Name: ניתוח של קיפול חלבונים, תחבורה, והשפלה בתאים חיים על ידי הדופק רדיואקטיבי צייס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: למדו את שיטת הדופק-רדיפה הרדיואקטיבית לניתוח קיפול חלבונים, תחבורה והשפלה בתאים חיים באמצעות מתיונין וציסטאין מסומנים ב-35S. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר דינמיקת ביוסינתזת חלבונים בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים תודה לכל החברים של המעבדה Braakman, מעבר, להציג, דיונים פוריים שלהם ולעזור בפיתוח שיטות שהוצגו במאמר זה. הפרויקט קיבל מימון של המועצה האירופית למחקר תחת של האיחוד האירופי תכנית המסגרת השביעית (האיחוד FP7/2007-2013) N ° 235649 והן הולנד הארגון של מדעי למחקר (בתחרות) תחת אקו-תוכנית N ° 711.012.008.

כל ריאגנטים רדיואקטיבי והתהליכים שטופלו בהתאם המקומי אוניברסיטת אוטרכט קרינה חוקים ותקנות.
1. דופק צ'ייס
<ol><li>
הדופק צ'ייס על תאים חסיד הערה: אמצעי האחסון שניתנו כאן מבוססים על 60 מ מ תא תרבות מנות. 35 מ מ או מנות 100 מ מ, הכפילו את אמצעי האחסון ב- 1/2 או 2, בהתאמה. פרוטוקול זה משתמש זמן הדופק של פי 10 דקות וצ'ייס של 0, 15, 30, 60, 120 ו- 240 דקות. אלה יכולים להיות מגוונים בהתאם חלבונים ספציפיים הנלמדים (נדונה להלן).<ol>
<li>זרע תאים חסיד (למשל, HEK 293, הלה, צ'ו) במנות תרבות תא 60 מ מ 6, כך הם יהיו subconfluent (80% - 90%) ביום של המרדף דופק. השתמש צלחת לפחות אחת לכל נקודת זמן ו/או תנאי.</li>
		<li>אם נדרש, transfect את התאים עם ריאגנטים זמינים מסחרית תקנים בהתאם להוראות היצרן; לחלופין, לשווק מגלי8 התאים יום אחד לפני. צ'ייס הדופק הניסוי עם הבונה המתאים לביטוי.</li>
		<li>לשטוף את הכלים עם 2 מ של מאגר לשטוף (של האנק מאוזנת תמיסת מלח [HBSS]), להוסיף 2 מ של רעב בינוני (נורמלי תרבות בינוני חסר מתיונין, ציסטאין, סרום שור בעובר [FBS], כגון בינוני חיוני מינימלי [מ] ללא מתיונין, ציסטאין אבל עם 10 מ מ HEPES, pH 7.4), למקם את הכלים 37 ° C humidified חממה עם 5% CO2 למשך 15 דקות.</li>
		<li>להעביר את הכלים המדפים באמבט מים prewarmed-37 ° C כך הם במגע עם מים אך לא לצוף. להפעיל טיימר.</li>
		<li>בגיל 40 s, תשאף המדיום הרעבה, ולהורות על 600 µL של פתרון הדופק (רעב מדיה + צלחת µCi/35 מ מ 55 תווית, לראות את הפתק הקודם שלב 1.1.1) אל הפיפטה ולהוסיף אותו בעדינות במרכז המנה-בדיוק 1 דק. חזור על שלב זה במרווחים 1 דקות ב- t הוא מנות הנותרים. להתחיל עם הדגימה צ'ייס הארוך כדי לחסוך זמן במהלך הניסוי שלך. הערה: בעת טיפול חומר רדיואקטיבי, זה חיוני לעקוב אחר הזהירות המתאימה ואת מקומי חוקים ותקנות למניעת חשיפה מקרית ו/או זיהום.</li>
		<li>-בדיוק 11 דקות ועבור כל המנות הבאות, חוץ המדגם צ'ייס 0 דקות, להוסיף 2 מ של צ'ייס בינוני ישירות לצלחת תשאף את זה, שוב, להוסיף 2 מ של צ'ייס בינוני. חזור על שלב זה במרווחים 1 דקות עבור מנות הנותרים. העברת כל המנות חממה 37 ° C.</li>
		<li>בדיוק 16 דקות, להוסיף 2 מ של צ'ייס בינוני (נורמלי תרבות בינוני + 10 מ מ HEPES [pH 7.4], 5 מ מ ציסטאין ומתיונין 5 מ מ) ישירות אל המנה מדגם 0 דקות על המדיום הדופק להפסיק תיוג; לאחר מכן, תשאף מיד, להעביר את הצלחת צלחת אלומיניום מקורר ולהוסיף 2 מ של מאגר עצירה כקרח (HBSS + 20 מ מ N- ethylmaleimide [NEM]). הערה: זהו המדגם צ'ייס דקות 0. עבור דוגמה זו, להמשיך היישר לשלב 1.1.9.</li>
		<li>העברת כל מנה צ'ייס בחזרה אל המים הרותחים 2 דקות לפני כל הזמן צ'ייס (למשל, מין 24 על מרדף 15 דקות), בזמן המדויק צ'ייס (למשל, 26 דקות עבור מרדף 15 דקות), תשאף התקשורת צ'ייס (או להעביר אותו צינור microcentrifuge אם בעקבות יחסי ציבור הפרשת otein) ולהעביר את הצלחת צלחת אלומיניום מקורר. להוסיף 2 מ של מאגר עצירה קר כקרח.</li>
		<li>דגירה כל המנות על הקרח במאגר עצירה ≥5 דקות; לאחר מכן, תשאף הפתרון להפסיק, לשטוף אותו עם 2 מיליליטר כקרח להפסיק פתרון. האחות לשטוף את ואת lyse מנות עם 600 µL של פירוק מאגר (באגירה פוספט תמיסת מלח [PBS] + אבקת nondenaturing [ראה טבלה של חומרים] מעכבי פרוטאז + 20 מ מ NEM). להשתמש במגרדת התא כדי להבטיח כי הכלים הם lysed באופן כמותי.</li>
		<li>להעביר את lysate 1.5 mL microcentrifuge ובשעות צנטריפוגה עבור 10 דקות ב 15,000-20,000 x g ו- 4 ° C עד הצניפה הגרעינים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הדופק צ'ייס עבור תאים השעיה הערה: כדי להבטיח תיוג יעיל, תאים צריך להיות פעמו-ריכוז של 3 x 106 5 x 106 תאים למ"ל, כרכים צ'ייס צריך להיות 4 x האחסון דופק. בדוגמה הבאה, אנחנו פעמו 5 x 106 תאים נפח של 1 מ ל 10 דקות, להניב חמש צ'ייס זמן נקודות (0, 15, 30, 60 ו- 120 דקות) של 1 מ"ל, המכיל תאים6 עונה 1 פרק 10 לכל נקודת זמן. כל הפתרונות יהיו זהים לאלה בסעיף 1.1.<ol>
<li>התרבות התאים ההשעיה (למשל, 3T3, Jurkat) על פי פרוטוקול שפורסמו בעבר9 כך יש מספר מספיק של תאים בזמנו של הניסוי, לפחות עונה 1 פרק 106 תאים בכל פעם הצבע ו/או תנאי.</li>
		<li>אם נדרש, transfect תאים עם ריאגנטים זמינים מסחרית תקנים על פי הוראות היצרן, או לשווק מגלי8 התאים יום אחד לפני. צ'ייס הדופק הניסוי עם הבונה המתאים לביטוי.</li>
		<li>גלולה 5 x 106 תאים לכל תנאי בשפופרת 50 מל במשך 5 דקות ב 250 x g בטמפרטורת החדר, ותוא וקינ 1 x 5 מ של רעב מדיה, גלולה אותם שוב, ואני resuspend אותם ב 1 מ"ל של רעב מדיה.</li>
		<li>להעביר את התאים באמבט מים 37 ° C, דגירה אותם עבור 10-25 מינימלית להתסיס הצינורות כל 10-15 דקות כדי למנוע את התאים ליישוב בתחתית.</li>
		<li>התחל את הטיימר. ב בדיוק 1 דקה, להוסיף µCi 275 (55 µCi/1 x 106 תאים) של תווית מדולל ישירות אל הצינור המכיל תאים ו מערבולת לערבב. הערה: בעת טיפול חומר רדיואקטיבי, זה חיוני לעקוב אחר הזהירות המתאימה ואת מקומי חוקים ותקנות למניעת חשיפה מקרית ו/או זיהום.</li>
		<li>בדיוק 11 דקות, הפסיק תיוג על-ידי הוספת 4 מ"ל של צ'ייס מדיה. לערבב המדגם ולהעביר מיד 1 מ"ל ל צינור 15 מ"ל בקרח, המכיל 9 מיליליטר כקרח להפסיק פתרון. הערה: זהו המדגם צ'ייס דקות 0.</li>
		<li>חזור על שלבים אלה עבור כל נקודת זמן רצופים. לאחר כל הזמן נקודות נאספים, גלולה את התאים עבור 5 דקות ב x 250 g ב- 4 מעלות צלזיוס. האחות המדיום (או להעביר אותו צינור 15 מ"ל אם בעקבות הפרשת חלבון). לשטוף את התאים עם 5 מיליליטר להפסיק פתרון, גלולה את התאים עבור 5 דקות ב x 250 g ב- 4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>האחות הפתרון להפסיק, לחלוטין lyse התאים עם 300 µL מאגר פירוק קר כקרח, דגירה אותם במשך 20 דקות על קרח כדי להבטיח פירוק מוחלט. להעביר את lysate 1.5 mL microcentrifuge ובשעות צנטריפוגה 10 דקות ב 15,000-20,000 x g ב- 4 ° C עד הצניפה הגרעינים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Immunoprecipitation
<ol><li>לשלב נוגדנים (ראה את הדיון) ו- 50 µL של immunoprecipitation חרוזים (למשל, חלבון A-Sepharose) (10% השעיה [וי/v] מאגר פירוק + 0.25% אלבומין שור [BSA]) ב- microcentrifuge צינור, דגירה אותם ב 4 ° C ~ 30 דקות ב שייקר.</li>
	<li>גלולה של חרוזי 1 דקות ב x 12,000 g בטמפרטורת החדר, וארוקן את תגובת שיקוע. להוסיף 200 µL של lysate התערובת נוגדן-חרוז, דגירה ב 4 ° C ב שייקר 1 h או ראש-ראש-נגמר אם דורש immunoprecipitation > 1 h.</li>
	<li>גלולה של חרוזי 1 דקות ב x 12,000 g בטמפרטורת החדר. וארוקן את תגובת שיקוע והוסף 1 מ"ל immunoprecipitation שטיפת המאגר. מקם את הדגימה ב שייקר בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.</li>
	<li>גלולה החרוזים כפי שמתואר בשלב 2.3 וחזור לשטוף את 1 x. לאחר מכן, וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend את החרוזים ב 20 µL טה מאגר, pH 6.8 (10 מ"מ טריס-HCl, 1 מ מ EDTA). מערבולת המדגם.</li>
	<li>להוסיף 20 µL של 2 x דוגמת המאגר ללא הסוכן של צמצום, מערבולת, אחמם את זה למשך 5 דקות ב 95 ° C, ו מערבולת שוב. הערה: אם רק הכנת דוגמאות תוך צמצום, 2 µL של 500 מ מ DTT להוסיף בשלב זה. לאחר מכן, המשך לשלב 2.7.</li>
	<li>גלולה החרוזים כפי שמתואר בשלב 2.3. להעביר µL 19 של תגובת שיקוע nonreduced צינור microcentrifuge טריים המכילים µL 1 של 500 מ מ DTT, centrifuge את הדגימה, ואת מערבולת בעבר חימום זה עבור 5 דקות ב 95 ° C שוב.</li>
	<li>בדוגמה עבור 1 דקות ב x 12,000 g; זוהי הדוגמה מופחת. תירגע עד לטמפרטורת החדר ומוסיפים µL 1.1 של 1 מ' NEM את מופחת והן את הדגימה nonreduced. מערבולת, ספין למטה הדגימות.</li>
</ol>3. מרחביות-דף
<ol><li>ראשית, קובעים את המתאים מרחביות-דף פתרון ג'ל אחוז עבור החלבון עניין. לדוגמה, HIV-1 gp120, כאשר deglycosylated, פועל במהירות ~ 60 kDa ומנותח ב- 7.5% ג'ל.</li>
	<li>להכין לתערובת ג'ל פתרון ללא TEMED על פי הוראות היצרן (x % אקרילאמיד, 375 מ"מ טריס-HCl [pH 8.8,] מרחביות 0.1% [w/v], ו 0.05% קירור [APS] [w/v]), דגה תחת ואקום עבור > 15 דקות. בעוד התערובת ג'ל הוא degassing, ביסודיות לנקות צלחות זכוכית ג'ל עם 70% אתנול ורקמות נטולת ולמקם אותם לתוך מנגנון הליהוק.</li>
	<li>הוסף TEMED לתערובת ג'ל פתרון (ב ריכוז סופי של 0.005% [וי/v]), לערבב ביסודיות, פיפטה בין לוחות זכוכית, עוזב ~1.5 ס מ מרחב הג'ל הערימה. כיסוי את הג'ל עם יונים H2O או אלכוהול איזופרופיל ובזהירות אנו נותנים פולימריזציה.</li>
	<li>ברגע הג'ל פתרון כולל polymerized, להכין לתערובת ג'ל הערימה (אקרילאמיד 4%, מ מ 125 [pH 6.8], טריס-HCl 0.1% מרחביות [w/v], 0.025% APS [w/v]).</li>
	<li>ריקון העליון של הג'ל פתרון עם יונים H2O ולהסיר, אז כל המים. הערה: השתמש נייר סינון כדי להסיר את הטיפות האחרונות.</li>
	<li>להוסיף TEMED לתערובת ג'ל הערימה (0.005% [וי/v]), לערבב ביסודיות, ואת כיסוי הג'ל פתרון עם ג'ל הערימה והכנס מסרק 15-. טוב. ברגע הג'ל הערמה יש polymerized, להעביר אותו התא פועל ולמלא התאים העליונים והתחתונים עם הפעלת מאגר (25 מ מ טריס-HCl, גליצין 192 מ"מ [pH 8.3] ו- 0.1% מרחביות [w/v]).</li>
	<li>לטעון µL 10 מדגם לכל ליין minigel 15-ליין. להימנע מטעינה את הדגימות הראשון ולא את הסמטה האחרונה הג'ל וטען המאגר מדגם nonreducing ב כל מסלולים ריקים כדי למנוע החיוכים של להקות. לפעול ג'לים-קבוע mA/ג'ל 25 עד החזית צבע היא בחלק התחתון של הג'ל.</li>
	<li>הסר את ג'לים הזכוכיות, כתם של ג'לים עם פתרון מכתים חלבון (חומצה אצטית 10%-30% מתנול H2O + 0.25% מבריק הכחול R250 [w/v]) עבור חמש דקות עם עצבנות, ולא לאחר מכן, destain במשך 30 דקות עם destaining פתרון (צביעת פתרון ללא R250 כחול מבריק).</li>
	<li>לארגן ג'ל פנים כלפי מטה על פלסטיק לעטוף, אז, במקום נייר כרומטוגרפיה 0.4 מ מ מעליהם. מניחים ג'ל כריך כרומטוגרפיה הנייר-הצד למטה על גבי ג'ל מייבש. עקבתי אחרי ההוראות של היצרן, לייבש את ג'לים עבור 2 h ב- 80 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>להעביר את ג'לים מיובשים קסטה, כיסוי אותם עם מסך קולנוע או זרחן autoradiography. אם משתמש autoradiography סרט, שלב זה חייב להתבצע בחדר חשוך.</li>
</ol>

<ol><li>Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-+and+Post-Translational+Protein+Folding+in+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER.</a> Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).</li>
<li>Pisoni, G. B., Molinari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+Questions+%28with+their+Answers%29+on+ER-Associated+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation.</a> Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).</li>
<li>Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Glycan-based+ER+Molecular+Chaperone+and+Protein+Quality+Control+System%3A+The+Calnexin+Binding+Cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle.</a> Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).</li>
<li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+topology+around+the+cleavage+site+regulate+post-translational+cleavage+of+the+HIV-1+gp160+signal+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide.</a> Elife. 6, 26067(2017).</li>
<li>Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+influenza+hemagglutinin+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum.</a> Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).</li>
<li>Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+nonvectorial+folding+in+a+newly+synthesized+multidomain+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein.</a> Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).</li>
<li>Land, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum.</a> Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).</li>
<li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+Transduction+of+Helper+T+Cells+as+a+Genetic+Approach+to+Study+Mechanisms+Controlling+their+Differentiation+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54698(2016).</li>
<li>Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+evolves+into+a+nonsyncytium-inducing+virus+upon+prolonged+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro.</a> Virology. 263 (1), 55-69 (1999).</li>
<li>Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+folding+and+calnexin+binding+during+glycoprotein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).</li>
<li>Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+glycans+direct+the+cotranslational+folding+pathway+of+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin.</a> Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).</li>
<li>Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+Hsp47%2C+Grp78%2C+and+Grp94+with+procollagen+supports+the+successive+or+coupled+action+of+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).</li>
<li>Hoelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primary+folding+defect+and+rescue+of+DeltaF508+CFTR+emerge+during+translation+of+the+mutant+domain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain.</a> PLoS One. 5 (11), 15458(2010).</li>
<li>Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+CFTR+is+predominantly+cotranslational%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Folding of CFTR is predominantly cotranslational.</a> Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).</li>
<li>Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranscriptional+Regulation+of+Glycoprotein+Quality+Control+in+the+Endoplasmic+Reticulum+Is+Controlled+by+the+E2+Ub-Conjugating+Enzyme+UBC6e%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e.</a> Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).</li>
<li>Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+influenza+hemagglutinin+trimers+and+its+role+in+intracellular+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport.</a> Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

. צ'ייס הדופק שיטות היו חיוניים לפיתוח הבנה המדענים של חלבון מתקפל לתוך תאים שלמים. ניסינו לספק שיטה זה כמו כללי ככל האפשר, גישה זו יש הפוטנציאל של וריאציות כמעט בלתי מוגבלת ללמוד תהליכים שונים המתרחשים בזמן קיפול, את התחבורה ואת החיים של חלבונים בתוך התא.
בעת ביצוע מרדף הדופק באמצעות תאים חסיד במנות, זה חיוני לטיפול כל מנה זהה ככל האפשר, צלחת נפרדת משמש עבור כל נקודת זמן ו/או תנאי בניסוי. במיוחד עבור הדופק קצר וזמני צ'ייס (< 5 דקות), זה חיוני כדי לשמור על שליטה הדוקה על הפעמים הדופק וצ'ייס (ע...

קיפול של אפילו יחסית פשוטה חלבונים כרוך השונות מתקפלים אנזימים רבים, מלווים מולקולרית ו שינויים קוולנטיות1. שיחזור מלא של אלה תהליכים במבחנה הוא בלתי אפשרי כמעט, בהתחשב ומספר עצום של מרכיבים שונים המעורבים. לכן, רצוי מאוד, ללמוד חלבון מתקפל ויוו, בתאים חיים. טכניקות רדיואקטיבי. צ'ייס הדופק להוכיח כלי רב עוצמה עבור הלומדים את סינתזה, קיפול, תחבורה, והשפלה של חלבונים בסביבתם הטבעית.
חילוף החומרים תיוג של חלבונים במהלך דופק קצר עם 35התווית על-ידי S מתיונין/ציסטאין, ואחריו מרדף בהיעדר תווית רדיואקטיבי, מאפשר מעקב מסוים של אוכלוסייה של חלבונים לאחרונה מסונתז ב חצרו הסלולר רחב יותר. לאחר מכן, חלבונים היעד יכול להיות מבודדים באמצעות immunoprecipitation, נותחו באמצעות מרחביות-עמוד או בטכניקות אחרות. חלבונים רבים, המסע שלהם דרך התא מסומן על-ידי שינויים הנראים לעין על ג'ל מרחביות-דף. לדוגמה, העברת מהחלבונים glycosylated תוך-פלזמית (ER) למתחם גולג'י לעיתים קרובות מלווה שינויים של glycans מקושרים-N או התוספת של2,O מקושרים glycans3. שינויים אלה גורמות גדול לעלייה המסה המולקולרית לכאורה, אשר ניתן לראות על ידי ניידות שינויים בדף-מרחביות. ההבשלה יכולים גם להיות מסומנים על ידי אדמירל הפרוטאוליטי, כגון אות-פפטיד מחשוף או ההסרה של pro-פפטידים, וכתוצאה מכך שינוי המסה המולקולרית לכאורה ניתן בעקבות בקלות על ג'ל מרחביות-דף4. רדיואקטיביות יש יתרונות ניכר על טכניקות דומות כגון cycloheximide רודף, איפה סינתזה של חלבון הרומן מנועה, כמו טיפולי ארוך רעילים לתאים, אינה שוללת את הרוב המכריע של מבוגר, מצב יציב מהחלבונים ניתוח, כמו כמה חלבונים יש מחצית החיים של ימים. ההשוואה של חלבונים תחת שניהם nonreducing הפחתת התנאים מאפשר הניתוח של היווצרות קשר דיסולפידי, צעד חשוב בקיפול של הרבה חלבונים הפרשה4,5,6, 7.
כאן אנו מתארים שיטה כללית לניתוח של קיפול חלבונים ותעבורה תאים שלמים, תוך שימוש בגישה רדיואקטיבי. צ'ייס דופק. בעוד אנחנו כיוונת לספק שיטת כמו מפורט ככל האפשר, הפרוטוקול פוטנציאלי כמעט בלתי מוגבלת של הסתגלות ויאפשר אופטימיזציה ללמוד חלבונים ספציפיים של כל קורא.
שני פרוטוקולים הדופק חלופי-צ'ייס, אחד עבור תאים חסיד (שלב 1.1 של פרוטוקול המובאת כאן) ואחד עבור השעיה תאים (שלב 1.2 של פרוטוקול המובאת כאן) הינם מסופקים. התנאים הניתנים כאן מספיקים להמחיש חלבון שבאה לידי ביטוי עם רמות בינונית-גבוהה הביטוי. אם הקורא הוא עובד עם חלבונים ביטוי לקוי או תנאים posttreatment שונים, כגון immunoprecipitations מרובות, זה הכרחי להגדיל את גודל המנה או הנייד שלי כראוי.
לצ'ייס הדופק ההשעיה, הדגימות צ'ייס שצולמו לכל נקודת זמן כל לקוחים מתוך שפופרת אחת של תאים. השלבים לשטוף אחרי הדופק מושמטים; במקום זאת, בהמשך תיאגוד 35S נמנעת באמצעות דילול עם עודף גבוה של מתיונין ללא תווית, ציסטאין.
הפרוטוקולים הציג להשתמש רדיואקטיבי 35התווית על-ידי S ציסטאין ומתיונין לעקוב אחר תהליכים קיפול חלבונים תאיים. כל הפעולות עם ריאגנטים רדיואקטיבי צריכה להתבצע באמצעות אמצעי הגנה מתאימים כדי למזער כל חשיפה של המפעיל לבין הסביבה לקרינה רדיואקטיבית, ניתן לבצע בתוך מעבדה ייעודית. . המרדף הדופק תיוג טכניקה הוא יעיל יחסית בזמנים קצרים הדופק (< 15 דקות), פחות מ 1% מהסכום ההתחלתי של רדיואקטיביות מעוגנת את החלבונים עתה מסונתז. לאחר העשרת של חלבון המטרה באמצעות immunoprecipitation, המדגם מרחביות-דף מכיל פחות מ- 0.05% מהסכום ההתחלתי של רדיואקטיביות.
למרות מתיונין 35S של ציסטאין תיוג מיקס מתייצב, כמה ריקבון, מניב רדיואקטיבי תרכובות נדיפות, תתרחש. כדי להגן על החוקר, את המנגנון, כמה אמצעי זהירות יש לנקוט. החוקר תמיד צריך לציית? לחוקים בטיחות קרינה מקומית, ניתן ללבוש של פחם סיעוד מסכה, מלבד חלוק מעבדה וכפפות (זוגי). מניות צלוחיות עם 35S מתיונין, ציסטאין תמיד אמור להיפתח בשכונה fume, או תחת נקודת שאיפה מקומיים. מעבדה ידוע זיהום שהנקודות צנטריפוגות, פיפטות, מרחצאות מים, חממות, ומנענעים. הזיהום של אזורים אלה מצטמצם באמצעות פיפטה טיפים עם מסנן פחם, צינורות microcentrifuge חיובי-חותם (ראה טבלה של חומרים), אקווריום פחם ספוגים מים אמבטיות, פחם מסנן עיתונים מודבקים את הכלים. צ'ייס דופק, פחם משמר מערכת השאיפה, ואת המיקום של מאכלים המכילים גרגרים פחם חממות, מיכלי אחסון.

<table><tbody><tr><td>1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה בטוחים</td><td>Sarstedt</td><td>72.706.400</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td>חומצה אצטית קרחונית</td></tr><tr><td>BAS אחסון מסך זרחן 20x25 ס"מ</td><td>GE מדעי החיים</td><td>28956475</td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>סיגמא</td><td>B8026</td><td>ביולוגיה מולקולרית כיתה</td></tr><tr><td>Carestream Biomax MR סרטים</td><td>קודאק</td><td>Z350370-50EA</td><td></td></tr><tr><td>אמצעי תרבית תאים</td><td>שונים</td><td>N / A</td><td>מדיה של תרבית תאים רגילה עבור קווי תאים ספציפיים בשימוש</td></tr><tr><td>מדיה של תרבית תאים, ללא מתיונין/ציסטאין</td><td></td> שונים <td>N/A</td><td>ניסוח מדיה זהה לאמצעי תרבית רגילים למשל DMEM / MEM / RPMI, חסר</td></tr><tr><td>נייר סינון פחם</td> מתיונין וציסטאין <td>Whatman</td><td>1872047</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטה מסוננים פחם</td><td>מולקולרי מוצרים ביולוגיים</td><td>5069B</td><td></td></tr><tr><td>פחם ואקו-מגן</td><td>Whatman</td><td>67221001</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R250</td><td>Sigma</td><td>112,553</td><td>לאלקטרופורזה</td></tr><tr><td>ציסטאין</td><td>סיגמא</td><td>C7352</td><td>כיתה ביולוגיה מולקולרית, הכינו מלאי של 500 מ"מ, אחסן ב -20&nbsp;</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td> <td>Sigma</td><td>10197777001</td><td>ביולוגיה מולקולרית כיתה</td></tr><tr><td>EasyTag Express35S תערובת תיוג חלבון</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG772014MC</td> קבוצות <td>בגודל אחר של תווית זמינות בהתאם לשימוש,</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E1644</td><td>ביולוגיה מולקולרית כיתה</td></tr><tr><td>ציוד לייבוש ג'ל</td><td>שונים</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא</td><td>G5516</td><td>ביולוגיה מולקולרית</td></tr><tr><td>כיתה 3 נייר כרומטוגרפיה</td><td>GE Life Sciences</td><td>3003-917</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS)</td>מגבונים עדינים של <td>Gibco</td><td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes VWR</td><td></td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M3671</td><td>ביולוגיה מולקולרית כיתה</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סיגמא</td><td>MX0490&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Methionine</td><td>Sigma</td><td>M5308</td><td>כיתה ביולוגיה מולקולרית, הכינו מלאי של 250 מ"מ, אחסן ב-20</td></tr><tr><td>ציוד יציקה/ריצה מיניג'ל</td><td>שונים</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>ביולוגיה מולקולרית בדרגה</td></tr><tr><td>N-ethylmaleimide</td><td>Sigma</td><td>E3876</td><td>ביולוגיה מולקולרית, הכינו מלאי 1M ב-100% אתנול, אחסן ב-20</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5368</td><td>ביולוגיה מולקולרית כיתה</td></tr><tr><td>חלבון-A חרוזי זרימה מהירה</td><td>ספרוז GE בריאות-טיפול</td><td>17-5280-04</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט (SDS)</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>ביולוגיה מולקולרית כיתה</td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא</td><td>T8787</td><td>ביולוגיה מולקולרית כיתה</td></tr><tr><td>בסיס טריזמה (Tris)</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td>ביולוגיה מולקולרית כיתה</td></tr><tr><td>טייפון IP הדמיה ביו-מולקולרית</td><td>Amersham</td><td>29187194</td><td></td></tr><tr><td>Unwire מתלה מבחנה 20 מ"מ לאמבטיית מים</td><td>Nalgene</td><td>5970-0320PK</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח של קיפול חלבונים, תחבורה, והשפלה בתאים חיים על ידי הדופק רדיואקטיבי צ'ייס

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

תיוג רדיואקטיבי. צ'ייס הדופק הוא כלי רב עוצמה עבור הלומדים ההבשלה הסתגלותי, התעבורה מיקומם הסלולר פונקציונלי, ההשפלה של היעד חלבונים בתאים חיים. באמצעות לזמנים קצרים (פעימה) radiolabeling (< 30 דקות) ומבוקר בחוזקה פעמים צ'ייס, זה אפשרי תווית רק חלק קטן של הבריכה הכולל חלבון ולעקוב אחרי הקיפול שלה. בשילוב עם nonreducing/הפחתת מרחביות-לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד), immunoprecipitation עם נוגדנים (קונפורמציה-ספציפי), קיפול תהליכים אפשר לבחון בפירוט רב. במערכת זו נעשה שימוש כדי לנתח את קיפול חלבונים עם וריאציה ענק מאפיינים כגון חלבונים מסיסים, חלבונים transmembrane יחיד, מרובה עוברים, בכבדות N O glycosylated חלבונים, חלבונים עם ובלי דיסולפידי נרחב מליטה. . צ'ייס הדופק שיטות הן הבסיס של לימודי קינטית לתוך מגוון של תכונות נוספות, לרבות co - שינויים posttranslational, oligomerization ואת פלמור, בעיקרו של דבר המאפשר הניתוח של חלבון מלידה למוות. . צ'ייס הדופק מחקרים על קיפול חלבונים הם משלימים עם שיטות אחרות הביוכימי, biophysical ללמוד חלבונים במבחנה על ידי מתן רזולוציה טמפורלית מוגברת אינפורמציה פיזיולוגית. השיטות כפי שמתואר בתוך הנייר הזה מותאמים בקלות ללמוד קיפול של כמעט כל חלבון זה יכול לבוא לידי ביטוי במערכות יונקים או חרק-cell.

קיפול ואת הפרשת HIV-1 gp120 לצ'ייס הדופק חסיד מוצג באיור2. הג'ל nonreducing (תאים NR באיור) מציגה קיפול חמצוני של gp120. מיד אחרי הדופק תיוג של 5 דקות (מינימום 0 צ'ייס) gp120 שמופיע בתור להקת ' מאטום לשקוף ' גבוה יותר בג'ל ולאחר בהמשך צ'ייס, הלהקה נודד למטה הג'ל דרך אפילו יותר תופס קיפול intermediates (IT) עד הוא מצטבר בלהקה חזק (NT) זה מייצג gp120 מקופל באופן מקורי. מצב זה מתרחש כפי היווצרות חוב דיסולפידי מגביר את הקומפקטיות של החלבון, גורם לו להעביר מהר יות...

כאן נתאר פרוטוקול עבור שיטה כללית. צ'ייס הדופק המאפשר ניתוח קינטי של קיפול, תחבורה, והשפלה של חלבונים להיות בעקבות בתאים חיים.

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

מרדף הדופק הרדיואקטיבי באמצעות 35 S שכותרתו מתונין וציסטאין היא עדיין השיטות הביוכימיות היחידות לחקור ביו-סינתזה של חלבונים עם זמן בתאים חיים. ביו-סינתזה של חלבונים מכסה הן תרגום, קיפול והרכבה, והן סחר והשפלה. שילוב של מרדף הדופק הרדיואקטיבי עם ניתוח של שינויים בחלבון לאחר התרגום, כגון היווצרות אג"ח דיסולפיד ואצטילציה מספק בדיקה רגישה וכמותית כדי לחקור את אמונת החלבון עם הזמן.מיקוד טוב וטיפול ניסיוני נדרש עבור הליך זה. הכנה טובה היא קריטית, כמו מאגרים, סביבת העבודה הרדיואקטיבית שלך ולוח זמנים ברור. וידאו זה מספק מבט ברור מעבר לכתף של פרוטוקול מרדף הדופק הרדיואקטיבי.הדגמת ההליך תהיה הוי יינג יאו, מועמד pHd מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל בהליך זה, זרע מתחלף ותאי תרבות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לפני מרדף הדופק, לבדוק את התאים שלך דרך המיקרוסקופ.לאחר מכן, לשטוף את הכלים עם שני מיליליטר של חיץ לשטוף. ושני מיליליטר של רעב בינוני לתאים ומ מניחים את הכלים באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך 15 דקות. ודא כי מרדף הדופק שלך להגדיר הוא בסדר.מעבירים את הכלים למדפים באמבט המים, מחוממים מראש ל-37 מעלות צלזיוס. ודאו שהמנות נמצאות במגע עם מים, אך אל תצופו. לאחר מכן, התחל שעון זמן.ב-40 שניות, שאף את מדיום הרעב. באמצעות צינור מיקרו, לצייר 600 microliters של פתרון הדופק. בדיוק דקה אחת, מו

analysis-protein-folding-transport-degradation-living-cells

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

אנו מתארים שיטה לניתוח שינוי של N-linked glycans דרך חיים המוקדם של גליקופרוטאינים לאחר ביוסינתזה שלהם בתאי יונקים. זו מושגת על ידי ניתוח הדופק מרדף של glycans שכותרתו מטבולית, לשחרר האנזימטית של גליקופרוטאינים ובחינה על ידי HPLC.

Pulse-מרדף ניתוח של N-linked שרשראות סוכר מ גליקופרוטאינים בתאי יונקים

המתואר כאן טכניקה כיום בשימוש שגרתי לבודד קשורות ביציבות הריבוזום מתחמי הרשת המתהווה (RNCs). שיטה זו מנצלת את הגילוי כי 17 חומצות אמינו ארוכה SecM "מעצר רצף" יכול לעצור את התארכות תרגום פרוקריוטים...

באמצעות רצף מעצר SecM ככלי לבודד פוליפפטידים כרוכים הריבוזום

סרטון זה מתאר בדיקת פירוק עבור חלבונים שאינם מקופלים כהלכה באמצעות טיפול cycloheximide יחד עם שבר דטרגנט. שיטה זו מסייעת בחקר הדינמיקה של חלבונים שאינם מקופלים כהלכה ובחשיפת המנגנונים המעמיקים של תחלופת החלבונים.

בדיקת פירוק חלבון נוטה לקיפול שגוי: טכניקה לניטור פירוק חלבון מקופל בצורה שגויה באמצעות טיפול בציקלוהקסימיד ושבירת חומרי ניקוי

סרטון זה מתאר בדיקת מיקרו-צלחות מבוססת פלואורסצנטיות במבחנה כדי לחקור את קינטיקה הפירוק של חלבון מוטנטי לוציפראז מקופל בצורה פלואורסצנטית המבוטא בגרעינים של תאי יונקים נגועים. הבדיקה כוללת טיפול בתאים המבטאים את החלבון המוטנטי הפלואורסצנטי עם מעכב תרגום ומעכב פרוטאזום כדי להעריך את הפירוק בתיווך פרוטאזום של החלבון המקופל בצורה שגויה.

Fluorescence Microplate-Based Cycloheximide Chase Assay: טכניקה לניטור קינטיקה של פירוק חלבונים גרעיניים פלואורסצנטיים שאינם מקופלים כהלכה

כדאיות ניידת תלויה בניהול הזמן והיעיל של misfolding חלבון. כאן אנו מתארים שיטה להמחשת הגורל הפוטנציאלי השונה של חלבון misfolded: קפל שוב, שפלה, או תפיסה בתכלילים. אנו מדגימים את השימוש בחיישן מתקפל,...

4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים

מאמר זה מתאר את השימוש בחלבון היתוך לוציפראז-GFP גחלילית...

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

רמות חלבון בתאים וברקמות לעתים קרובות מוסדרות היטב על ידי האיזון של ייצור חלבון ופינוי. שימוש בקרינה רדיואקטיבית לאחר photoconversion (FDAP), קינטיקה האישור של חלבונים ניתן למדוד באופן ניסיוני בvivo.

מדידת יציבות חלבון בחיים עוברי דג הזברה שימוש הקרינה רדיואקטיבית לאחר photoconversion (FDAP)

דוח זה מתאר פרוטוקולים למדידת שיעורי פירוק של חלבונים לא מקופלים על ידי כתם מערבי או מבחנים מבוססי פלואורסצנטיות. ניתן ליישם את השיטות לניתוח של חלבונים אחרים שקופלו בצורה לא נכונה ולסינון תפוקה גבוהה.

מבחנים עבור הפירוק של חלבונים בתאים Misfolded

פרוטוקול זה מתאר שיטה רגיש למדוד את קצב ההעברה nucleocytoplasmic בתוך נוירון כמו NSC-34 תאים תאים על ידי כימות השינוי בזמן אמת ביבוא גרעיני של חלבון NLS-NES-GFP.

Assay למדוד Nucleocytoplasmic התחבורה בזמן אמת בתוך מוטורי נוירון כמו NSC-34 תאים

פרוטוקול זה מתאר שיטה לקביעת חלבון מחצית החיים של תאים חסיד חי אחד, באמצעות הדופק תיוג פלורסצנטיות הדמיה בצילום מואץ של חלבונים פיוז'ן SNAP-תג.

תא בודד כימות של חלבון השפלה המחירים על-ידי קרינה פלואורסצנטית זמן לשגות מיקרוסקופ בתרבות תא חסיד

למדו את שיטת הדופק-רדיפה הרדיואקטיבית לניתוח קיפול חלבונים, תחבורה והשפלה בתאים חיים באמצעות מתיונין וציסטאין מסומנים ב-35S. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר דינמיקת ביוסינתזת חלבונים בזמן אמת.

ניתוח של קיפול חלבונים, תחבורה, והשפלה בתאים חיים על ידי הדופק רדיואקטיבי צ'ייס

גלה סרטונים נוספים