Name: Séquençage de l’ultra longue lecture pour l’analyse de l’ADN génomique ensemble (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Découvrez le séquençage par lecture ultra-longue pour l'analyse de l'ADN génomique humain. Cette méthode améliore l'assemblage du génome et la caractérisation des variations structurales pour la médecine de précision.

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Les auteurs remercient Y. Zhu pour ses commentaires sur le manuscrit. Recherche rapporté dans cette publication a été partiellement financée par le National Cancer Institute de la National Institutes of Health, sous attribution numéro P30CA034196. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health.

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

En principe, nanopore séquençage est capable de produire 100 Ko de megabase lectures en longueur11,12,13. Quatre principaux facteurs affectera les performances de la qualité de course et les données de séquençage : 1) nombre de pores actifs et l’activité des pores ; 2) protéine moteur, qui contrôle la vitesse de l’ADN en passant par le nanopore ; 3) modèle ADN (longueur, pureté, qualité, masse) ; 4) séquençage adaptateur ligature efficacité, ce qui détermine l’ADN utilisable de l’échantillon d’entrée. Les deux premiers facteurs dépendent de la version de la cellule d’écoulement et le kit de séquençage fournies par le fabricant. Les deux facteurs sont des étapes cruciales dans le présent protocole (extraction d’ADN de HMW, cisaillement et ligature).
Ce protocole requiert patience et pratique. La qualité de l’ADN de HMW est importante pour les bibliothèques6de l’ADN ultra longue. Le protocole commence par cellules recueillies avec viabilité élevée (> 85 % des cellules viables préféré), limitant l’ADN dégradé des cellules mortes. Tout processus rigoureux qui peuvent introduire des dommages à l’ADN (par exemple, fort dérangeant, secouant, vortex, multiples pipetage, répétées gel et dégel) doit être évitée. Dans la conception du protocole, nous omettons pipetage dans l’ensemble du processus d’extraction de l’ADN. Conseils d’alésage large doivent être utilisées lorsque le pipetage est nécessaire après le cisaillement mécanique pendant la construction de la bibliothèque et le séquençage. Comme les nanopores sont sensibles aux chimies dans le tampon de chambre12, il doit être aussi peu contaminants résiduels (par exemple, les détergents, agents tensio-actifs, phénol, éthanol, protéines, ARN, etc.) que possible dans l’ADN. Compte tenu de la longueur et le rendement, la méthode d’extraction de phénol montre des résultats meilleurs et plus reproductibles comparés avec plusieurs différentes méthodes d’extraction testées jusqu'à présent.
Malgré la capacité du présent protocole pour produire des séquences de lecture longue, plusieurs limitations subsistent. Tout d’abord, ce protocole a été optimisé basé sur l’appareil de séquençage nanopore disponible au moment de la publication ; ainsi, il est limité à la chimie sélective axée sur les nanopore séquençage et pourrait être sous-optimal lorsque effectuées dans d’autres types d’appareils de séquençage long à lire. En second lieu, le résultat est fortement tributaire de la qualité de l’ADN extrait de la matière (tissus ou cellules). Longueur de lecture sera compromise si l’ADN de départ est déjà dégradé ou endommagé. Troisièmement, bien que plusieurs étapes QC sont incorporés dans le protocole pour vérifier la qualité de l’ADN, le rendement final et la longueur de la lecture peuvent être affectées par la cellule de flux et activité, ce qui pourrait être variable à ce stade précoce de la plate-forme de séquençage nanopore des pores développement.
Le protocole décrit ici utilise des échantillons de ligne de cellules humaines de suspension pour l’extraction de l’ADN. Nous avons optimisé les temps de passage en aiguille de cisaillement, le ratio d’ADN HMW transposase et le moment de ligature pour produire les résultats décrits. Le protocole peut être augmenté de quatre façons. Tout d’abord, les utilisateurs peuvent démarrer avec d’autres cellules mammifères cultivées et avec des montants différents de cellules, tissus, échantillons cliniques ou d’autres organismes. Optimisation sur les temps d’incubation de lyse, volume réactionnel et centrifugation est nécessaires. Deuxièmement, il est difficile de prédire la taille cible pour le séquençage ultra longue lecture. Si la longueur de lecture est plus courte que prévu, les utilisateurs peuvent ajuster les temps de passage dans la méthode cisaillement mécanique ou changer le ratio de l’ADN de HMW à transposase dans la méthode axée sur la fragmentation de transposase. Liaison et élution longtemps durant les étapes de nettoyage sont utiles parce que l’ADN HMW est très visqueux. Troisièmement, avec nanopore différents appareils de séquençage, on peut ajuster la quantité et le volume de l’ADN pour remplir les critères du séquenceur. Quatrièmement, seulement ces ADN ligaturé aux adaptateurs de séquençage va être séquencé. Afin d’améliorer l’efficacité de la ligature, on peut essayer de titrer les concentrations de l’adaptateur et la ligase. Ligature des mis à jour le temps et les agents encombrement moléculaires comme PEG18 peuvent être appliquées à l’avenir. Le protocole de séquençage de l’ADN ultra long combiné avec CRISPR19,20 peut offrir un outil efficace pour l’ordonnancement de l’enrichissement de cible.

Ces dix dernières années, massivement parallèle et technologies de haute précision deuxième génération haut débit séquençage ont conduit à une explosion de découverte biomédicale et de l’innovation technologique1,2,3. Malgré les progrès techniques, le court-lecture de données générées par les plateformes de deuxième génération est inefficaces à résoudre les régions génomiques complexes et est limités dans la détection des variants structurels génomiques (SVs), qui jouent un rôle important dans l’homme Evolution et maladies4,5. En outre, court-lecture de données est incapables de résoudre la répétition de variation et ne conviennent pas pour les hautes haplotype progressive des variants génétiques6.
Les progrès récents dans le séquençage de la molécule unique offre significativement plus longue lire la longueur, ce qui peut faciliter la détection de l’éventail complet des SVs7,8,9et offres Assemblée précise et complète du complexe génomes microbiens et mammifères6,10. La plate-forme nanopore effectue seule molécule séquençage en mesurant directement les changements actuels médiées par le passage de l’ADN dans les pores de12,11,13. Contrairement à toute chimie de séquençage ADN existante, nanopore séquençage peut générer long (des dizaines de milliers de kilobases) se lit comme suit en temps réel sans avoir à compter sur la cinétique de la polymérisation ou artificielle l’amplification de l’échantillon d’ADN. Par conséquent, nanopore long lire séquençage (NLR-seq) détient très prometteur pour la génération ultra grandes longueurs de lecture bien au-delà de 100 Ko, ce qui ferait progresser considérablement les analyses génomiques et biomédicales14, particulièrement dans la faible complexité ou riches en répétition régions des génomes15.
La caractéristique unique de séquençage nanopore est sa capacité à générer des longues lectures sans limitation de durée théorique. Par conséquent, la longueur de lecture dépend de la longueur physique de l’ADN qui est directement touchée par la qualité de modèle intégrité et séquençage de l’ADN. En outre, selon l’ampleur de la manipulation et le nombre d’étapes impliquées, comme forces de pipetage et les conditions d’extraction, la qualité de l’ADN est très variable. Il est donc difficile pour que l'on puisse céder lectures longues en appliquant simplement les protocoles d’extraction d’ADN standards et des méthodes de construction de la bibliothèque fournie du fabricant. À cette fin, nous avons développé une solide méthode permettant de générer ultra-longue lire (des centaines de kilobases) données de séquençage à partir de granulés de cellules récoltées. Nous avons adopté plusieurs améliorations dans les procédures de préparation ADN extraction et bibliothèque. Nous avons simplifié le protocole afin d’exclure des procédures inutiles qui causent des dommages-intérêts et la dégradation de l’ADN. Ce protocole est composé de poids moléculaire élevé (HMW) extraction d’ADN, ultra longue construction de bibliothèque d’ADN et le séquençage sur une plate-forme nanopore. Pour un biologiste moléculaire bien formé, cela prend généralement de 6 h de cellule récolte jusqu'à l’achèvement de HMW DNA extraction, 90 min ou 8 h pour la construction de la bibliothèque selon la méthode de cisaillement et jusqu'à une autre 48 h pour le séquençage de l’ADN. L’utilisation du protocole permet à la communauté de la génomique afin d’améliorer notre compréhension de la complexité du génome et avoir un nouvel aperçu variation génomique dans les maladies humaines.

<table><tbody><tr><td><Réactif>s forts</forts></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Éthanol absolu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XPbeads</td><td>Beckman</td><td>A63881</td><td>billes magnétiques pour</td></tr><tr><td>nettoyage aiguilles conventionnelles BD</td><td>Becton Dickinson</td><td>305136</td><td>27G, pour cisaillement mécanique</td></tr><tr><td>BD Seringue Luer-Lok</td><td>Becton Dickinson</td><td>309628</td><td>pour cisaillement mécanique</td></tr><tr><td>Blunt/TA Ligase Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0367S</td><td></td></tr><tr><td>Lames de chambre de comptage cellulaire Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10228</td><td>pour le comptage cellulaire</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9261</td><td>pH 8.0, 0.5 M, 500 mL</td></tr><tr><td>Cellule d’écoulement</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>FLO-MIN106</td><td>R9.4.1</td></tr><tr><td>HG00773 cellules</td><td>Coriell Institut</td><td>HG00733</td><td>cellules utilisées dans ce protocole</td></tr><tr><td>Kit de séquençage de ligature 1D</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>SQK-LSK108</td><td>Kit de ligature de nanopores</td></tr><tr><td>MaXtract Tubes haute densité</td><td>Qiagen</td><td>129073</td><td>Tubes de gel</td></tr><tr><td>NEBNext FFPE DNA Repair Mix</td><td>NEB</td><td>M6630S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module</td><td>NEB</td><td>M7546S</td><td></td></tr><tr><td>Eau sans nucléases</td><td>Invitrogen</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate, PBS</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td>10X, pH 7,4</td></tr><tr><td>Phénol :chloroforme :IAA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9730</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td>20 mg/mL</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Kit de dosage</td><td>Fluorimètre Invitrogen</td><td>Q32850</td><td>pour la quantification de l’ADN</td></tr><tr><td>Kit de séquençage rapide</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>SQK-RAD004 Kit de</td><td>transposase nanopore</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>FDS</td><td>Invitrogen</td><td>AM9822</td><td>10 % (poids/vol)</td></tr><tr><td>Solution de chlorure</td><td>de sodium Invitrogen</td><td>AM9759</td><td>5.0 M</td></tr><tr><td>TE tampon</td><td>Invitrogen</td><td>AM9849</td><td>pH 8.0</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Invitrogen</td><td>AM9856</td><td>pH 8.0, 1 M</td></tr><tr><td>Triton X-100 solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443</td><td>~10</td></tr><tr><td> %Nom<</td><td>strong>Entreprise</strong</td><td>>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad C1000 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196EDU</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>22628180</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Compteur de cellules automatisé</td><td>Life</td> Technologies <td>AMQAF1000</td><td>pour le comptage de cellules</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td>Rack magnétique</td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td>pour incubation</td></tr><tr><td>Congélateur</td><td>LabRepCo</td><td>LHP-5-UFMB</td><td></td></tr><tr><td>GridION</td><td>Oxford Nanopore Technologies Dispositif nanopore</td><td>GridION X5</td><td>utilisé dans ce protocole</td></tr><tr><td>HulaMixer Mélangeur d’échantillons</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15920D</td> Mélangeur <td>rotateur</td></tr><tr><td>MicroCentrifuge</td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000 Spectrophotomètre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-1000</td><td>pour la lecture UV</td></tr><tr><td>Pippin Pulse</td><td>Sage Science</td><td>PPI0200</td><td>instrument d’électrophorèse en gel à champ pulsé</td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorimètre</td><td>Invitrogen</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Réfrigérateur</td><td>LabRepCo</td><td>LABHP-5-URBSS</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-A236</td><td></td></tr><tr><td>Bain d’eau</td><td>VWR</td><td>Référence 89501-464</td><td></td></tr></tbody></table>

séquençage de l’ultra longue lecture pour l’analyse de l’adn génomique ensemble

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Troisième génération de technologies de séquençage de l’ADN molécule unique offrent nettement plus longtemps lire longueur qui peut faciliter le montage des génomes complexes et l’analyse des variantes structurales complexes. Plates-formes Nanopore effectuent seule molécule séquençage en mesurant directement les changements actuels médiées par le passage de l’ADN à travers les pores et peuvent générer des centaines de lectures kilobases (kb) avec le coût en capital minime. Cette plate-forme a été adoptée par de nombreux chercheurs pour une variété d’applications. Réalisation de plus longues longueurs de lecture de séquençage est le facteur le plus critique de tirer parti de la valeur des plateformes de séquençage nanopore. Pour générer des lectures ultra longues, une attention particulière est nécessaire pour éviter les ruptures de l’ADN et de gagner en efficacité pour générer des modèles productifs de séquençage. Ici, nous fournissons le protocole détaillé de séquençage de l’ADN ultra long dont le poids moléculaire élevé (HMW) extraction de l’ADN des cellules fraîches ou congelées, construction de la bibliothèque de cisaillement mécanique ou une fragmentation de la transposase et le séquençage sur un périphérique nanopore. De 20 à 25 µg d’ADN HMW, la méthode peut atteindre N50 lire longueur de 50 à 70 KO avec le cisaillement mécanique et N50 de 90-100 kb lire la longueur avec la transposase médiée par fragmentation. Le protocole peut être appliqué à l’ADN extrait des cellules de mammifères pour effectuer le séquençage du génome entier pour la détection des variantes structurelles et assemblage de génome. Des améliorations supplémentaires sur l’extraction de l’ADN et les réactions enzymatiques vont encore augmenter la durée de lecture et élargir son utilité.

HMW ADN s’applique le protocole de séquençage ADN ultra long pour la construction de la bibliothèque. Par conséquent, il est essentiel de choisir les cellules bien cultivées avec un rapport direct &gt; 85 % à la cellule à l’étape de récolte. La quantité de cellules utilisée pour l’extraction d’ADN aura une incidence sur la qualité et la quantité de l’ADN de HMW. La lyse cellulaire ne fonctionne pas bien si commençant par trop de cellules. En utilisant des cellules trop peu ne génère pas suffisamment d’ADN pour la construction de la bibliothèque, car la précipitation de l’ADN HMW est effectuée à l’aide de rotation douce à la main au lieu de centrifugation à haute vitesse. Un exemple de l’ADN de HMW après que ajout glacé 100 % d’éthanol et la rotation sont montré comme le précipité blanc de coton-comme à la Figure 2.
Il est important de vérifier la qualité de l’ADN d’entrée avant de commencer la construction de la bibliothèque. Dégradation, quantification incorrecte, contamination (par exemple, protéines, ARN, détergents, tensioactifs et phénol résiduel ou éthanol) et faible poids moléculaire ADN peuvent avoir un effet significatif sur les procédures ultérieures et sur la finale lire la longueur. Nous recommandons de procéder de l’analyse QC à l’aide de l’ADN de trois endroits différents dans le tube contenant de l’ADN de HMW. De UV lecture des résultats de l’ADN de HMW, la valeur do260/OD280 est environ 1,9 et la valeur do260/OD230 est environ 2.3 (Figure 3 aB). Ces valeurs de ratio sont compatibles entre les trois tests pour un échantillon d’ADN de HMW bon. Différentes méthodes de cisaillement nécessite des volumes différents de l’ADN d’entrée. La concentration d’ADN de HMW doit être &gt; 200 ng/µL de cisaillement mécanique alors qu’il doit être &gt; 1 µg/µL de fragmentation de la transposase. La concentration détectée par un fluorimètre est un peu inférieure à UV lecture. Toutefois, le coefficient de variation de la concentration de l’échantillon d’ADN de HMW même devra être inférieur à 15 % avec le fluorimètre et le UV, lecture d’épreuves. Tonte mécanique s’applique une seringue avec une aiguille pour casser l’ADN HMW afin que le nombre de passes par l’intermédiaire de l’aiguille aura une incidence la taille de l’ADN cisaillé et lire de la finale de la longueur. Il est recommandé d’effectuer la taille QC après que aiguille tonte afin d’assurer la majorité de l’ADN de HMW est supérieure à 50 Ko comme illustré à la Figure 4. Dans la méthode de cisaillement mécanique, 30 passes a généré les meilleurs résultats de séquençage, compte tenu de la longueur et la sortie.
La N50 d’une bibliothèque de base cisaillement mécanique est 50-70 kb tandis qu’une transposase axée sur la fragmentation bibliothèque est de 90-100 Ko. Les résultats de quatre essais en utilisant la lignée cellulaire de HG00733 sont indiqués dans le tableau 1. Tous les quatre descentes ont plus 2 300 lectures avec une longueur de plus de 100 Ko. La longueur maximale est plus longue dans les transposase axée sur la fragmentation bibliothèques (455 Ko et 489ko) comparés avec les bibliothèques de base cisaillement mécaniques (348ko et 387 kb) alors que ce dernier produit plus de lectures totales, ce qui indique un rendement plus élevé. La construction de bibliothèque fragmentation transposase a moins de marches et de temps de préparation plus courte afin qu’elle introduira moins courts fragments. Les deux pistes à l’aide de la transposase ont une longueur moyenne supérieure (&gt; 30 Ko) et la durée médiane (&gt; 10 Ko). En outre, les données montrent une qualité élevée constante dans toutes les séries (score de qualité moyenne est environ 10,0, précision de base d’origine ~ 90 %). Plus de 97 % des bases totales étaient alignés au génome humain de référence (hg19) à l’aide de Minimap216 avec les paramètres par défaut. Les distributions de la taille attendue des lectures brutes sont indiquées à la Figure 5. Toutes les séries ont une grande partie des données dépassant les 50 Ko tandis que transposase axée sur la fragmentation des bibliothèques ont un ratio plus élevé de lectures ultra longues (p. ex. &gt; 100 Ko). Ce protocole a été appliqué avec succès dans plusieurs lignées de cellules humaines (complémentaires tableau 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig1.jpg"> Figure 1 : vue d’ensemble schématique du workflow nanopore séquençage long-read (NLR-seq). Orange, la transposase complexe. Jaune-vert, l’adaptateur nanopore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig2.jpg"> Figure 2 : précipitations d’ADN représentant de méthode d’extraction de phénol-chloroforme. La flèche blanche indique l’ADN HMW. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig3.jpg"> Figure 3 : résultats de QC de l’exemple de l’ADN de HMW de lecture UV. ADN de HMW (A) de l’étape 1.21.1 prêt pour la construction de la bibliothèque de base cisaillement mécanique. ADN de HMW (B) de l’étape 1.21.2 pour construction de bibliothèque axée sur la fragmentation de transposase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig4.jpg"> Figure 4 : résultats QC de l’aiguille cisaillement HMW ADN par électrophorèse sur gel en champ pulsé. L1 : Quick charge 1Ko échelle d’ADN ; L2 : Quick charge 1Ko étendre échelle d’ADN. 1-8 : ADN avec des temps de passage différents par le biais de la tonte de l’aiguille. 1-3, aucune tonte ; 4, 10 fois ; 5, 20 fois ; 6, 30 fois ; 7, 40 fois ; 8, 50 fois. Cette étape QC est facultative. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig5.jpg"> Figure 5 : prévu des distributions granulométriques des bibliothèques nanopore ADN ultra-longue. MS, bibliothèques de base cisaillement mécaniques. TF, transposase axée sur la fragmentation des bibliothèques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Shearing_rep1 mécanique</td>
			<td>Shearing_rep2 mécanique</td>
			<td>Transposase fragmentation_rep1</td>
			<td>Transposase fragmentation_rep2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lignée cellulaire</td>
			<td>HG00733</td>
			<td>HG00733</td>
			<td>HG00733</td>
			<td>HG00733</td>
		</tr>
<tr>
<td>N50 les lectures</td>
			<td>55 180</td>
			<td>63 007</td>
			<td>98 237</td>
			<td>95 629</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nombre de lectures plus de 100ko</td>
			<td>2 500</td>
			<td>3 082</td>
			<td>2 386</td>
			<td>2 355</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nombre de lit total</td>
			<td>97 859</td>
			<td>80 465</td>
			<td>24 166</td>
			<td>21 032</td>
		</tr>
<tr>
<td>Longueur maximale (bp)</td>
			<td>348 482</td>
			<td>387 113</td>
			<td>454 660</td>
			<td>489 426</td>
		</tr>
<tr>
<td>Longueur moyenne (bp)</td>
			<td>17 861</td>
			<td>20 395</td>
			<td>33 528</td>
			<td>38 175</td>
		</tr>
<tr>
<td>Durée médiane (bp)</td>
			<td>5 335</td>
			<td>5 894</td>
			<td>10 249</td>
			<td>15 656</td>
		</tr>
<tr>
<td>Qualité moyenne des lectures</td>
			<td>10.0</td>
			<td>10.1</td>
			<td>9,9</td>
			<td>10.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totales bases de lectures brutes</td>
			<td>1,747,849,822</td>
			<td>1,641,058,932</td>
			<td>810,229,733</td>
			<td>802,886,304</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totales bases alignées lectures</td>
			<td>1,693,300,832</td>
			<td>1,607,975,925</td>
			<td>791,422,077</td>
			<td>778,417,627</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mappés ratio du totales bases (hg19, Minimap2)</td>
			<td>96,9 %</td>
			<td>98,0 %</td>
			<td>97,7 %</td>
			<td>97,0 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nombre de pores actives</td>
			<td>1225 : 480, 402, 254, 89</td>
			<td>1058 : 480, 356, 176, 46</td>
			<td>958 : 452, 328, 148, 30</td>
			<td>1092 : 487, 367, 195, 43</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Sommaire des indicateurs de Performance fonctionne avec différents protocoles de cisaillement.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Bibliothèque 1</td>
			<td>Bibliothèque 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lignée cellulaire</td>
			<td>K562</td>
			<td>GM19240</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cellule Information de commande</td>
			<td>ATCC, cat. Lol CCL-243</td>
			<td>Coriell Institute, cat. Lol GM19240</td>
		</tr>
<tr>
<td>Protocole</td>
			<td>tonte mécanique</td>
			<td>tonte mécanique</td>
		</tr>
<tr>
<td>N50 les lectures</td>
			<td>60 063</td>
			<td>55 295</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nombre de lit total</td>
			<td>193 783</td>
			<td>120 807</td>
		</tr>
<tr>
<td>Durée médiane (bp)</td>
			<td>1 843</td>
			<td>4 688</td>
		</tr>
<tr>
<td>Longueur moyenne (bp)</td>
			<td>9 825</td>
			<td>17 408</td>
		</tr>
<tr>
<td>Longueur maximale (bp)</td>
			<td>548 780</td>
			<td>212 338</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totales bases de lectures brutes</td>
			<td>1,903,989,686</td>
			<td>2,103,015,331</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totales bases alignées lectures</td>
			<td>1,837,350,047</td>
			<td>1,997,419,761</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mappés ratio du totales bases (hg19, Minimap2)</td>
			<td>96,6 %</td>
			<td>95,0 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nombre de pores actives</td>
			<td>1111 : 482, 371, 203, 55</td>
			<td>1032 : 447, 333, 196, 56</td>
		</tr>
</tbody></table>Supplémentaire tableau 1 : Résumé de deux courses de NLR-seq en utilisant d’autres lignées cellulaires avec le protocole de cisaillement mécanique.

Long-lire des séquences facilitent considérablement l’assemblage des génomes complexes et caractérisation de variation structurale. Les auteurs décrivent une méthode pour générer des séquences ultra longues de plateformes de séquençage nanopore-basé. L’approche adopte une extraction d’ADN optimisée suivie de préparations de bibliothèque modifiée pour générer des centaines de kilobases se lit avec une couverture modérée à partir des cellules humaines.

Séquençage de l’ultra longue lecture pour l’analyse de l’ADN génomique ensemble

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

Ce protocole comble une lacune technique dans notre capacité à générer des tableaux de séquences ultra-longs. Il nous permet d’examiner la complexité du génome qui est limitée par les approches actuelles à courte lecture en génomique. La méthode est unique en termes de performances, de robustesse, de polyvalence et de potentiel d’intégration à de nouvelles applications prometteuses.Il s’applique à différents matériaux et peut être modulé pour différentes tailles instantanées. Cette technique a commencé à révolutionner le paysage clinique. Son utilité de diagnostic dans les désordres répétés d’expansion a surmonté beaucoup de lacunes actuelles.Certains registres de transplantation ont utilisé le dactylographie HLA haute résolution pour de meilleurs résultats cliniques. Ces méthodes fournissent des informations à longue portée auparavant inaccessibles telles que l’élimination progressive et la variance structurale complexe. Couplé à la lecture épigénétique en un seul test, il permettra la médecine de précision.C’est un long protocole avec beaucoup de nouvelles techniques et il est difficile de savoir si cela fonctionne jusqu’au séquençage final. Je recommande de pratiquer le chargement sur les vieilles cellules d’écoulement avant d’exécuter des échantillons. Les collaborateurs ont dit que certaines techniques sont déroutantes par rapport aux approches à courte lecture.Plus précisément, l’extraction est plus douce en raison de la haute qualité, l’ADN de poids moléculaire élevé. Pour commencer l’extraction de l’ADN HMW, ajoutez d’abord 200 microlitres de la suspension cellulaire à 10 millilitres de tampon de lyse dans un tube de 50 millilitres. Puis, vortex à la vitesse la plus élevée pendant trois secondes.Et incuber la solution à 37 degrés Celsius pendant une heure. À la fin de l’incubation, ajouter deux microlitres de RNS-A au lysate. Faites pivoter doucement le tube de 50 millilitres pour mélanger l’échantillon et incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure.Après l’incubation, ajouter 10 millilitres de la couche phénol du mélange d’alcool phénol-chloroforme-isoamyle au lysate. Et mettre le tube sur un rotateur à 20 rpm pendant 10 minutes sous un capot de fumée. Après centrifugation avec des tubes de gel, versez soigneusement le supernatant dans un nouveau tube de 50 millilitres.Ajouter ensuite 25 millilitres d’éthanol glacé à 100 % et faire pivoter doucement le tube à la main, jusqu’à ce que l’ADN se précipite. Pliez une pointe de 20 microlitres pour faire un crochet. À l’aide du crochet, retirer soigneusement l’ADN hmw et laisser tomber le liquide.Ensuite, placez l’ADN dans un tube de 50 millilitres contenant 40 millilitres de 70% d’éthanol, et inversez doucement le tube trois fois pour laver l’ADN. Pour préparer la bibliothèque mécanique à base de cisaillement, utilisez d’abord une seringue sans aiguille de 100 millilitres pour aspirer tout l’ADN. Ensuite, mettez une aiguille de calibre 27 sur la seringue et éjectez tout l’ADN dans le plat doucement et lentement.Répéter 29 fois. Ensuite, ajoutez 143 microlitres des perles magnétiques re-suspendues et 143 microlitres du mélange de réaction de réparation d’ADN à un tube. Feuilletez le tube six fois pour mélanger doucement, et mettez le tube sur un rotateur à 20 rpm pendant 30 minutes.Centrifugez le tube à 1000G pendant deux secondes à température ambiante pour faire tourner l’échantillon, puis placez le tube sur une grille magnétique pendant 10 minutes. Ensuite, jetez le supernatant pendant que le tube est encore sur la grille. Ajouter 400 microlitres de l’éthanol fraîchement préparé à 70 %.Attendez 30 secondes. Et puis enlever l’éthanol. Ensuite, centrifugez le tube à 1000G pendant deux secondes à température ambiante pour faire tourner l’échantillon.Remettre le tube sur la grille magnétique et retirer tout éthanol résiduel. Sécher à l’air le granulé pendant 30 secondes. Ensuite, retirez le tube de la grille magnétique et ajoutez 103 microlitres de tampon T-E.Ensuite, faites glisser doucement le tube pour vous assurer que les perles sont couvertes dans le tampon et placez le tube sur le rotateur à température ambiante pendant 30 minutes. Enfin, remettre le tube sur la grille magnétique pendant 10 minutes pour pelleter les perles. Utilisez une pointe de forage large P200 pour transférer 100 microlitres de l’allongement à un tube de 0,2 millilitre, et procéder à la réparation finale dA-tailing et adaptateur réactions ligature.Pour préparer la bibliothèque à base de fragmentation de la transposase, faites d’abord une réaction de tagmentation de l’ADN en ajoutant 22 microlitres de l’ADN HMW, un microlitre de Triss de 10 millimolaires, pH 8, avec 0,02% Triton X-100, et 1 microlitre du mélange de fragmentation, à un tube de 0,2 millilitre. Ensuite, utilisez une pointe d’alésage de large P200 pour mélanger la réaction six fois, et incuber à 30 degrés Celsius pendant une minute, suivie de 80 degrés Celsius pendant une minute. Tenez-vous à quatre degrés Celsius.Enfin, utilisez une pointe d’alésage large P200 pour transférer la réaction à un tube de 1,5 millilitre et ajouter rapidement 1 microlitre de mélange adaptateur rapide. Utilisez une pointe d’alésage de large P200 pour mélanger la réaction six fois. Incuber la réaction à température ambiante pendant une heure et procéder au séquençage.Pour commencer le séquençage, insérez d’abord une nouvelle cellule d’écoulement dans l’un des canaux de l’appareil Nanopore. Ensuite, sur le logiciel de contrôle de séquençage qui l’accompagne, cochez la case de localisation de la cellule d’écoulement. Sélectionnez le bon type de cellule d’écoulement et cliquez sur le flux de travail de la cellule de contrôle.Cliquez sur le bouton de test de démarrage pour démarrer l’analyse qc cellule d’écoulement. Ensuite, avec une pipette P1000 réglée sur 100 microlitres, retirez moins de 30 microlitres de tampon pour éliminer les bulles de la cellule d’écoulement. Ajouter 30 microlitres du mélange d’amorçage pour couvrir le dessus du port d’amorçage pour éviter d’introduire des bulles.Ensuite, pipette 800 microlitres du mélange d’amorçage dans le port d’amorçage pour charger la cellule d’écoulement. Sortez la pointe lorsqu’il reste environ 50 microlitres du mélange d’amorçage et ajoutez le reste du mélange d’amorçage sur le dessus du port d’amorçage. Ensuite, avec une pipette P1000, ajouter 200 microlitres du mélange d’amorçage dans la cellule d’écoulement.Puis, juste avant le chargement, utilisez une pipette P200 réglée sur 80 microlitres pour monter et descendre la bibliothèque d’ADN six fois. Enfin, chargez le mélange de bibliothèque dans la cellule d’écoulement à travers le port de l’échantillon, et procédez au séquençage et à l’analyse des données. L’analyse qc de l’ADN prêt pour la construction mécanique de bibliothèque à base de cisaillement a eu comme conséquence le rapport de pureté de 260 à 280 d’approximativement 1.9, et le rapport 260 à 230 d’approximativement 2.3, montrant un bon échantillon d’ADN.Le même résultat a été observé à l’aide de la construction de bibliothèques à fragmentation prêtes à être transposées par l’ADN. Le contrôle de qualité de taille de l’ADN de HMW aiguille-cisaillé par l’électrophoresis de gel de champ d’impulsion a prouvé que la majorité de l’ADN de HMW était plus grand que 50 kilobases. Les résultats de quatre séries utilisant la cellule HG00733 ont montré que le N50 d’une bibliothèque mécanique à base de cisaillement était plus court qu’une bibliothèque à fragmentation de transposase.En outre, les quatre pistes avaient plus de 2300 lectures avec une longueur de plus de 100 kilobases. La longueur maximale était plus longue dans les bibliothèques à fragmentation de transposase avec son temps de préparation plus court, par rapport aux bibliothèques mécaniques à base de cisaillement. Les bibliothèques mécaniques à base de cisaillement ont produit des lectures plus totales par rapport aux bibliothèques à fragmentation de transposase, ce qui indique un rendement plus élevé.Les deux bibliothèques ont montré une qualité constante et plus de 97% de leurs bases totales ont été alignées avec le génome de référence humain. Les distributions de taille prévues ont montré que les quatre séries avaient une grande proportion de données supérieures à 50 kilobases, tandis que les bibliothèques à fragmentation de transposase avaient un ratio plus élevé de lectures ultra-longues. L’objectif global est de garder l’ADN intact, il est donc important d’éviter toute manipulation sévère de l’ADN.Un facteur clé qui peut maximiser la valeur de la méthode est l’analyse computationnelle. Notre équipe a mis au point un pipeline d’analyse à long terme appelé PICKY qui peut détecter une gamme complète de VUS à haute sensibilité. Il ouvrira de nouvelles voies à des domaines passionnants comme la détection de SVs complexes et les réarrangements et modifications progressives au niveau de la molécule unique.Cela améliorera considérablement notre compréhension de l’architecture du génome. Le phénol est très corrosif. Vous devez travailler avec elle dans une hotte de fumée avec de l’équipement de protection individuelle, y compris des gants, des lunettes de sécurité, un manteau de laboratoire, des pantalons longs et des chaussures.

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