Name: Isolement des tissus embryonnaires et la Formation des organes chimériques caille-poulet à l’aide de l’exemple du Thymus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Apprenez à isoler des tissus embryonnaires de caille et de poulet par microchirurgie et digestion enzymatique in vitro. Cette méthode permet d'étudier l'expression génique et de former des organes chimériques comme le thymus.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les auteurs sont reconnaissants à Isabel Alcobia pour la lecture critique du manuscrit, Mário Henriques de narration vidéo et Vitor Proa auprès du Service d’histologie de l’Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, pour le support technique. Nous sommes particulièrement redevables à Paulo Caeiro et Hugo Silva de l’Unidade de audiovisuais (unité de l’audiovisuel), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa pour leur engagement exceptionnel en faveur de la production de cette vidéo. Nous reconnaissons Leica Microsystems pour aimablement un stéréoscope équipé d’un système vidéo et de Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, S.A de contribuer avec caille fécondés. Ce travail a été soutenu par Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).

Toutes ces expériences suivent les soins aux animaux et les lignes directrices éthiques de la Centro Académico de Medicina de Lisboa.
1. fécondés d’incubation des oeufs de caille et poulet
<ol><li>Place fertilisé des oeufs de caille japonaise (Coturnix japonica coturnix) dans un incubateur humidifié à 38 ° C pendant 3 jours. Incuber les œufs (extrémité émoussée oeuf) vers le haut dans la chambre à air. Remarque : L’environnement humidifié est réalisé en plaçant un récipient d’eau au fond de la couveuse.</li>
	<li>Incuber les œufs fécondés de poulet (Gallus gallus) 2,5 jours dans un incubateur humidifié à 38 ° C. Incuber les œufs dans une position horizontale et marquer le dessus à l’aide d’un morceau de charbon de bois pour identifier l’emplacement de l’embryon. Remarque : Commencez par 40 œufs de caille et 60 oeufs de poule lors de l’établissement de cette expérience.</li>
</ol>2. isolement de l’endoderme caille contenant le domaine éventuel du rudiment du thymus
Remarque : Utiliser une hotte à flux laminaire horizontal et les instruments stérilisés et les matériaux pour les procédures de manipulation des oeufs dans des conditions stériles.
<ol><li>Supprimer la région embryonnaire contenant le territoire présomptif du rudiment du thymus, de la région arche pharyngienne contenant les 3rd et 4ème arches (3/4PAR), comme le décrit7,8.<ol>
<li>Remplir un bol en verre de borosilicate grand (100 x 50 mm ; 100 cm3) avec 60 mL de froide solution saline tamponnée au phosphate (PBS).</li>
		<li>Avec l’aide de ciseaux courbes, tap et couper un trou circulaire dans la coque d’une caille oeuf qui a été incubé pendant 3 jours. Faire le trou sur le côté opposé de le œuf émoussé et transférer le jaune (avec l’embryon) dans le bol avec du PBS froid.</li>
		<li>Retirer l’embryon du vitellus en coupant la membrane vitelline extérieurement aux vaisseaux extra embryonnaire à l’aide de ciseaux courbes.</li>
		<li>Transfert de l’embryon à un petit bol (60 x 30 mm ; 15 cm3) avec l’aide de pinces fines, rempli de 10 mL de PBS froid.</li>
		<li>Avec une écumoire, déplacer l’embryon à une boîte de pétri avec une base noire de 100 mm (voir Table des matières) contenant 10 mL de PBS froide et placez-le sous un stéréomicroscope.</li>
		<li>Disséquer le 3/4PAR, comme décrit précédemment8.</li>
		<li>Aspirer le 3/4PAR et les transférer dans un plat en verre trois quarts bac à froid à l’aide d’une pipette Pasteur stérile de 2 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isoler l’endoderme contenant le territoire présomptif du rudiment du thymus (l’endoderme 3/4PP) par digestion enzymatique avec pancréatine.<ol>
<li>Avec l’aide de la spatule et pince fine, transfert le 3/4PAR à un plat en verre trois quarts remplis de pancréatine froid (8 mg/mL ; dilution de 1:3 de 25 mg/mL avec du PBS froid).</li>
		<li>Incuber pendant 1 heure sur la glace pour la digestion enzymatique. NOTE : Le temps de digestion enzymatique dépend de la phase de développement (tableau 1).</li>
		<li>Placez le plat en verre sous le stéréomicroscope (grossissement de 40 x x-60) d’isoler l’endoderme de la 3/4PAR. NOTE : Gardez toutes les surfaces et les solutions de froid au cours de cette procédure. Changer pour une nouvelle solution de pancréatine froide si prenant beaucoup de temps à disséquer les tissus (> 15 min). Comme source d’illumination, utilisez des lumières LED incorporées dans le stéréomicroscope ou dans les fibres optiques, compte tenu de la charge de chaleur limitée.</li>
		<li>Pour isoler l’endoderme les tissus environnants, utilisez deux microscalpels inox porte-broche. Remarque : Utilisez microscalpels avec un diamètre compris entre 0,1 mm et 0. 2 mm et détenteurs de broche de nickel d’un diamètre d’ouverture de mâchoire de 0 mm à 1 mm.<ol>
<li>Commencez par retirer le tube neural et le mésoderme attaché à la face dorsale de l’endoderme pharyngien.</li>
			<li>Avec la face dorsale vers le haut, soigneusement détacher et enlever le mésenchyme entre les arcs pharyngiens et exposer les poches pharyngiennes. Exécutez cette procédure sur les deux côtés de la 3/4PAR.</li>
			<li>Enlever le tube de coeur et le mésenchyme entourant les sachets antérieurs.</li>
			<li>Avec la face ventrale vers le haut, coupez l’ectoderme de la 2ème et 3rd arcs pharyngiens et retirez avec précaution le mésenchyme attaché à ces sachets. Répétez cette procédure sur l’autre côté de la 3/4PAR. À ce stade, le rudiment de la thyroïde doit être visible.</li>
			<li>Supprimer toute cellules mésenchymateuses restants attachés à l’endoderme pharyngien avec les deux microscalpels.</li>
			<li>Faites une coupe transversale entre les 2ème et 3rd PP, en dissociant l’endoderme pharyngien contenant les 3rd et 4 sachets deth de la partie antérieure de l’endoderme ayant le rudiment de la thyroïde et 2nd pochette du pharynx.</li>
			<li>Avec l’aide de la spatule et pince fine, transfert l’endoderme 3/4PP isolé dans un plat en verre trois quarts remplis de 100 % froid sérum bovin fœtal (SVF).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Garder le plat en verre avec les tissus isolés sur la glace lors de la préparation du test in vitro. Sinon, les tissus isolés peuvent être conservées en trois dimensions et analysées in situ pour l’expression génique.</li>
</ol>3. isolement du mésoderme somatopleura poulet
Remarque : Effectuez des oeufs des procédures de manipulation en conditions stériles à l’aide d’une hotte à flux laminaire horizontal et les instruments stérilisés et les matériaux.
<ol><li>Retirez le territoire embryonnaire contenant le mésoderme somatopleura au niveau des somites 19-24 (ES19-24).<ol>
<li>Sortir l’oeuf de la poule de l’incubateur après 2,5 jours d’incubation.</li>
		<li>Avec des ciseaux courbes, ouvrez un petit trou dans la coque. Insérer une aiguille et aspirer 2 mL d’albumine avec une seringue de 10 mL pour diminuer le volume de l’albumine à l’intérieur de le œuf et de prévenir les dommages de l’embryon (situé au-dessous de la région marquée de la coquille). Jeter l’albumine aspiré.</li>
		<li>Couper une circulaire trou (jusqu'à deux-tiers de la surface supérieure) dans la région marquée de la coque à l’aide de ciseaux courbes.</li>
		<li>Couper la membrane vitelline extérieurement aux navires extra-embryonnaires tout en maintenant l’embryon avec une pince fine.</li>
		<li>Sous un stéréomicroscope, placer l’embryon dans une boîte de pétri de 100 mm avec une base noire contenant 10 mL de PBS froid. Remarque : Utilisez un stéréomicroscope à partir de ce moment pour un grossissement progressif des procédures de microchirurgie.</li>
		<li>Utilisez quatre broches insectes minces pour tenir l’embryon vers le bas de la plaque. Placer les goupilles dans la région extra-embryonnaires formant une forme carrée.</li>
		<li>Effectuer deux coupures entre les somites 19 et 24 transversalement à l’axe de l’embryon et traversant tout le territoire embryonnaire, à l’aide de ciseaux œil wecker.</li>
		<li>Libérer la section de l’embryon, ES19-24, par découpage des bords embryonnaires marginal.</li>
		<li>Aspirer l’ES19-24 tissus et le transfert à un plat en verre trois quarts bac à froid à l’aide d’une pipette Pasteur stérile de 2 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isoler le mésoderme latéral de la région de somatopleura (ES19-24) par digestion enzymatique avec pancréatine (8 mg/mL ; dilution de 1:3 de 25 mg/mL avec du PBS froid).<ol>
<li>Avec l’aide de la spatule et pince fine, transfert les tissus ES19-24 à un verre plat trois quarts remplis d’une solution froide pancréatine.</li>
		<li>Incuber pendant 30 minutes sur la glace pour la digestion enzymatique.</li>
		<li>Sous le stéréomicroscope, isoler le mésoderme les tissus environnants à l’aide de deux microscalpels dans un support. NOTE : Gardez toutes les surfaces et les solutions de froid au cours de cette procédure. Changer pour une nouvelle solution de pancréatine froide si prenant beaucoup de temps à disséquer les tissus (> 10 min.). Comme source d’illumination, utilisez des lumières LED incorporées dans le stéréomicroscope ou dans les fibres optiques, compte tenu de la charge de chaleur limitée.</li>
		<li>Lors de l’isolation du mésoderme, retirez d’abord l’ectoderme à la surface, suivie d’un détachement prudent des tissus splancnopleura situé sur le ventre.</li>
		<li>Libérer le mésoderme latéral droit de le somatopleura en le coupant dans un mouvement parallèle au tube neural.</li>
		<li>Répétez la séparation du mésoderme du côté gauche de l’embryon. Remarque : Faire ralentir les mouvements de microscalpel au cours de cette procédure. Les protéines de la matrice extracellulaire exposés collent aux instruments empêchant des mouvements fluides et les tissus.</li>
		<li>Avec l’aide de la spatule et pince fine transfert le mésoderme isolé dans un plat en verre trois quarts remplis de FBS froid.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Garder le plat en verre avec les tissus isolés sur la glace lors de la préparation du test in vitro.</li>
</ol>4. In vitro organotypique dosage : association hétérospécifique de cailles 3/4PP endoderme et mésoderme somatopleura poulet
<ol><li>Préparer le milieu de culture avec milieu RPMI-1640 additionné de 10 % de SVF et 1 % Pen/Strep3,5.</li>
	<li>Placer une grille métallique dans un 35 mm boîte de pétri avec 5 mL de milieu de culture. NOTE : Enlever l’excès de liquide pour niveler la surface moyenne au dessus de la grille.</li>
	<li>Avec l’aide de pinces fines, trempez une membrane filtrante dans le milieu de culture et puis placez-le sur le dessus de la grille pour avoir une surface de contact de l’air. Remarque : Un quart de la surface de la membrane (avec 13 mm de diamètre) est suffisant pour l’association de tissu.</li>
	<li>Sous le stéréomicroscope, associer les tissus isolés sur le dessus de la membrane filtrante. Tout d’abord transférer l’endoderme 3/4PP (étape 2) du verre plat en glissant doucement à l’aide d’une cuillère de transplantation (ou une spatule) et mince forceps. Répétez cette procédure pour le mésoderme isolé (étape 3). Remarque : Avec l’aide d’un microscalpel, mélanger les tissus afin de maximiser son association.</li>
	<li>Placer soigneusement les tissus associés dans un incubateur à 37 ° C, avec 5 % de CO2 à humidifié pour tissus cultivés de 48 h. peuvent être greffés sur la membrane Chorio-(CAM). NOTE : Formation des organes ectopique dans la came a été détaillé précédemment8.</li>
</ol>

<ol><li>Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nogent+Institute--50+years+of+embryology%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Nogent Institute--50 years of embryology.</a> The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).</li>
<li>Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+migration+of+neural+crest+cells+to+the+wall+of+the+digestive+tract+in+avian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).</li>
<li>Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+of+cells+of+the+avian+thymus+through+embryonic+life+in+interspecific+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras.</a> Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).</li>
<li>Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Bmp4+signalling+in+the+epithelial-mesenchymal+interactions+that+take+place+in+early+thymus+and+parathyroid+development+in+avian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos.</a> Developmental Biology. 361 (2), 208-219 (2012).</li>
<li>Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelio--mesenchymal+interactions+are+critical+for+Quox+7+expression+and+membrane+bone+differentiation+in+the+neural+crest+derived+mandibular+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">Epithelio--mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme.</a> Embo Journal. 10 (9), 2387-2393 (1991).</li>
<li>Figueiredo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+and+Hedgehog+in+the+thymus%2Fparathyroid+common+primordium%3A+Crosstalk+in+organ+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation.</a> Developmental Biology. 418 (2), 268-282 (2016).</li>
<li>Figueiredo, M., Neves, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+Approach+to+Explore+Early-and+Late-stages+of+Organ+Formation+in+the+Avian+Model%3A+The+Thymus+and+Parathyroid+Glands+Organogenesis+Paradigm+Video+Link%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualuzed+Experiments%22%5BJournal%5D)">Two-step Approach to Explore Early-and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm Video Link.</a> Journal of Visualuzed Experiments. , (2018).</li>
<li>Nehls, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+genetically+separable+steps+in+the+differentiation+of+thymic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium.</a> Science (New York, N.Y.). 272 (5263), 886-889 (1996).</li>
<li>Morahan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nu+gene+acts+cell-autonomously+and+is+required+for+differentiation+of+thymic+epithelial+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The nu gene acts cell-autonomously and is required for differentiation of thymic epithelial progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5742-5746 (1996).</li>
<li>Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiGeorge+syndrome+phenotype+in+mice+mutant+for+the+T-box+gene%2C+Tbx1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1.</a> Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).</li>
<li>Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Bmp4+from+the+Tbx1+expression+domain+causes+abnormal+pharyngeal+arch+artery+and+cardiac+outflow+tract+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling.</a> Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).</li>
<li>Zou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+of+the+third+pharyngeal+pouch+into+thymus%2Fparathyroid+by+Six+and+Eya1%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1.</a> Developmental Biology. 293 (2), 499-513 (2006).</li>
<li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+and+Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenetic and Genome Research. 117 (1-4), 231-239 (2007).</li>
<li>Nowak-sliwinska, P., Segura, T., Iruela-arispe, M. L., Angeles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+chorioallantoic+membrane+model+in+biology%2C+medicine+and+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering.</a> Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).</li>
<li>Uematsu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+in+ovo+chorioallantoic+membrane+engraftment+to+culture+testes+from+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Use of in ovo chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice.</a> Comparative Medicine. 64 (4), 264-269 (2014).</li>
<li>Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+a+human+organizer+by+combined+Wnt+and+Nodal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling.</a> Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La technique d’isolation de tissu embryonnaire détaillée ici a été améliorée depuis les précédentes techniques pour produire des embryons chimériques caille-poulet dans différents contextes biologique3,5,6.
Cette approche consiste d’isoler des tissus embryonnaires pures sans nécessiter de manipulation génétique ou l’utilisation de marqueurs spécifiques des tissus, qui sont souvent indéterminé, limitan...

Dans les années 1970, un système élégant caille-poulet chimère a été développé par Le Douarin, ouvrant de nouvelles pistes pour comprendre le rôle de la migration cellulaire et interactions cellulaires au cours du développement1,2. Le modèle a été conçu en partant du principe qu’échange de cellules entre les deux espèces ne perturberait pas significativement l’embryogenèse, confirmé plus tard lorsqu’il est utilisé pour étudier les nombreux processus de développement, y compris la formation du système nerveux et le hématopoïétique systèmes de1. Prendre ce dernier à titre d’exemple, les vagues cycliques de progéniteurs hématopoïétiques qui colonisent le rudiment épithélial thymique fut observée à l’aide de la chimère de la caille-poulet système3. Pour cela, le territoire prospectif du thymus, l’endoderme des troisième et quatrième du pharyngés sachets (3/4PP), a été isolé mécaniquement et enzymatiquement embryons de caille (q) de 15 à 30 - stade de segments [1,5-E2.5 jour embryonnaire (E)]. Ces trois phases correspondent au poulet Hamburger et Hamilton4 (HH) - étapes 12-17. Les procédures d’isolement a commencé avec l’utilisation de trypsine enzymatiquement dissocier l’endoderme du mésenchyme ci-joint. L’endoderme isolé a été greffé dans la région de somatopleura d’un embryon de poulet (c) hôte à E3-E3.5 (HH-étapes 20 et 21). Ce mésenchyme hétérologue était considéré comme « permissive » au développement de l’épithélium thymique contribuant également à l’orgue formation3. Par la suite, des vagues successives de cellules progénitrices véhiculés par le sang de poulet hôtes infiltré la caille donneur thymiques épithéliales homologue contribuant à la formation du thymus chez l’hôte embryon3.
Plus récemment, une version modifiée de cette approche s’est avérée aussi important pour étudier les interactions épithéliale-mésenchymateuse durant le début de la formation de thymus5. À cet égard, les tissus impliqués dans la formation du thymus ectopique dans les embryons chimères3 ont été isolés, tous deux provenant d’embryons de donneurs et hôte et associés ex vivo. Un protocole amélioré a permis d’isoler l’endoderme 3/4PP de caille (E2.5-E3) et le mésoderme somatopleura de poulet (E2.5-E3). Brièvement, les tissus embryonnaires ont été isolées par microchirurgie et sous réserve de la digestion in vitro pancréatine. Aussi, les conditions de la digestion enzymatique, température et temps d’incubation ont été optimisées selon les tissus-type et le stade de développement (tableau 1).
Ensuite, les tissus isolés étaient associés dans un organotypique système in vitro pendant 48 h, comme indiqué précédemment5,6. L’association in vitro de tissus imite les interactions cellulaires les dans l’embryon, de surmonter certaines restrictions de la manipulation in vivo. Ce système est particulièrement utile pour étudier les interactions cellulaires dans les événements morphogène complexes, comme le développement de l’appareil pharyngien.
La contribution de chacun des tissus dans l’histogenèse du thymus, ainsi que la capacité de l’association hétérospécifiques pour générer un thymus peut être davantage explorés en utilisant la méthodologie de CAM, précédemment détaillées5,7,8. Succinctement, les tissus cultivés ont été greffés sur la came d’embryons cE8 et laissés se développer en ovo pendant 10 jours. Ensuite, la formation du thymus a été évaluée par analyse morphologique dans les explants récoltés. Comme dans les études classiques de caille-poulet3, l’épithélium thymique caille a été colonisée par les cellules progénitrices hématopoïétiques (HPCs) provenant de l’embryon de poulet, qui s’est avéré plus tard contribuer à orgue développement9,10 . Les bactéries hétérotrophes ont migré de l’embryon vers le thymus chimérique ectopique à le fortement vascularisé CAM5,7,8. Caille épithélium thymique dérivée peut être identifié par immunohistochimie à l’aide d’anticorps spécifiques à l’espèce (c'est-à-dire, QCPN - MAb caille périnucléaire), surmontant le besoin de marqueurs moléculaires spécifiques des tissus.
Cette méthode expérimentale, comme l’approche en deux étapes dans la précédente publication8, permet la modulation des voies de signalisation par l’administration régulière d’agents pharmacologiques pendant in vitro et dans le développement d’ovo. En outre, des explants peuvent être récoltées en tout temps-point du cours de l’expérience de8.
Enfin, le protocole détaillé ici permet la préservation des propriétés naturelles et 3D-architecture des tissus embryonnaires, particulièrement utiles pour détailler les modèles d’expression génique in situ des territoires embryonnaires autrement inaccessibles par méthodes conventionnelles. En outre, transcriptome analysis approches, y compris les RNA-seq ou microarrays, peuvent également être appliquées dans les tissus isolés sans nécessiter de marqueurs génétiques tout en fournissant une analyse de « omiques » de tissu-spécifiques à haut débit.

<table><tbody><tr><td>Œufs de poule fécondés (Gallus gallus)</td><td>Pintobar, Portugal</td><td></td><td>Ferme avicole&nbsp ;</td></tr><tr><td>Oeufs de caille fécondés (Coturnix coturnix)</td><td>Interaves, Portugal</td><td></td><td>Ferme avicole&nbsp ;</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger en PP de 15 mL</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger en PP de 50 mL</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>Plats en pyrex de 60 x 20 mm</td><td>Groupe Duran</td><td>21 755 41</td><td></td></tr><tr><td>100 x 20 mm Plats en pyrex</td><td>du groupe Duran</td><td>21 755 48</td><td></td></tr><tr><td>Grille métallique</td><td>Goodfellows</td><td></td> à <td>mailles fines Grille en acier inoxydable</td></tr><tr><td>Filtre à membrane</td><td>Millipore</td><td>DTTP01300</td><td>0,6 mm Filtre à membrane isopore</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri, 35 x 10 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5112&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Bols en pyrex 60 x 30 mm (petite taille)</td><td></td><td></td><td>de supermarché&nbsp ;</td></tr><tr><td>Bols en pyrex 100 x 50 mm (Grande taille)</td><td></td><td></td><td>de supermarché&nbsp ;</td></tr><tr><td>Pipettes de transfert</td><td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td><td>2041S</td><td>Pipette en plastique 2 mL</td></tr><tr><td>Pipette pasteur en verre</td><td>Normax</td><td>5426015</td><td></td></tr><tr><td>Ruban</td><td></td><td></td> en plastique transparent <td>de supermarché&nbsp ;</td></tr><tr><td>Cytokératine (pan ; acide et basique, cytokératines de type I et II), clone Lu-5</td><td>BMA Biomedicals</td><td>T-1302</td><td></td></tr><tr><td>Fœtal Bovin Serum</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Standart FBS</td></tr><tr><td>Pancreatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3292</td><td>Préparer une solution à 25 mg/mL selon les instructions du fabricant ; centrifuger et filtrer avant l’aliquote et conserver à -20&ordm ;C. Les aliquotes peuvent être conservées congelées pendant plusieurs années.</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>QCPN Anticorps Études</td><td>de développement Hybridoma Bank</td><td>QCPN</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement&nbsp ;</td><td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td><td>61870010</td><td></td></tr><tr><td>Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit</td><td>ELKEM/Silmid</td><td>RH141001KG</td><td>Pour préparer la base dorsale de la boîte de Pétri</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30&nbsp ;</td><td>Pinces fines</td></tr><tr><td>Ciseaux Bonn extra-fins, incurvés</td><td>Fine Science Tools</td><td>14085-08</td><td>Ciseaux courbes</td></tr><tr><td>Épingles à insectes&nbsp ;</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-30</td><td>0,3 mm Goupille en acier inoxydable</td></tr><tr><td>Micro spatule&nbsp ;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10087-12</td><td>Cuillère de transplantation</td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Outils de science fine</td><td>26002-20</td><td>Microscalpel en acier inoxydable de 0,2 mm</td></tr><tr><td>Pins Minutien</td><td>Tools</td><td>26002-10</td><td>Microscalpel en acier inoxydable de 0,1 mm</td></tr><tr><td>Moria Porte-épingle nickelé</td><td>Outils de science fine</td><td>26016-12</td><td>Porte-épingle nickelé</td></tr><tr><td>Moria Cuillère perforée</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-17</td><td>Skimmer</td></tr><tr><td>Wecker Eye Scissor</td><td>Fine Science Tools</td><td>15010-11</td><td></td></tr><tr><td>Appareil photo</td><td>Leica Microsystems&nbsp ;</td><td>MC170 Microscope HD</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica Microsystems&nbsp ;</td><td>DM2500</td><td></td></tr><tr><td>NanoZoomer&nbsp ; S360 Numérique&nbsp ; scanner de diapositives&nbsp ;</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C13220-01</td><td></td></tr><tr><td>Stéréoscope</td><td>Leica Microsystems&nbsp ;</td><td>Leica M80</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement des tissus embryonnaires et la formation des organes chimériques caille-poulet à l’aide de l’exemple du thymus

Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example

La capacité d’isoler les tissus embryonnaires constituait une étape essentielle pour établir le système de caille-poulet chimère, qui à son tour a contribué incontesté au dévoilement des processus clés en biologie du développement.
Dans les présentes est décrit une méthode optimisée pour isoler des tissus embryonnaires de cailles et de poulets par la microchirurgie et la digestion enzymatique tout en conservant ses propriétés biologiques. Après l’isolement, les tissus de ces deux espèces sont associés lors d’un test in vitro organotypique pendant 48 h. caille et tissus de poulet peuvent être distinguées par caractéristiques nucléaires distinctes et des marqueurs moléculaires permettant l’étude de la diaphonie cellulaire entre hétérospécifiques association des tissus. Cette approche est donc un outil utile pour étudier les interactions de tissu complexe dans le processus de développement avec des modifications spatiales très dynamiques, telles que celles survenant au cours de la morphogénèse du pharynx et de la formation de l’intestin antérieur organes dérivés endoderme. Cette approche expérimentale a été développée afin d’étudier les interactions épithéliale-mésenchymateuse durant le début de la formation du thymus. À cet égard, l’endoderme dérivés de prospective rudiment thymique et dérivés mesoderm mésenchyme, ont été isolés des embryons de caille et de poulet, respectivement.
La capacité des tissus associés à produire des organes peut être analysée plus loin en leur greffant sur la membrane Chorio-(CAM) d’un embryon de poulet. La came fournit des nutriments et permet les échanges gazeux dans les tissus explantés. Après 10 jours de développement ovo, les organes chimériques peuvent être analysés dans les explants récoltés par les méthodes morphologiques classiques. Cette procédure permet également étudier des contributions spécifiques des tissus au cours de la formation des organes, de ses initial (développement in vitro) pour la phase finale de l’organogenèse (en développement ovo).
Enfin, la méthode d’isolation améliorée fournit également en trois dimensions (3D) préserver les tissus embryonnaires, qui peuvent également être utilisés pour une analyse topographique haute résolution des modèles d’expression génique spécifique aux tissus.

Le protocole décrit une méthode pour isoler les tissus embryonnaires aviaires pour être utilisé dans plusieurs approches de techniques de biologie cellulaire et du développement. Cette méthode a été précédemment employée pour étudier les interactions épithéliale-mésenchymateuse durant les premiers stades de formation de thymus5. Dans les présentes, nouveaux résultats sont indiqués dans la Figure 1 et Figure 2</stro...

Cet article fournit une méthode pour isoler les tissus embryonnaires pures de caille et poulet des embryons qui peuvent être combinés pour former ex vivo organes chimérique.

Isolement des tissus embryonnaires et la Formation des organes chimériques caille-poulet à l’aide de l’exemple du Thymus

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed ...

L’objectif global de cette procédure est de présenter une approche expérimentale optimisée pour isoler les tissus embryonnaires des embryons de caille et de poulet. Avec cette technique, nous obtenons des tissus embryonnaires purs qui peuvent être utilisés dans les études d’expression génétique et les analyses fonctionnelles. Les tissus des embryons de caille et de poulet sont isolés par microchirurgie et sujets à une digestion enzymatique in vitro tout en préservant ses propriétés biologiques.Après isolement, les tissus préservés tridimensionnels peuvent être utilisés pour l’analyse des modèles d’expression topographique à haute résolution des gènes. Cette approche est particulièrement utile pour détailler l’expression in situ des gènes dans les territoires embryonnaires autrement inaccessibles par les méthodes conventionnelles. En outre, les approches d’analyse transcriptome peuvent également être appliquées dans les tissus isolés sans nécessiter de marqueurs génétiques, tout en fournissant une analyse omique à haut débit spécifique aux tissus.Alternativement, les tissus isolés des deux espèces peuvent être associés dans un essai organotypique in vitro pendant 48 heures. Cette approche permet d’étudier les interactions tissulaires, puisque les cellules de caille et de poulet peuvent être discriminées par des caractéristiques nucléaires distinctes et des marqueurs moléculaires. La capacité des tissus de culture à former des organes peut être encore testée par assay ovo.Cette méthode est donc un outil utile pour étudier les interactions tissulaires complexes dans les processus de développement avec des modifications spaciales très dynamiques et peut également aider à révéler le potentiel de territoires embryonnaires spécifiques à la formation d’organes. À titre d’exemple, on décrit ci-après la formation du thymus chimérique caille-poulet à partir de tissus embryonnaires isolés. Tout d’abord, l’endoderm des troisième et quatrième poches pharyngéales, le rudiment thymique potentiel est isolé de la région pharyngéale des embryons de caille avec trois jours de développement.Ensuite, ce tissu est associé à un mésenchyme capable de soutenir son développement, le mésoderm somatopleura. Enfin, l’association hétérospécifique des tissus est cultivé in vitro et in ovo pour former un thymus chimérique. Effectuez toutes les procédures de manipulation des œufs dans des conditions stériles à l’aide d’une hotte d’écoulement laminaire horizontale et d’instruments et de matériaux stérilisés.Des oeufs fertilisés de caille ont été incubés avec la chambre d’air faisant face vers le haut. Pour commencer, retirer les œufs de caille de l’incubateur. Préparer un grand bol en verre borosilicate rempli de PBS froid.À l’aide de ciseaux incurvés, appuyez sur et coupez un trou circulaire dans la coquille d’un œuf de caille avec trois jours d’incubation. Faire le trou dans le côté opposé de l’œuf émoussé, et transférer le jaune dans le bol avec pbs froid. Retirer l’embryon du jaune en coupant la membrane vitelline à l’extérieur aux vaisseaux extraembryoniques.À l’aide de forceps minces, transférer l’embryon dans un petit bol rempli de PBS froid, puis déplacer l’embryon dans une boîte de Pétri à base noire avec un écumoire. Enlevez la région pharyngéale contenant les troisième et quatrième sachets pharyngéels comme décrit dans la ligature précédente de SPA de Jove. Ensuite, transférez la troisième et quatrième région de l’arc pharyngeal dans un verre rempli de pancréatine froide et incubez pendant une heure, sur la glace, pour une digestion enzymatique.Notez que la période d’incubation de la digestion enzymatique dépend du stade de développement. Placez le plat en verre sous le microscope stéréo et isolez l’endoderm de la troisième et quatrième région de l’arc pharyngeal, à l’aide de deux micro-scalpel dans un support. Placez d’abord la région pharyngéale avec le côté dorsal vers le haut, montrant intérieurement l’endoderm et l’ectoderm dans la surface externe.Observez l’ectoderm, l’endoderm, le mésenchyme, le tube cardiaque et la partie ventrale du tube neural. Retirez le tube neural et le mésoderm fixé à la surface dorsale de l’endoderm pharyngéal. Observez l’endoderm du pharynx, les quatrième et troisième poches pharyngéales, et le tube cardiaque.Avec le côté dorsal vers le haut, détachez soigneusement et enlevez le mesenchyme entre les arcs pharyngeal et exposez les poches pharyngeal. Effectuez cette procédure de l’autre côté de la région pharyngéale. Retirez le mesenchyme attaché à la partie la plus postérieure de l’endoderm et observez la quatrième poche pharyngéale.Avec le côté postérieur vers le haut, observez les poches pharyngeal de quatrième gauche et droite. Continuer en enlevant le mésenchyme attaché à la partie la plus postérieure de l’endoderm et à la deuxième poche. Retirer le tube cardiaque et le mesenchyme entourant les poches intérieures.Avec le côté ventral vers le haut, observez l’endoderm de pharynx, et le côté droit du deuxième arc pharyngeal. À ce stade, l’endoderm du rudiment thyroïdien doit être visible. Détachez l’ectoderme des deuxième et troisième arcs pharyngéels et retirez soigneusement le mésenchyme des arcs.Observez l’enlèvement du mesenchyme du deuxième arc pharyngeal sur le côté droit. Notez l’emplacement des quatrième et troisième poches et rudiment thyroïdien. Enlever les restes aux cellules mésenchymales attachées aux poches pharyngéales.Observez les troisième et quatrième pochettes du côté droit et la quatrième poche du côté gauche. Répétez le détachement mesenchyme du côté gauche. Observez maintenant la troisième poche du côté gauche.Observez le détachement mesenchyme de la deuxième arche sur le côté gauche. Notez que toutes les surfaces et solutions doivent être maintenues au froid pendant cette procédure. Passer à une nouvelle solution de pancréatine froide et plat en cas de prendre beaucoup de temps pour disséquer les tissus.Enfin, faire une coupe transversale entre la deuxième et la troisième poches pharyngéales pour enlever les deuxièmes poches et le rudiment thyroïdien. À ce stade, l’endoderm isolé est composé des troisième et quatrième poches pharyngéales et de la pointe postérieure du pharynx. Retirer les restes détachés mesenchyme à l’aide de deux micro-scalpels.Transférer l’endoderme isolé dans un plat en verre rempli de sérum bovin fœtal froid et le garder sur la glace pendant la préparation de l’essai in vitro. Les oeufs ont été placés en position horizontale et le côté supérieur marqué pour l’utilisation d’un charbon de bois. Pour commencer, retirer les œufs de l’incubateur.À l’aide d’un ciseaux incurvé, ouvrir un petit trou dans la coquille, insérer une aiguille et aspirer deux millilitres d’albumine à l’aide d’une seringue de 10 millilitres. Ouvrez un trou circulaire dans la région marquée de la coquille et coupez la membrane vitelline à l’extérieur aux vaisseaux embryonnaires supplémentaires tout en tenant l’embryon avec de minces forceps. Au microscope stéréo, placer l’embryon dans une boîte de Pétri avec une base noire contenant du PBS froid.Utilisez quatre broches à insectes pour maintenir l’embryon au fond de la plaque. Placez les broches dans la région extraembryonique formant une forme carrée. Effectuer deux coupures entre les somites 19 et 24 transversalement à l’axe embryonnaire et traverser l’embryon.Relâchez cette section en coupant les bords embryonnaires marginaux. Observez la plaque latérale, le tube neural et les somites. Aspirer et transférer les tissus dans un plat en verre rempli de pancréatine froide.Incuber pendant 30 minutes sur la glace pour une digestion enzymatique. Sous le microscope stéréo, isoler le mésoderm des tissus environnants à l’aide de deux micro-scalpels chez les détenteurs. Observez le mesoderm somatopleura, le splanchnopleura, le tube neural et l’ectoderm.Tout d’abord, retirez l’ectoderm à la surface. Observez le mesoderm somatopleura dissocié de l’ectoderme. Puis, détachez soigneusement le splanchnopleura ventrally situé de la somatopleura.Observez le mésoderm latéral droit de la somatopleura. Relâchez-le en le coupant dans un mouvement parallèle au tube neural. Notez que toutes les surfaces et solutions doivent être maintenues au froid pendant cette procédure.Passer à une nouvelle solution de pancréatine froide et plat en cas de prendre beaucoup de temps pour disséquer les tissus. Observez le mésoderm latéral gauche du somatopleura, des somites, du tube neural et de l’ectoderm. Répétez la libération mesoderm de ce côté.Faites des mouvements lents avec le micro-scalpel. Les protéines de matrice extracellulaires exposées se trouvent à travers les tissus et les instruments, empêchant les mouvements des fluides. Couper délicatement le somatopleura en mouvement parallèle au tube neural.Transférer le mésoderm isolé dans un plat en verre rempli de sérum bovin fœtal froid et le garder sur la glace pendant la préparation de l’analyse in vitro. Placer une grille en métal fine dans une boîte de Pétri et remplir de milieu de culture. Retirer les liquides excessifs pour niveler la surface moyenne avec le dessus de la grille.À l’aide de forceps minces, trempez un filtre membranaire dans le milieu de culture et placez-le soigneusement sur le dessus de la grille pour avoir une surface en contact avec elle. Sous le microscope stéréo, transférer l’endoderm isolé du plat en verre au filtre membranaire en glissant doucement à l’aide de spatules et de forceps minces. Répétez cette procédure pour le mésoderm isolé.À l’aide d’un micro-scalpel, mélanger les tissus pour maximiser son association. Placez soigneusement les tissus associés dans un incubateur humidifié à 37 degrés avec 5% de CO2 pendant 48 heures. Après la période d’incubation, greffer les tissus de culture sur la membrane de type coriolan et lui permettre de se développer en ovale pendant encore 10 jours pour compléter la formation d’organes comme décrit précédemment.Voici la méthode réticulaire qui permet d’utiliser l’isolement des tissus embryonnaires aviaires dans des approches expérimentales distinctes. À titre d’exemple, l’expression de gènes connus pour être impliqués dans la formation des poches pharyngéales a également été évaluée un endoderm isolé contenant les deuxième, troisième et quatrième sachets pharyngéels des embryons de poulet au troisième jour embryonnaire et demi par hybridation in situ de montage entier. L’expression de Sonic Hedgehog a été détectée dans l’endoderm du pharynx central et exclue des sachets, tandis que BMP7 a été exprimée dans l’endoderm des deuxième et troisième poches pharyngéales et exclue du pharynx central et de la quatrième poche pharyngéale.Les tissus isolés peuvent également être associés in vitro pendant 48 heures, greffer sur la membrane de type coriolan, et laisser se développer pendant encore 10 jours. Les explantations peuvent être analysées par histologie conventionnelle et immunohistochimie. Quelques résultats représentatifs de l’association de l’endoderm de caille des troisième et quatrième sachets pharyngeal avec le mesoderm de somatopleura de poulet sont les suivants-Greffes ont montré un thymus chimérique entièrement formé avec des cellules épithéliales thymiques dérivées de caille positives pour QCPN et cellules lymphoïdes de poulet.En outre, l’épithélium thymique positif de cytokeratin a montré des dispositifs morphologiques normaux, affichant une architecture réticulaire typique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les tissus embryonnaires de caille et de poulet qui peuvent être utilisés dans les études d’expression génétique et en formant des organes chimériques peuvent également aider à déchiffrer la complexité de la génétique des organes.

isolation-embryonic-tissues-formation-quail-chicken-chimeric-organs

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Dans ce papier nous présentons une méthode de transplantation de cellules souches humaines dans les différentes régions du système nerveux central de l'embryon de poulet. Ceci fournit...

La xénotransplantation de cellules souches humaines dans l&#39;embryon de poulet

Cet article décrit une technique de transplantation de tissus qui a été conçu pour tester les propriétés de signalisation et de structuration de la surface ectoderme céphalique au cours du développement cranio-facial.

Évaluation des propriétés de signalisation ectodermique épithéliums au cours du développement cranio-facial

Une approche pour l'analyse des migrations et le destin éventuel de cellules aviaires de la crête neurale chez la caille-poulet embryons chimériques est décrite. Cette méthode est une technique simple et directe pour le traçage des cellules de la crête neurale au cours de la migration et la différenciation qui seraient autrement difficiles à distinguer au sein d'un embryon de poulet non manipulée.

Analyse de la migration des crêtes neurales et la différenciation par la Croix-espèces transplantation

Cet article décrit une méthode pour générer des embryons chimériques qui sont conçus pour tester les contributions spécifiques à l'espèce de crête neurale et / ou d'autres tissus de développement cranio-facial.

Évaluation des contributions spécifiques aux espèces Vers développement cranio-facial Utilisation chimères caille-canard

Cet article fournit une approche de mise à jour du système classique caille-poulet chimère pour étudier la formation des organes, en combinant les nouvelles procédures expérimentales in vitro et in ovo .

Approche en deux étapes pour explorer et fin-début de la Formation des organes dans le modèle aviaire : le Thymus et des glandes parathyroïdes organogenèse paradigme

Nous présentons ici un organotypique cultivant protocole pour cultiver des organes embryonnaires de poulet in vitro. En utilisant cette méthode, le développement des tissus embryonnaires de poulet peut être étudié, tout en conservant un haut degré de contrôle sur le milieu de culture.

Méthode de Culture organotypique pour étudier le développement des tissus embryonnaires de poulet

Cet article décrit une technique de transplantation de tissus conçue pour tester les propriétés de signalisation et de structuration du cerveau antérieur basal au cours du développement craniofacial.

Création de chimères du cerveau antérieur aviaire pour évaluer le développement facial

Le présent protocole décrit une méthode simple pour isoler les préadipocytes du tissu adipeux dans les embryons de poulets de chair. Cette méthode permet l’isolement avec un rendement élevé, la culture primaire et la différenciation adipogénique des préadipocytes. La coloration à l’huile Red O et la coloration lipidique/ADN ont mesuré la capacité adipogénique des cellules isolées induites par des milieux de différenciation.

Isolement des préadipocytes à partir d’embryons de poussins de poulet de chair

Nous décrivons ici des protocoles pour trois types de cultures d’explants de peau embryonnaire aviaire qui peuvent être utilisés pour examiner les interactions tissulaires, le film timelapse d’imagerie 4D (3D plus temps), la perturbation globale ou locale de la fonction moléculaire et la caractérisation de la biologie des systèmes.

Utilisation d’explants de peau aviaire pour étudier la structuration et l’organogenèse des tissus

La technologie des microréseaux permet une mesure quantitative et un profilage de l’expression génique des transcrits à l’échelle du génome. Par conséquent, ce protocole fournit une procédure technique optimisée dans un réseau bovin bicolore fabriqué sur mesure à partir d’embryons de bovins du jour 7 pour démontrer la faisabilité de l’utilisation d’une faible quantité d’ARN total.

Transcriptome profilage des In-Vivo embryons de bovins pré-implantation à l'aide de deux couleurs Microarray Plate-forme

Apprenez à isoler des tissus embryonnaires de caille et de poulet par microchirurgie et digestion enzymatique in vitro. Cette méthode permet d'étudier l'expression génique et de former des organes chimériques comme le thymus.

Isolement des tissus embryonnaires et la Formation des organes chimériques caille-poulet à l’aide de l’exemple du Thymus

Explorer plus de vidéos