessiter une optimisation de la concentration en saccharose et de la durée d'exposition.
- Limité aux phénotypes observables dans les cotylédons ; l'application à des tests sur la plante entière pourrait nécessiter une validation supplémentaire.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
0:04
Title
0:31
Preparation of 3% Sucrose Containing 1/2 Murashige-Skoog Medium Solution
1:12
Induction of Clustered Stomata by Sucrose-containing Medium Solution Immersion Treatment
2:30
Microscopic Observation of Clustered Stomata
3:15
Stomata Clustering Induced in A. thaliana Seedlings
4:06
Conclusion
